Rapid Kwantificering van Mitogen geïnduceerde blastogenesereactie in T-lymfocyten voor het vaststellen van Immuunmodulerende Drugs

Samenvatting

T-lymfocyt-mitogenese gaat gepaard met blastogene transformatie, waarna het celvolume groter wordt voordat celdeling plaatsvindt. Hier beschrijven we een methode om blastogenese in T-lymfocyten te kwantificeren met behulp van een geautomatiseerde celteller met de mogelijkheid om celdiameters te meten.

Samenvatting

Lymfocyt proliferatie in respons op antigene of mitogene stimulatie is een goed meetbaar fenomeen bruikbaar voor het testen immuunmodulerende (bijv immunosuppressieve of immunostimulerende) chemische verbindingen en biologische middelen. Een van de eerste stappen in mitogenese is vergroting cel of blastogenic transformatie, waarna het celvolume toeneemt vóór deling. Het is gewoonlijk detecteerbaar in de eerste paar uren van T-lymfocyt stimulatie. We beschrijven hier een snelle methode om blastogenese in T-lymfocyten geïsoleerd uit milten van muizen en humane perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMCs) te kwantificeren met behulp van een geautomatiseerde celteller. Verschillende gebruikelijke proliferatie assays voor het grootste deel zijn bewerkelijk en geven alleen de totale populatie effect dan individuele cellulaire effecten binnen een populatie. In tegenstelling, de gepresenteerde geautomatiseerde celtelinrichting assay biedt snelle, directe en nauwkeurige metingen van celdiameters die kunnen wordengebruikt voor het beoordelen van de effectiviteit van verschillende mitogenen en immunomodulerende geneesmiddelen in vitro.

Inleiding

T-lymfocyten zijn de primaire cellen die verantwoordelijk zijn voor adaptieve immuniteit in zoogdieren. Het is bekend dat ze reageren met specifieke antigene peptiden door MHC moleculen gepresenteerd op het oppervlak van antigeen presenterende cellen. Na activering van een verwante T-celreceptor (TCR), de cel vergroot in een proces genoemd blastogenic transformatie of blastogenese. Dit proces is detecteerbaar in de eerste ~ 6 uur na de stimulus wordt toegepast ^1. Tijdens blastogenesereactie, de omvang van de individuele T-cellen te verhogen 2- tot 4-voudig ^2-6. Lymfocyten beginnen te prolifereren in een proces genaamd klonale expansie, waarvan het doel is om zoveel mogelijk van de klonen antigeenspecifieke TCR-dragende cellen mogelijk te genereren. Het nageslacht cellen vervolgens oefenen hun immunologische functie door differentiëren in cytotoxische (CD8 ⁺⁾ of helper (CD4 ⁺⁾ effector T lymfocyten. Dus naïeve T lymfocyten in humane of muizen bloed in de G ₀ (rust) fase van de celcyclus en ondersteuning minimale metabolische activiteit. Bij blootstelling aan antigenen of mitogenen, T-cellen opnieuw invoeren van de celcyclus, met een gelijktijdige stimulatie van transcriptie en eiwitsynthese ^7-10. Mitogenen, zoals forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) en ionomycine de lymfocyten te stimuleren door de activering van proteïnekinase C (PKC) en Ca2 ⁺ afhankelijke signaleringsroutes ^1. De activering van T-cellen met PMA / ionomycine omzeilt het TCR signalering stappen.

In vitro proliferatie assays worden algemeen gebruikt voor de evaluatie lymfocytfunctie en de reactie op stimuli. Proliferatie metingen worden meestal één tot drie dagen na het begin van de T-cel stimulatie genomen en weerspiegelen de collectieve status van honderden of duizenden cellen. De potentie van verschillende mitogenen en immunomodulerende geneesmiddelen in vitro kan worden beoordeeld door simpelweg het meten proliferatiesnelheden in aanwezigheid van deze verbindingen. Waarvan enkele eenssays en hun beperkingen worden hieronder besproken.

Direct aantal cellen tellen, de procedure is tijdrovend, met een grote kans op bedieningsfouten.

Voor DNA-synthese, de 3H-thymidine meet DNA synthese, maar de belangrijkste beperking is de radiotoxiciteit. Een niet-radioactieve alternatief BrdU, maar de lineaire meetbereik voor de celgroei beperkt en behandeling antilichaam nodig, waardoor het aantal stappen in de procedure ^11,12 verhoogt.

Voor metabolische activiteit, tetrazoliumzouten (MTT, MTS, XTT, en WST-1) en resazurin kleurstof gebaseerde colorimetrische onderzoeken rapporteren de algemene metabolische toestand van delende celpopulaties. Echter MTT niet oplosbaar is in het kweekmedium, die extra wasstappen, waardoor waarin fouten in de meting; XTT moet extra componenten doeltreffend te verminderen; MTS-, WST-1- en-resazurin metingen zijn invloeded door het kweekmedium pH en zijn componenten serum albumine of fenolrood ^13-16. Deze testen meten niet het werkelijke aantal levensvatbare cellen maar schat de gecombineerde enzymactiviteiten. Daarom is de proliferatiesnelheid niet nauwkeurig bepaald door metabolische assays vanwege de niet-lineaire correlatie tussen het aantal cellen en de kleurstof reductie ^12,17.

