An-aptameergebaseerde Sensor voor Unchelated Gadolinium (III)

Samenvatting

Het gebruik van polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) moleculen voor het detecteren van ongecheleerd gadolinium(III) ion in een waterige oplossing wordt beschreven. De aanwezigheid van het ion wordt gedetecteerd via een toename in de fluorescentie-emissie van de sensor.

Samenvatting

Een methode voor het bepalen van de aanwezigheid van niet-gecheleerd trivalent gadolinium-ion (Gd³⁺) in waterige oplossing wordt gedemonstreerd. Gd³⁺ is vaak aanwezig in monsters van op gadolinium gebaseerde contrastmiddelen als gevolg van onvolledige reacties tussen de ligand en het ion, of als een dissociatieproduct. Aangezien het ion giftig is, is de detectie ervan van cruciaal belang. Hierin worden het ontwerp en het gebruik van een aptamer-gebaseerde sensor (Gd-sensor) voor Gd³⁺ beschreven. De sensor produceert een verandering in fluorescentie als reactie op toenemende concentraties van het ion en heeft een detectielimiet in het nanomolaire bereik (~100 nM met een signaal-ruisverhouding van 3). De test kan worden uitgevoerd in een waterige buffer bij omgevings-pH (~7 - 7,4) in een 384-wells microplaat. De sensor is relatief ongevoelig voor andere fysiologisch relevante metaalionen zoals natrium, kalium en calciumionen, hoewel het niet specifiek is voor Gd³⁺ boven andere trivalente lanthaniden zoals europium(III) en terbium(III). Niettemin worden de lanthaniden niet vaak gevonden in contrastmiddelen of in biologische systemen, en de sensor kan daarom worden gebruikt om selectief niet-gecheleerd Gd³⁺ in waterige omstandigheden te bepalen.

Inleiding

Het toenemende belang van magnetic resonance imaging (MRI) in klinische diagnose, die wordt begrensd door de inherente gevoeligheid van de techniek heeft geleid tot de snelle groei van het onderzoek naar de ontwikkeling van nieuwe gadolinium gebaseerde contrastmiddelen (GBCAs) ^1. GBCAs zijn moleculen die worden toegediend om de beeldkwaliteit te verbeteren, en zij hebben meestal de chemische structuur van een trivalent ion gadolinium (Gd ³⁺⁾ gecoördineerd aan een meertandige ligand. Dit complexatie is van cruciaal belang als unchelated Gd ³⁺ is giftig; Het is betrokken bij de ontwikkeling van nefrogene systemische fibrose bij sommige patiënten met nierziekte of mislukking ^2. Bijgevolg, het detecteren van de waterige vrije ion is behulpzaam bij het waarborgen van de veiligheid van GBCAs. De aanwezigheid van unchelated Gd ³⁺ in GBCA oplossingen vaak het gevolg van een onvolledige reactie tussen het ligand en de ionen dissociatie van het complex, of displacement door andere biologische metaalkationen ^3.

Onder de verschillende technieken die momenteel gebruikt om de aanwezigheid van Gd ^3+, die berusten op chromatografie en / of spectrometrie hoogste rang qua veelzijdigheid en toepasbaarheid ^4. Onder hun sterke punten zijn hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid, de mogelijkheid om verschillende matrices (inclusief humaan serum ^5, urine en haren ^{6, 7} afvalwater en contrastmiddel formuleringen ⁸⁾ en de gelijktijdige kwantificering van meervoudige Gd ³⁺ complexen een bedrijf ervan ( van studies voorafgaand aan 2013 wordt beschreven in een algehele herziening van Telgmann et al.) ^4. Het enige nadeel is dat een aantal van deze methoden vereisen instrumentatie (bijvoorbeeld inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie) ⁴ dat sommige laboratoria geen toegang kunnen krijgen. In het kader van nieuwe GBCA ontdekking in het onderzoek en de proof-of-concept niveau, arelatively gemakkelijker, sneller en kosteneffectieve spectroscopische gebaseerde methode (zoals UV-Vis absorptie of fluorescentie) kan dienen als een waardevol alternatief. Met deze toepassingen in het achterhoofd, een fluorescent-aptameergebaseerde sensor voor waterige Gd ³⁺ werd ontwikkeld ^9.