Voor het meten van ATP concentratie, T-cel-activatie geïnduceerde toenamen in ATP correleren met proliferatie. Echter, verhoging van intracellulair ATP is een van de eerste stappen van T-celactivering; vele stappen achter de werkelijke proliferatie ^17,18.

Kleurstof verdunningstest, CFSE fluorescerende kleurstof kleurt cellen door het covalent binden aan intracellulaire eiwitten. De kleurstof vertoont een proliferatie-afhankelijke afname in fluorescentie-intensiteit, die het aantal celdelingen kan volgen. Vanwege covalente eiwitmarkerend, de functies van dezeeiwitten kunnen worden aangetast. De kleurstof is giftig voor de cellen bij hogere concentraties. Bij lagere concentraties kleurstof echter de initiële fluorescentie intensiteit verlaagd, het verminderen van het aantal celdelingen die kunnen worden gevolgd. Bovendien, na merken met CFSE, bestaat er een veelvoud onafhankelijk ~ 50% verlies van de initiële fluorescentie gedurende de eerste 24 tot 48 uur periode, waarin het dynamische bereik van de assay beperkt ^19,20.

De meeste van deze testen geven de collectieve status van grote aantallen cellen en vereisen de behandeling van de cellen met fluorescerende kleurstoffen. Necrotische en apoptotische cellen kunnen ook bijdragen aan deze metingen, tenzij uit de analyse verwijderd door kleuring met chemicaliën of antilichamen.

Lymfocyt blastogenesereactie kan worden beoordeeld door verschillende methoden, zoals optische microscopie of flowcytometrie ^4,21,22. We beschrijven hier een snelle methode voor het meten van T-cel-afmetingen met eenn geautomatiseerde celgetalmeter met real-time mobiele beelden die zijn opgeslagen en kunnen opnieuw geanalyseerd later verzamelt. Naast omvangmetingen, dit apparaat biedt precieze aantal cellen en het percentage levensvatbare cellen, zoals bepaald door trypan blauwe kleuring exclusie. De inrichting die in dit protocol is commercieel verkrijgbaar, en de fabrikant getest de precisie van het instrument met drie verschillende instrumenten en verschillende concentratie en levensvatbaarheid controles. De resultaten van deze onderzoeken werd een variatiecoëfficiënt dat was algemeen beneden 6%. Zoals vermeld in het protocol, wordt het apparaat geijkt op een regelmatige basis met 6 urn en 8 urn diameter polystyreen korrels. De voordelen van een celteller te maken tussen rustende T-cellen en T lymfoblasten gebaseerd op celdiameter is het gebruiksgemak en de geautomatiseerde aard van de analyse. De software kan een cirkel rond elke cel en het berekenen van de celdiameter. Bovendien, de imleeftijden zijn toegankelijk voor de operator, die de nauwkeurigheid van het instrument het identificeren van de cellen en correct een cirkel omheen kan controleren. In termen van beperkingen, kan het instrument niet per se onderscheid tussen puin en cellen; Daarom is het belangrijk dat de gebruiker beschouwt elk beeld als het wordt verwerkt. Er is een mogelijkheid voor het opnemen van luchtbellen, waarbij het aantal bruikbare gebied voor analyse zal afnemen; Dit is echter zeldzaam wanneer de periodieke spoeling onderhoud wordt uitgevoerd.

In deze studie, groepen milt T-lymfocyten werden gestimuleerd met ionomycine en toenemende concentraties PMA voor 12-48 uur. PMA concentratie van slechts 2 ng / ml induceerde zowel een robuuste respons blastogenic en significante proliferatie. Metingen van de effecten van verschillende geneesmiddelen, zoals immunosuppressiva cyclosporine A (CsA), FK506 (tacrolimus) en rapamycine (sirolimus), alsmede ionkanaal blokkers TRAM-34 en FTY720 (fingolimod), op blastogenesereactie aangetoond goed overeen met gerapporteerde effecten op de proliferatie. De blastogenic van humane PBMCs met PMA / ionomycine en muizen T-cel stimulatie met anti-CD3 en anti-CD28-antilichaam beklede magnetische korrels werden ook gemeten.

De celgetalmeter assay kwantificeert zowel blastogenese en de proliferatiesnelheid (celdichtheid) gelijktijdig maar afzonderlijk, anders dan de bovengenoemde methoden die kijken naar een combinatie van deze effecten. De gepresenteerde protocol geeft een snelle en robuuste techniek voor het evalueren van de sterkte van mitogene en immuunmodulerende middelen.

Protocol

Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen door de Wright State University Lab Animal Care en gebruik Comite en Institutional Review Board goedgekeurd uitgevoerd.

OPMERKING: Menselijke PBMC's worden geïsoleerd door Ficoll dichtheidsgradiënt centrifugatie methode ^5.

1. Spleen Harvest

1. Huis volwassen vrouwelijke ICR-muizen in standaard laboratoriumomstandigheden met voedsel, water en beddengoed specifiek voor de soort vereisten.
   OPMERKING: dieren hadden een gemiddelde leeftijd van 2,9 maanden en een gemiddeld gewicht van 30,4 g op het tijdstip van de euthanasie.
2. Op de datum van isolatie (DOI), euthanaseren van de dieren individueel zonder andere soortgenoten aanwezige dieren. Alles in het werk om een ​​minimale belasting ervoor te zorgen dat de muis. Euthanaseren het gebruik _van CO ₂ met secundaire breken van de nek tot de dood te verzekeren.
   1. Plaats het dier nog in de overdracht kooi, in de CO ₂ kamer en start de gasstroom bij 5 l / min. Deze stroomsnelheid verdringt zuurstof bij de aanbevolen 10-30% per min.
   2. Nadat het dier bewusteloos is, verhoging van de CO ₂ debiet tot 15 l / min. Controleer het dier ademstilstand en laten in de kamer gedurende nog 2 min.
   3. Solliciteer cervicale dislocatie met afleiding kracht om de dood te verzekeren.
3. Oogst de milt van het dier met behulp van aseptische techniek binnen 10 minuten van de dood.
   1. Steriliseren twee reeksen schaar en forceps voor het verwijderen van de milt in een autoclaaf oven voor gebruik. Steriliseer de dissectie oppervlak door toepassing 70% ethanol.
   2. Toepassen 70% ethanol om de muis buik. Met behulp van een set van de schaar en pincet, maak een snede in de vacht en de huid van de linker kant van de buik, en trek uit elkaar en schil de rug van de huid om het buikvlies te onthullen. Eenmaal blootgesteld, gelden 4% chloorhexidine-oplossing voor het openen van het buikvlies.
   3. Met behulp van de tweede set van scissors en pincet, maak een 2 tot 3 cm gesneden langs de centrale buik. Open het buikvlies en verwijder de milt door het wegsnijden van viscerale bijlagen en overtollig vet. Plaats de milt in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS).

2. Voorbereiding van de Raw Splenocyten

OPMERKING: Voer alle stappen onder een laminaire stroming bioveiligheid kast met behulp van aseptische techniek.

1. Week de geoogste milten in 10 ml gedeïoniseerd steriel H ₂ O 5 min in een 10 cm kweekschaal tot het oppervlak erytrocyten te lyseren.
   OPMERKING: Deze stap kan worden overgeslagen als de milt tijdens isolement werd beschadigd.
2. Om de splenocyten los, verpletteren de milt tussen twee gesteriliseerde glasplaatjes (matte kant van de milt) over een nieuwe 10 cm cultuur schotel. Mengen met 10 ml RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine, 50 IU / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine (hierna genoemd eens compleet RPMI).
3. Filter de cellen door een steriele 40 um nylon cel zeef in een nieuwe 10 cm cultuur schotel op het bindweefsel en vuil te verwijderen.
4. Lyse de resterende erythrocyten door toevoeging van 20 ml RBC lysisbuffer bestaande uit 155 mM _NH4CI, 10 mM NaHCO ₃ en 0,1 mM EDTA bij pH 7,4 en ~ 300 mOsm / L.
   OPMERKING: osmolaliteit gemeten met een vriespunt of dampdrukosmometer.
   1. Breng de cellen van de 10-cm plaat een 50 ml conische buis en centrifugeer bij 250 xg gedurende 10 min (4 ° C).
   2. Verwijder het supernatant, voeg 20 ml RBC lysis buffer en resuspendeer de gepelleteerde cellen door pipetteren.
   3. Incubeer bij kamertemperatuur in lysisbuffer gedurende 10 minuten onder voorzichtig schommelen.
   4. Centrifugeer gedurende 10 min bij 250 xg (4 ° C) om de cellen te pelleteren. Giet het lysisbuffer.
   5. Resuspendeer cellen in 10 ml compleet RPMI en centrifugeer weer (250 x g, 10 min, 4 ° C). SchijfArd de bovenstaande vloeistof.
5. Resuspendeer de splenocyten in 2 ml compleet RPMI verwarmd tot 37 ° C voor overdracht naar de kolom nylon wol vezels.