De aptameer (Gd-aptameer) is een 44-base lange enkelstrengs DNA-molecuul met een specifieke sequentie van basen die werd geïsoleerd door het proces van systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) ^9. De aptameer te vormen tot een fluorescerende sensor, wordt een fluorofoor aan het 5'-uiteinde van de streng, die vervolgens gehybridiseerd met een quenching streng (QS) via 13 complementaire basen (figuur 1) bevestigd. Het QS is gelabeld met een donkere quenchermolecuul op de 3 'terminus. Aangezien Gd ^3+, de sensor (Gd-sensor), bestaande uit een 1: 2 respectievelijk molverhouding van Gd-aptameer en QS, zal een minimale fluorescentie-emissie als gevolg to energieoverdracht van de fluorofoor naar de onderdrukker. De toevoeging van waterig Gd ³⁺ zal de QS verplaatsen van de Gd-aptameer, resulterend in een toename in fluorescentie-emissie.

Figuur 1. De sensor (Gd-sensor), die bestaat uit de 44-voet lange aptameer (Gd-aptameer) getagged met fluoresceïne (een fluorofoor) en de 13-voet lange blussen streng (QS) getagged met DABCYL (een donkere quencher) . Aangezien unchelated Gd3 ⁺ de fluorescentie van de sensor is minimaal. Onder toevoeging van Gd ^3+, verplaatsing van de QS optreedt en een toename in fluorescentie-emissie waargenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Er is op dit moment, een veelgebruikte-spectroscopische methode voor het detecterening waterige Gd ^3+. Deze test maakt gebruik van het molecuul xylenol oranje, die een verschuiving van de maximale absorptiegolflengte 433-573 nm bij chelatie het ion ¹⁰ ondergaat. De verhouding van deze twee absorptiemaxima kan worden gebruikt om de hoeveelheid unchelated Gd ³⁺ kwantificeren. De aptameer sensor een alternatief (ook complementair zijn) aan de xylenol oranje assay, zoals de twee methoden hebben verschillende reactiecondities (zoals pH en samenstelling van de bufferoplossingen gebruikt), doel selectiviteit, lineaire reeksen van kwantificering en detectie voorwaarden ^9.

Protocol

OPMERKING: Moleculaire biologie kwaliteit water wordt gebruikt in alle buffer en oplossing preparaten. Alle disposable buizen (microcentrifuge en PCR) en pipet tips zijn DNase- en RNase-vrij. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad (VIB) voor alle chemische stoffen voor gebruik. Het gebruik van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) wordt sterk aanbevolen.

1. Bereiding van de aptameer Voorraadoplossingen

1. Aankoop van 2 strengen van polydeoxynucleotide commercieel. Bestellen beide strengen reinigend via hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).
   Deel 1 (Gd-aptameer):
   5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
   Deel 2 (QS):
   5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 '
2. Ontbinden elke streng in water tot 100 urn individuele aandelen oplossingen van de Gd-aptameer en de QS te maken.
3. Bewaar de oplossingen bij -20 ° C. De oplossingen zijn stabiel tot dusver voor 3 jaar.
4. Om freez minimaliserene-dooi cycli, slaan de voorraad oplossingen in 10 pi porties.