3. Zuivering van T lymfocyten

1. Was de nylonwol kolommen tweemaal met 5 ml compleet RPMI. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO ₂ celkweek incubator gedurende 1 uur.
   Opmerking: Het is noodzakelijk om de nylon wol nat gedurende de duur van het experiment te houden en te gebruiken volledig RPMI verwarmd tot 37 ° C voor nylon wol isolatiestappen.
2. Voeg geïsoleerde splenocyten aan de kolom en incubeer gedurende 1 uur om de B-cellen, fibroblasten en hulpcellen te houden aan de nylon wol.
   1. Voeg 2 ml RPMI dat de splenocyten in de kolom en passeren tot de bovenkant van de nylon wol wordt bereikt.
   2. Voeg 2 ml compleet RPMI verwarmd tot 37 ° C boven de nylon wol en passeren het medium door de woltotdat het vloeistofniveau bereikt het bovenoppervlak.
   3. Voeg 3 ml warm compleet RPMI de kolom volledig te bedekken de nylon wol.
   4. Incubeer de gevulde kolom ongestoord in een 37 ° C, 5% CO ₂ celkweek incubator gedurende 1 uur.
3. Elueer de cellen door wassen van de kolom tweemaal met 5 ml compleet RPMI. Voer een aanvullend wassen van de geëlueerde cellen door centrifugatie.
   1. Vul de kolom boven 2 maal met compleet RPMI en laat de oplossing in de kolom te laten stromen in een 50 ml steriele conische buis.
      LET OP: Vermijd te tikken of stoten de kolom, die de B-cellen, accessoire cellen en fibroblasten die vastzit aan de nylon wol kunnen verjagen.
   2. Verzamel de doorstroomfractie en centrifugeren bij 250 g gedurende 10 minuten (4 ° C) om de cellen te pelleteren. Was eenmaal met 10 ml compleet RPMI. Pellet de cellen opnieuw (250 x g, 10 min, 4 ° C) en resuspendeer in 2 ml compleet RPMI.
   3. Meet de c ell dichtheid met behulp van een hemocytometer en verdund in volledige RPMI tot 0,5 x 10 ⁶ cellen / ml.
   4. Seed 1 of 2 ml aliquots van de cellen in elk putje van een 24- of 6-well celcultuur plaat, respectievelijk, en de cellen te kweken bij 37 ° C met 5% _CO2.
      Opmerking: 1 mM 1,4-dithiothreitol (DTT) kunnen aan elk putje worden toegevoegd in dit stadium T-celoverleving verbeteren.
   5. Optioneel: Bevestig de efficiëntie van de isolatie protocol met flowcytometrie. Dit protocol levert normaal ~ 80% T-lymfocyten ^23.
      LET OP: Nylon-wol gezuiverde cellen bevatten ongeveer 50% CD4 ⁺ en 23% CD8 ⁺ cellen. Het verder zuiveren van de CD4 + en CD8 + subpopulaties, kan een immunomagnetische depletie stap worden uitgevoerd met behulp van acht antilichamen en magnetische korrels ^24. Alternatief kan zuiverder CD4 ⁺ en CD8 ⁺ T-celpopulaties worden geïsoleerd door positieve of negatieve selectie met specifieke antilichamen.

_title "> 4. Activering van T-lymfocyten en experimentele Drug Exposure

1. Activeren van T-lymfocyten binnen 24 uur van isolatie door de toevoeging van PMA en ionomycine calciumzout of magnetische bolletjes gecoat met anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen ^23,25,26. Voeg experimentele geneesmiddelen (bijvoorbeeld CsA, FK506, rapamycine, tram 34 en FTY720) op het moment van activering.
   OPMERKING: Hier PMA varieerden 2-250 ng / ml en de concentratie ionomycine werd bij 250 nM gehouden. Indien mogelijk moet verdunningen worden bereid uit voorraad hoeveelheden van elk geneesmiddel, zodat het volume toegevoegd aan elk putje van cellen ≥1 pl reproduceerbaarheid te garanderen. Het anti-CD3 / anti-CD28-beklede magnetische parels worden toegevoegd in een 1: 1 korrel tot cel verhouding. Verhoging van het aantal korrels per cel (dat wil zeggen, de korrel tot cel verhouding) zal de intensiteit van de stimulatie ^25,26 verhogen. De korrels worden gewassen en opnieuw gesuspendeerd in volledig RPMI voordat de toevoeging aan de cellen. Merk op dat trypanblauw kleurt de kralen.
2. Kweken van de cellen gedurende 12-72 uur bij 37 ° C met 5% CO ₂ voor het analyseren van de geautomatiseerde celteller.

5. Automated Cell Collection Tellergegevens

1. Voordat u het monster, zorg ervoor dat de cellen voorzichtig worden gemengd met een serologische pipet om klonten te voorkomen. Dit is vooral belangrijk voor geactiveerde lymfocyten vanwege hun kleverigheid.
   1. Voor kweken die geactiveerd met anti-CD3 / CD28 beads na pipetteren, overbrengen van het monster naar een 1,5 ml of 2 ml centrifugebuis. Scheid de kralen door het houden van de buis op een magneet voor 1-2 minuten. Gebruik het supernatant dat de cellen voor analyse.
      OPMERKING: Analyseer zowel rustende en geactiveerde cellen binnen 1 uur om eventuele pre-activering van rustende cellen door serum aanwezig in het kweekmedium. Na 12 uur PMA / ionomycine stimulatie, een kleine toename in celgrootte werd gedetecteerd (Figuur 2 ). Bij 72 uur, geen significante celgrootte stijging ten opzichte van 48 uur werd waargenomen (gegevens niet getoond).
2. Breng 1 ml van de celsuspensie in een monsterhouder en voer het door de geautomatiseerde celteller volgens de instructies in de handleiding.
   Opmerking: Voor elk van de proeven dient minimaal 1 ml (maximaal 2 ml) van de celkweek gebruikt worden. De geautomatiseerde celgetalmeter gebruikt een spuit trypan blauw mengen met de celsuspensie en geeft de mobiele trypan blue mengsel over een gebied dat wordt afgebeeld en geanalyseerd door de software. De software detecteert trypan blue-gekleurde cellen, tekent een cirkel rond elke cel, en bepaalt de diameter. 100 foto's worden verzameld uit elk monster, en de levensvatbaarheid van de cellen en maten worden bepaald. De drempelwaarde van de celtelinrichting hier gebruikt heeft een ondergrens van 5 urn.
3. Gegevensoverdracht van elke rit naar een spreadsheet voor verdere analyse.
4. Kalibreer het apparaat regelmatig met een 1ml monster van 6 urn en 8 urn diameter polystyreen korrels.
   OPMERKING: De feitelijke korrelgroottes gemeten door de fabrikant voor elke partij te gebruiken, niet de nominale maat. 6 en 8 urn kralen zijn handig omdat deze diameters dicht bij de verwachte diameters van rustende en geactiveerde T-cellen (zie figuur 1).

6. gegevens en statistische analyse

1. Analyseer de gegevens met behulp van geschikte statistische en grafische software.
   LET OP: De spreadsheet voor elke run bevat het aantal cellen met elk een diameter (bereik: 5 pm tot 70 pm). De cellen boven een 17 urn diameter verwijderd uit de analyse stofdeeltjes en kleine bellen, dat kan worden gelezen als levensvatbare cellen door het instrument te sluiten.
2. Voer hypothese te testen met behulp van Welch t-test voor data sets met ongelijke variantie; Resultaten worden als statistisch significant als p <0,001. De formule werd gebruikt,
   
   
   waar en zijn voorbeelden van middelen, en zijn steekproefvarianties, en en zijn steekproefomvang voor elke dataset. Het aantal vrijheidsgraden wordt conservatief geschat met behulp van de kleinste van de twee steekproefomvang voor elke vergelijking. Staafgrafieken worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM.

7. milt T-lymfocyt proliferatie assay

1. Meet T-celproliferatie met een MTS- of MTT-gebaseerde colorimetrische plaatlezer proliferatietest.
   OPMERKING: De test is basisd MTS tetrazolium verbinding (Owen's reagens) reductie oplosbare formazanproduct, waarschijnlijk door NADPH of NADH geproduceerd in metabolisch actieve cellen door dehydrogenase-enzymen.
2. Aantal gezuiverde T-cellen met een hemocytometer en resuspendeer ze in volledig RPMI-1640 in een uiteindelijke dichtheid van 1 x 10 ⁶ cellen / ml.
   Opmerking: 1 mM DTT kan worden toegevoegd aan de cellen in dit stadium.
3. Activeer de cellen met PMA en ionomycine met testgeneesmiddelen, indien nodig en meng voorzichtig (zoals in stap 4).
4. Plaat 100 ul van de cellen in elke well van een 96-well celcultuur behandeld plaat en incubeer bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 48 uur. Voeg 100 ul RPMI-1640 medium zonder cellen in een putje van een lezing van de achtergrondabsorptie te verkrijgen.
5. Voeg 20 pl MTS gebaseerde reagens aan elk putje en incubeer bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 4 uur.
6. Neem absorptiemetingen bij 490 nm met behulp van een plaat lezer. De Absorbance metingen overeenkomen met het aantal metabolisch actieve cellen in elk putje.
   OPMERKING: Trek achtergrond niveaus indien nodig. De achtergrondabsorptie zijn afhankelijk van het type kweekmedium, serum, externe pH en duur van MTS reagens blootstelling aan licht. MTS-gebaseerde reagentia zijn lichtgevoelig en blootstelling aan licht gedurende enkele uren kan resulteren in hogere absorptiewaarden achtergrond.

Resultaten

We gebruikten deze test om lymfocyten blast vorming vergelijken tijdens stimulatie met PMA, een forbolester en ionomycine, een calciumionofoor. Figuur 1A toont de frequentieverdeling van diameters van rustende en geactiveerde farmacologisch milt T-cellen. Behandeling van cellen met PMA / ionomycine gedurende ~ 2 dagen resulteerde in een significante verschuiving in de mediaan van de verdeling naar steeds grotere diameters (zie bijvoorbeeld referentie ^4). Het aantal cellen met kleinere diameter is verlaagd. Om vast te stellen dat onze apparaat meldde de juiste diameters, voerden we twee kalibraties met polystyreen kralen van 6 urn en 8 urn diameters (zie Materials tabel). Figuren 1B en 1C tonen lezingen uit geactiveerde T-cellen bovenop met een 8 urn standaard en rustende T-cellen bovenop met een 6 um standaard. Figuur1D toont de controle kraal maten door de fabrikant gemeld uitgezet tegen de mediane diameters gemeten met onze geautomatiseerde cel tegen te gaan. Het bleek dat de 6 pm maten licht overschat in onze metingen, waarschijnlijk door de meting drempel van het instrument met een ondergrens van 5 urn. De standaarddeviatie van de kraal diameters berekend uit de celtelinrichting metingen was in overeenstemming met de standaarddeviatie door de fabrikant beschreven. We concluderen uit deze experimenten dat dit apparaat betrouwbaar kan worden om rust en mitogeen gestimuleerde muizen T-cel-afmetingen te vergelijken en dat de inrichting nauwkeurig kan meten de werkelijke cel diameters.