2. Bereiding van de 2x Gd-sensor Solution

1. Bereid de testbuffer (20 mM HEPES, 2 mM _MgCl2, 150 mM NaCl, 5 mM KCl). Breng de pH op ~ 7,4 met NaOH en HCl en filteren door middel van steriele fles top filters met 0,2 um PES membraan. Bewaar in steriele flessen. Als gefiltreerd en juiste wijze zijn opgeslagen (bij kamertemperatuur), de buffer stabiel tot dusver voor 2 jaar.
2. Verdun 1 pi van het Gd-aptameer voorraadoplossing (uit stap 1.2) en 2 pi van de QS voorraadoplossing (uit stap 1.2) in 497 pi van de assay buffer. Meng goed met behulp van een vortex. De concentratie in de 2x Gd-sensoroplossing zijn 200 nM en 400 nM.
   Opmerking: Het volume van 2x Gd-sensoroplossing bereide stap 500 pl, wat voldoende is om te testen 6 - 7 verschillende concentraties Gd ³⁺ voor de ijkcurve het contrastmiddel oplossingen(stap 3). Elk monster zal duplo putten in een 384-wells plaat geven.
   1. Het volume van de 2x Gd-sensor oplossing volgens het aantal Gd ³⁺ oplossingen die getest moet worden.
3. Breng de 2x Gd-sensor oplossing in 9 PCR buizen met 50 pl in elke buis. Plaats de buisjes in een thermische cycler.
4. Stel het programma in de thermische cycler met de oplossing voor de buizen tot 95 ° C verhit, gedurende 5 min en vervolgens langzaam afkoelen van de oplossing tot 25 ° C ~ 15 minuten (met een snelheid van ~ 0,05-0,1 ° C / s). De verwarming en koeling cyclus is om een ​​optimale hybridisatie tussen de Gd-aptameer en de QS garanderen. Gedeeltelijke hybridisatieresultaten in onvolledig harden en een hogere achtergrondfluorescentie van de sensor. Als een thermische cycler niet beschikbaar is, voert deze procedure op een warm waterbad plaats.
5. Eenmaal afgekoeld tot 25 ° C, direct gebruik de oplossing, of houd in de thermische cycler (tot ongeveer 2 uur) tot klaar te zijngebruikt. Wanneer een waterbad wordt gebruikt voor het verwarmen, laat de buizen in het bad als het water langzaam afkoelt tot kamertemperatuur.

3. De bouw van de Fluorescentie Calibration Curve en de aanwezigheid van Unchelated Gd ³⁺ in een oplossing van Gd Contrast Agent

1. Ontbinden GdCl ₃ vast in de testbuffer (dezelfde buffer als in stap 2,1).
2. Behulp van een seriële verdunning, bereiden 100 pl elk van 6 verschillende Gd ³⁺ oplossingen microcentrifugebuizen het dubbele van de uiteindelijk gewenste concentratie voor de ijkcurve (2x toegevoegd).
   1. Bijvoorbeeld, een kalibratie construct voor 0 (alleen buffer zonder GdCl _3), 50, 100, 200, 400 en 800 nM Gd ^3+, worden de oplossingen die 0, 100, 200, 400, 800 en 1600 nM van het ion. Zorg ervoor dat u altijd de 'lege' met 0 nM Gd ³⁺ als de negatieve controle.
3. Los het contrastmiddel tested in de testbuffer. Bereid 2 of 3 verschillende concentraties van het contrastmiddel oplossingen via seriële verdunning.
   OPMERKING: Testen 3 verschillende concentraties van het contrastmiddel Aanbevolen wordt. Dat is dat deze concentraties binnen het lineaire bereik. Indien het geteste kan een lineair verband niet weergegeven monsters, de concentratie van het contrastmiddel te verminderen gebruikt.
4. Neem de PCR-buizen met de 2x Gd-sensor oplossing uit stap 2.5 van de thermische cycler.
5. Voeg 50 ul van elke Gd ³⁺ oplossing van stap 3.2 in 6 van de 9 PCR buizen met de 2x Gd-sensoroplossing. Meng door en neer te pipetteren. Elke PCR buisje bevat nu de gewenste concentratie Gd3 ⁺ te testen, 100 nM Gd-aptameer en 200 nM QS.
6. De resterende PCR buizen met de 2x Gd-sensor oplossing, voeg 50 ul van het contrastmiddel oplossingen van stap 3,3. Meng goed door en neer te pipetteren een paar keer.
7. Incubeer de solutions in de PCR buisjes gedurende ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur. Zij kunnen worden gelaten tot 30 minuten staan.
8. Transfer 45 pi van elke buis in een 384-wells plaat. Elke PCR-buis zal duplo geven.
9. Noteer de fluorescentie van elk putje op een plaat-reader. De fluorofoor (FAM) die in de Gd-sensor ontwerp heeft excitatie en emissie maxima van 495 en 520 nm, respectievelijk, zoals vermeld op de website van de leverancier. Kies geschikte excitatie- en emissiegolflengte of filters naargelang de plaat-lezer of monochromator--filter gebaseerde.
10. Plot de grafiek van fluorescentie in willekeurige fluorescentie-eenheden (AFU) tegen de concentratie van Gd ^3+.
11. Plot de grafiek als fluorescentie-voudige verandering tegen de concentratie van Gd ^3+. Bereken de fluorescentie-voudige verandering door de AFU van elke concentratie te delen door de AFU van de 'blanco' oplossing (met 0 nM van Gd ^3+). De fluorescentie voudige verandering zal zorgen voor de normalization van de resultaten, indien de AFU scherm een aantal periodieke (verschillende dagen, etc.) variaties.
12. Vergelijk de fluorescentie-emissie van de oplossing die het contrastmiddel en de "blanco", dat de oplossing die 0 nM GdCl ₃ (alleen buffer).
    OPMERKING: Een hogere fluorescentie van de oplossing GBCA impliceert de aanwezigheid van unchelated Gd ^3+, die verder zuivering van het contrastmiddel noodzakelijk maken. De hoeveelheid unchelated Gd ³⁺ aanwezig kan worden geschat met behulp van de ijkcurve gebouwd in stap 3.10 of 3.11.

Resultaten

Een typische fluorescentieverandering van het Gd-sensor oplossing in de aanwezigheid van unchelated Gd ³⁺ is weergegeven in figuur 2. De emissie kan worden uitgezet als de fluorescentie-voudige verandering (figuur 2A) of de rauwe fluorescentie lezing (Figuur 2B) in willekeurige eenheden (AFU). Beide percelen opbrengst vergelijkbaar kalibratiekrommen met een lineaire bereik voor de concentratie van Gd ³⁺ dan 1 pM en ...

Discussie

Met behulp van de aptameergebaseerde Gd-sensor, een toename in fluorescentie-emissie die evenredig is met de concentratie van unchelated Gd ³⁺ waargenomen. Om de hoeveelheid van het monster gebruikt een minimum te beperken, kan de test worden uitgevoerd in een 384-wells microplaat met een totale steekproef volume van 45 ul per putje. In dit ontwerp, is de keuze van fluoresceïne (FAM) en DABCYL (Dab) voornamelijk gebaseerd op de kosten van de reagentia; de emissiegolflengte een andere koppeling van fluorofoor ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Gd-aptamer	IDTDNA	Input sequence en fluorofore modificatie in het bestelformulier	Een fluorofoor met een andere emissiegolflengte kan worden gebruikt. De aptamer kan ook bij een andere leverancier worden besteld.
Quenching strand	IDTDNA	Input sequence en quencher modificatie in het bestelformulier	Een andere quencher voor optimale energieoverdracht van de fluorofoor kan worden gebruikt. De aptamer kan ook bij een andere leverancier worden besteld.
Moleculair biologie kwaliteit water			Geen specifieke fabrikant, zowel DEPC of niet-DEPC behandeld werkt even goed
Gadolinium(III) chloride anhydrisch	Strem	936416	Toxisch
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Magnesiumchloride anhydrisch	MP Biomedicals	0520984480 - 100 g
Natriumchloride	Acros Organics	327300025
Kaliumchloride	Fisher Scientific	P333-500
Natriumhydroxide, pellets	Fisher Scientific	BP359	Corrosie
Zoutzuur	Fisher Scientific	SA49	Toxisch en corrosief
384-well zwarte platte bodempolystyreen NBS platen met lage rand	Corning	3575	Platen die geschikt zijn voor fluorescentiemeting zijn vereist.
Nalgene Rapid-Flow steriele wegwerp flesdop filter	Thermo Scientific	5680020	De flesdop is voorzien van 0,2 micron PES membraan
Steriele wegwerpflessen 250 mL	Corning	430281	Een grotere of kleinere fles kan worden gebruikt
1,5 mL microcentrifugebuizen			Geen specifieke fabrikant, zolang ze DNAse en RNAse-vrij zijn
0,2 mL PCR-buizen			Geen specifieke fabrikant, zolang ze DNAse en RNAse-vrij zijn
Micropipetten			Geen specifieke fabrikant
Pipet tips (zonder filter) van geschikte maten			Geen specifieke fabrikant, zolang ze DNAse en RNAse-vrij zijn
Apparatuur
Plate reader	Biotek Synergy H1		Plate readers van andere fabrikanten werken even goed