We gingen vervolgens naar de afhankelijkheid van de gemiddelde toename diameter op PMA concentratie te testen en vond dat, tegen een vaste ionomycine concentratie van 250 Nm, de PMA effect was niet significant veranderd door het opvoeren van de concentratie from 2-250 ng / ml (Figuur 2A). Met de MTS-gebaseerde test, maten we T- celproliferatie bij 50 en 250 ng / ml PMA en vond geen merkbaar verschil (figuur 2C), in overeenstemming met onze celdiameter data. De calcineurine remmers cyclosporine A (300 nm) en FK506 (1 nM) onderdrukt zowel blastogenesereactie (Figuur 2B) en proliferatie (figuur 2C). Remming was niet compleet in beide gevallen echter. Metingen uitgevoerd 12 uur na PMA / ionomycine Daarnaast toonde een 7,2% en 6,8% toename van diameter 50 ng / ml en 250 ng / ml PMA, respectievelijk (figuur 2D). Grootte toeneemt bij beide concentraties waren niet significant verschillend, zoals bij 48 uur stimulatie (vergelijk figuur 2A) was.

De celdiameter verzameld van rustende en geactiveerde T-cellen na 48 uur PMA / ionomycine stimulatie samengevat in Tabel 1. De gemiddelde oppervlakte en het volume van rustende ICR muizen milt T cellen 151,4 urn ² en 1,9 x 10 ^-4 nl respectievelijk. De gemiddelde oppervlakte en het volume van geactiveerde T-cellen werden 300,6 urn ² en 5,9 x 10 ^-4 nl respectievelijk. De gemiddelde stijging diameter voor geactiveerde cellen was 40,92% (Tabel 1).

We testten ook andere chemische verbindingen gemeld immunosuppressieve te zijn: CsA, FK506, rapamycine, FTY720, en TRAM-34. In figuur 3, celgrootte meetresultaten van rustende en geactiveerde T-cellen in de afwezigheid en aanwezigheid van deze geneesmiddelen weergegeven. CsA en FK506, die de calcineurine-afhankelijke nucleaire factor van geactiveerde T-cellen (NFAT) ^27,28 targeten, waren de meest potente, remmen de blastogenic reactie met bijna 72% (Figuur 3A en 3B). Interessant, metPMA verhoogde concentraties, de potentie van CsA en FK506 daalde licht, hoewel werd geen bijkomende toename celdiameter in afwezigheid van deze geneesmiddelen (Figuur 2A en 2B). Rapamycine, een immunosuppressivum dat zoogdieren doelwit van rapamycine (mTOR) ^29,30 remt, had een matige maar statistisch significant effect (Figuur 3A, 3B en 3C). FTY720 is een sphingosine 1-fosfaat-receptor agonist die lymfocyt uitgang remt in omloop ³¹ en werd onlangs gevonden om TRPM7, een kation kanaal sterk tot expressie gebracht in T-lymfocyten ³² remmen. Zowel FTY720 en rapamycine was een vergelijkbaar effect op blastogenesereactie, af zal nemen van het gemiddelde van een stijging van 52% in diameter tot ongeveer 34% (Figuur 3A en 3B). TRAM-34 is een blocker van de calcium-geactiveerde kaliumkanaal KCa3.1 ^33. Getest bij 700 nm, TRAM-34 niet effectief was in muizen T-cellen, in Volgens een recente menselijke T-celproliferatie studie; de potentie kan afhangen van de aard en de sterkte van mitogene stimulatie ³⁴ (figuur 3A en 3B). 700 nM TRAM-34 was effectief in het blokkeren KCa3.1 kanalen in onze patch clamp elektrofysiologie experimenten (gegevens niet getoond). Deze vergelijking werd gemaakt tussen rust en drug-blootgestelde cellen in meerdere studies binnen hetzelfde experiment op 48 uur. Wanneer rapamycine en CsA werden samen gebruikt, blastogenesereactie werd volledig geremd (figuur 3C).

Activatie van muizen T-cellen met anti-CD3 / anti-CD28-beklede magnetische korrels gedurende 72 uur leverde een 27% toename in de gemiddelde diameter, die in aanwezigheid van CsA (figuur 3D) werd verlaagd tot 5%. Menselijke mononucleaire cellen na PMA / ionomycine activatie gedurende 48 uur in diameter vergroot met 33%, en activering in aanwezigheid van CsA daalde de respons tot 23% ( Figuur 4).

Figuur 1: frequentieverdelingen milt van muizen T-cel diameters. (A) Zwarte kolommen geven rust en rode kolommen geven PMA / ionomycine-geactiveerde (48 uur) cellen. (B) Uitkeringen van geactiveerde milt T-cellen bovenop een 8 urn deeltjesgrootte kalibratie standaard. (C) Uitkeringen van rustende T-cellen bovenop een 6 micrometer kalibratiestandaard. Het aantal cellen en kralen gebruikt worden in de vakken. (D) Mediane diameter gemeten door de celgetalmeter uitgezet tegen de pareldiameter door de fabrikant beschreven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

binnen-page = "1">
Figuur 2: Afhankelijkheid van muizen T-celactivering op PMA concentratie. (A) Gemiddelde diameters van T-cellen ofwel onbehandeld of behandeld met 2, 50 en 250 ng / ml PMA een vaste concentratie ionomycine (250 nM). (B) Celgetalmeter metingen van rustende en geactiveerde (2, 50, 250 ng / ml PMA) T cellen in de afwezigheid en aanwezigheid van 300 nM CsA of FK506 1 nM. (C) MTS proliferatie assay bij 50 en 250 ng / ml PMA met 250 nM ionomycine in afwezigheid en aanwezigheid van 300 nM CsA. Significante verschillen (p <0,001) zijn aangeduid met sterretjes. n het totale aantal pogingen. Gegevens zijn uit cellen geïsoleerd uit 3 muizen. (D) Cell diameters van rustende en geactiveerde T-cellen (250 ng / ml PMA en ionomycine 250 nM) 12 uur na activering in de afwezigheid en aanwezigheid van 300 nM CsA. Pbelasting / 55212 / 55212fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Effecten van CsA, FK506, FTY720, rapamycine en TRAM-34 op celgrootte. (A en C) Gemiddelde diameters van rust en PMA / ionomycine-geactiveerde muriene T-cellen in de afwezigheid en aanwezigheid van geneesmiddelen. Concentraties worden weergegeven in het vak. (B) De gegevens van A uitgedrukt als de procentuele stijging ten opzichte van de rustende T-cel diameter. Lymfocytactivering werd uitgevoerd met 250 ng / ml PMA en ionomycine 250 nM, en de metingen werden genomen na 48 uur. (D) Celgetalmeter metingen van rust en anti-CD3 / CD28 geactiveerde T-cellen, 72 uur na activering in de afwezigheid en aanwezigheid van 300 nM CsA.rge.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: blastogenesereactie in menselijke PBMCs op mitogeen stimulatie. (A) Zwarte kolommen geven rust en rode kolommen geven geactiveerde PBMC. (B) Gemiddelde diameters van rustende en geactiveerde PBMC in de afwezigheid en aanwezigheid van 300 nM CsA. Cellen werden geactiveerd met 250 ng / ml PMA en ionomycine 250 nM, en de metingen werden genomen na 48 uur activering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

kolom1	Rusten	geactiveerde	100 nM CsA	200 nM CsA
gemiddelde Diameter	6.94 pm	9.78 pm	8.19 pm	7.92 pm
Gemiddelde stijging van de Diameter		40,92%	17.88%	14.09%
Gemiddelde oppervlakte	151,37 μm²	300,61 μm²	210,56 μm²	197,22 μm²
Gemiddeld vergroting van de oppervlakte		98,59%	39.00%	30.16%

Tabel 1: Samenvatting van de gemiddelde cel diameter en relatieve toename in oppervlak. Metingen werden uitgevoerd 48 uur na activering met 250 ng / ml PMA en ionomycine 250 nM.

Discussie

We beschrijven een techniek voor de snelle detectie en kwantificering van T-cel blastogenic omzetting door middel van een geautomatiseerde celteller. Onder onze omstandigheden (250 ng / ml PMA en ionomycine 250 nM stimulatie), werd het celoppervlak verhoogd tweevoudige en drievoudige volume na 48 uur activering. De test is gevoelig genoeg is om stralen gedurende de eerste 12 h activatie waarbij het celvolume nam slechts 1,25-voudige van de rust (figuur 2D). Een fysiologisch relevant mechanisme van T-cel activatie met behulp van anti-CD3 en anti-CD28-antilichaam gecoate magnetische korrels een significante blastogenic respons, met gemiddeld 2,3-voudige toename in volume (72 uur na activatie Figuur 3D). Menselijke mononucleaire cellen vertoonde een 2,6-voudige verandering in volume bij PMA / ionomycine stimulatie gedurende 48 uur (Figuur 4). De ICR muis milt T-cellen een gemiddelde diameter en het volume werd bepaald te zijn6,9 micrometer en 1,9 x 10 ^-4 nl, respectievelijk. Menselijke PBMC's (van een gezonde donor) had een gemiddelde diameter van 7,7 urn en een gemiddeld volume van 2,7 x 10 ^-4 nl. Met dit protocol, testten we ook toenemende concentraties van PMA op hun vermogen om T cellen te activeren. Deze eencellige resultaten waren consistent met proliferatie assays uitgevoerd bij vergelijkbare concentraties PMA.

Verscheidene verbindingen gemeld aan celproliferatie beïnvloeden werden getest: FTY720 ^31,32; de immunosuppressiva cyclosporine A, FK506 en rapamycine ^27,28; en TRAM-34, een blocker van calcium geactiveerde KCa3.1 kanalen ^33,35. We vonden dat, bij de geteste concentraties, de meest potente remmers van blastogenese waren CsA en FK506. Rapamycine had een kleinere maar statistisch significant onderdrukkend effect op blastogenese. Tram 34, anderzijds, geen invloed blastogenese.

CsA onderdrukt zowel blastogenese en proliferation, maar niet volledig (figuur 2B en 2C), waaruit blijkt dat geautomatiseerde celgetalmeter meting een goede correlatie geneesmiddel efficiëntie in T-celproliferatie. In aanwezigheid van rapamycine met CsA, blastogenesereactie werd volledig geremd, wat suggereert dat NFAT- en mTOR-gemedieerde paden in combinatie volledig kan verklaren T-cel uitbreiding op mitogene stimulatie met PMA / ionomycine (figuur 3C).

Het dynamisch bereik van enkele proliferatieassays wordt beperkt (zie figuur 2). Proliferatie assays, zoals degene die we hebben gebruikt (figuur 2C), rapporteren een signaal dat bijdragen van apoptotische en necrotische cellen omvat. Geautomatiseerde verandering diameter metingen hebben geen die beperking, als de metingen betrekking hebben op enige levensvatbare cellen. Cellevensvatbaarheid wordt bepaald door de uitsluiting van trypan blauwe vlek van gezonde, levensvatbare cellen. In grootte metingen met behulp van forwardlichtverstrooiing in flowcytometrie doublet cel discriminatie kan problematisch ²² zijn. In de geautomatiseerde celtelinrichting metingen werd geen doublet populatie gevonden (figuur 1). Ook de meting was voldoende nauwkeurig onderscheid te maken tussen de effecten van 100 en 200 nM cyclosporine (Tabel 1) en blastogenesereactie detecteren binnen 12 h mitogene stimulatie (Figuur 2D).

Deze nieuwe test is bijzonder nuttig voor kleine aantallen monsters. Maximaal 15 monsters kunnen worden gemeten in 1 uur. De test heeft zijn beperkingen, waarvan de meeste worden verminderd. Hoewel het effectief kleine (<1 micrometer) verschil kan oplossen in cel diameter, de machine model gebruikten we een lagere detectiegrens van 5 micrometer. Deze limiet kan overschatting van zeer kleine celgroottes veroorzaken, omdat het effectief met kleinere diameters sluit alle cellen. Echter, de nieuwere modellen van de cel teller hebben detectie dorsenjarigen van ~ 2 micrometer, die dit probleem zou verminderen. Als er te veel puin in de steekproef, het instrument behandelt ze als levensvatbare cellen. Daarnaast kunnen luchtbellen af ​​en toe in de stroom cel en verstoring van de cel beelden die door de machine veroorzaken. De vervorming lijkt niet de levensvatbaarheid bepaling beïnvloeden, maar de opstelling kan de gemeten diameters. Derhalve wordt aanbevolen dat alle beelden worden gecontroleerd door de experimentator luchtbellen voordat de gegevens van elk onderzoek voor analyse worden geaccepteerd. Aangezien de software alleen baseert cirkels rond de cellen kunnen diameters van niet-bolvormige cellen scheefgetrokken naar de lange as zijn, waardoor de test minder geschikt voor niet-bolvormige cellen.

Deze test is snel en duurt ongeveer 4 min per monster vergeleken met proliferatie assays, die enkele uren vereisen. Het verzamelen van gegevens is ook vrij eenvoudig met behulp van de software die bij het apparaat. De software kan meetgegevens exporteren naar een spreadsheet voor analyse. Tenslotte is een eencellige, in tegenstelling tot een populatie, meet; zowel blastogenesereactie en proliferatie worden gemeten; en het onderscheid tussen levensvatbare en dode cellen tegelijk. Het kan worden gebruikt om verschillende muizenstammen evalueren op hun vermogen om een ​​immuunrespons. De test kan ook met succes worden gebruikt voor de meting van blastogenese in T-cellen van humane donoren (figuur 4), en het kan ook worden gebruikt in andere celtypen.

Celvolume verhogingen gekend dat de regulering van het metabolisme: cel zwelling stimuleert glutamine-geïnduceerde glycogeensynthese en lipogenese in hepatocyten ^36,37. Neutrofielen tonen migratie geassocieerd volume stijgt van 35-60%, terwijl de chemotactische agenten induceren 10-15% zwelling ^38-40. De huidige test kan eventueel worden gebruikt om deze processen te bestuderen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RPMI-1640	Lonza	BW12-702F
40 μm nylon cell strainers	Thermo Fisher Scientific	22363547
nylon wool fiber columns	Polysciences, Inc.	21759-1
50 ml conical tubes	The Lab Depot	TLD431697
6-well cell culture treated plates	USA Scientific	CC7682-7506
96-well cell culture treated plates	Thermo Fisher Scientific	130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher BioReagents	BP231-100
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay	Promega	G3582	MTS gebaseerde test
Cyclosporine A	Sigma-Aldrich	30024
FK506	Cayman Chemical Company	104987-11-3
Rapamycin	Santa Cruz Biotechnology	sc-3504
TRAM-34	Sigma-Aldrich	T6700
FTY720	Sigma-Aldrich	SML0700
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28	Gibco	11456D
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Acros Organics	356150010
Ionomycin calcium salt	Sigma-Aldrich	I0634
Penicillin-Streptomycin	MP Biomedicals	ICN1670049	100x stock
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)	HyClone	SH30378.02	10x stock
1,4-dithiothreitol (DTT)	Research Products International	12/3/3483	reducerend middel
8 µm micro particle size standard	Sigma-Aldrich	84192-5ML-F	Actueel  8.02 µm
6 µm micro particle size standard	Sigma-Aldrich	89756-5ML-F	Actueel 6.084 µm
Single magnetic separation stand voor 1,5 - 2 ml buis	V&P Scientific, Inc.	VP772F5
Cell culture incubator	Forma Scientific	3110
Synergy H1 hybrid reader	Bio Tek	BTH1M
Vi-CELL cell viability analyzer	Beckman Coulter	731050