Methodenartikel

Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en In Situ Proximity Ligatie Assay

DOI:

10.3791/55218

⸱

16 januari 2017

 ,  , 
1University Children's Hospital Basel (UKBB), University of Basel, 2Department of Clinical Research, University of Basel

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit-eiwit interacties kunnen zowel in de kern als in het cytoplasma van een cel optreden. Om deze interacties te onderzoeken, worden traditionele co-immunoprecipitatie en moderne proximity ligatie-assay toegepast. In deze studie vergelijken we deze twee methoden om de verdeling van NF90-RBM3 interacties in de kern en het cytoplasma te visualiseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit-eiwitinteracties zijn betrokken bij duizenden cellulaire processen en vinden plaats in een specifiek ruimtelijk context. Traditioneel is co-immunoprecipitatie een populaire techniek om eiwit-eiwitinteracties te detecteren. Daaropvolgende Western blot-analyse is de meest gebruikelijke methode om geco-immunoprecipiteerde eiwitten te visualiseren. Recentelijk is de proximity ligation assay een krachtig hulpmiddel geworden om eiwit-eiwitinteracties in situ te visualiseren en biedt de mogelijkheid om eiwit-eiwitinteracties door deze methode te kwantificeren. Net als conventionele immunocytochemie is de proximity ligation assay techniek ook gebaseerd op de toegankelijkheid van primaire antilichamen voor de antigenen, maar in tegenstelling detecteert proximity ligation assay eiwit-eiwitinteracties met een unieke techniek die rolling-circle PCR omvat, terwijl conventionele immunocytochemie alleen co-lokalisatie van eiwitten laat zien.

Nuclear factor 90 (NF90) en RNA-bindend motief eiwit 3 (RBM3) zijn eerder aangetoond als interacterende partners. Ze zijn voornamelijk gelokaliseerd in de celkern, maar migreren ook naar het cytoplasma en reguleren signaalroutes in het cytoplasmatische compartiment. Hier vergeleken we de NF90-RBM3 interactie in zowel de kern als het cytoplasma door co-immunoprecipitatie en proximity ligation assay. Daarnaast bespraken we de voordelen en beperkingen van deze twee technieken bij het visualiseren van eiwit-eiwitinteracties met betrekking tot ruimtelijke verdeling en de eigenschappen van eiwit-eiwitinteracties.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nucleaire factor 90 (NF90) is een multi-isovorm eiwit met tal van functies, waaronder de reactie op virale infectie, regulering van interleukine-2 post-transcriptie en regulering van miRNA biogenese 1-3. RBM3 een RNA-bindend eiwit, die deze vertaling en miRNA biogenese en kan worden geïnduceerd door verschillende stressoren waaronder hypothermie en hypoxie 4-6. Onlangs vonden we NF90 en RBM3 in een eiwitcomplex 7. De interactie van NF90 en RBM3 essentieel eiwit kinase RNA-achtige endoplasmatisch reticulum kinase (PERK) moduleren in ongevouwen eiwit reactie 7. Zowel NF90 en RBM3 bevinden zich hoofdzakelijk in de kern, maar een klein deel van NF90 en RBM3 shuttle naar het cytoplasma en binden er elkaar voor specifieke functies, bijv PERK activiteit te reguleren. Daarom is het belangrijk om de distributie van NF90-RBM3 interacties visualiseren subcellulair compartiment die kunnen duidenhun verschillende rollen in respectievelijke compartimenten.

Decennia geleden, gist twee-hybride (Y2H) ontwikkeld om de interactie te detecteren tussen twee eiwitten 8. Echter, als gevolg van kunstmatige constructie van gefuseerde eiwitten, vals-positieve resultaten van de toepassing van deze methode beperkt. Lange tijd, co-immunoprecipitatie was hoofdtechniek analyseren eiwit-eiwit interacties, vooral bij endogene omstandigheden 9. Aan de gezamenlijk immunogeprecipiteerd eiwitcomplex analyseren Western blot is de meest geschikte techniek, terwijl massaspectrometrie wordt gebruikt bij super gevoeligheid en nauwkeurigheid gewenst. De laatste jaren heeft nabijheid ligatie assay ontwikkeld als een nieuwe methode om eiwit-eiwit interacties in zowel cellen en weefsels te detecteren in situ 10,11.

Hier hebben we de meest populaire co-immunoprecipitatie en relatief nieuwe methode nabijheid ligatie assay werkwijze vastleggen NF90-RBM3 interactie in subcellulaire fracties. We hebben ook gesproken over de voordelen en beperkingen van beide technieken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Co-immunoprecipitatie

  1. Zaad HEK293 cellen bij 2 x 10 5 cellen per putje in een 6-well plaat in 2 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) supplement met 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 U / ml penicilline-streptomycine (Pen-Strep) .
  2. Kweek cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
  3. Was de cellen met koude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) driemaal. Oogst de cellen door centrifugatie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  4. Bereid nucleaire en cytoplasmatische fracties behulp van commerciële nucleaire en cytoplasmatische extractie reagentia. Volg de instructies van de fabrikant met enkele wijzigingen.
    1. Gebruik 3 x 10 6 cellen voor een co-immunoprecipitatie-experiment (ongeveer 90% samenvloeiing van 3 putjes van een 6-wells plaat). Voeg 300 ul koude cytoplasmatische extractieoplossing (CER I) en vortex gedurende 15 seconden op de hoogste snelheid.
    2. Incubeer gedurende 30 min op ijs. Tijdens incubatie Vortex 5 sec elke 10 min.
    3. Voeg 16,5 ul koude cytoplasma extractie-oplossing II (CER II), vortex gedurende 5 seconden en incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
    4. Vortex gedurende 5 seconden en centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
    5. Transfer supernatans (cytoplasmatisch extract) in een nieuwe pre-gekoelde buis, en blijf op ijs tot gebruik.
    6. Wassen onoplosbare pellets (bevattende kernen) drie maal met 1 ml koude PBS telkens op en neer te pipetteren vijf keer. Verwijder PBS na het wassen.
    7. Voeg 150 ul koude nucleaire extractie-oplossing (NER), vortex gedurende 15 sec en incubeer 1 uur op ijs. Tijdens incubatie vortex gedurende 15 seconden en 10 maal pipet met een 200 ul tip elke 10 min.
    8. Vortex gedurende 15 s en centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
    9. Transfer supernatant (kernextract) in een nieuwe voorgekoeld buis, houdt op ijs tot gebruik.
  5. Neem 10% van het volume van de nucleaire en cytoplasmatische extracten elk als ingangen.
  6. EENdd koude PBS om de resterende fragmenten tot een eindvolume van 1 ml. Blijf op ijs tot gebruik.
    OPMERKING: Pre-clearing niet essentieel is bij het gebruik van Proteïne G-geconjugeerde magnetische korrels. Echter, als de achtergrond hoge Voer pre-clearing door het incuberen van 40 pl Proteïne G geconjugeerde magnetische korrels (50% suspensie) en 1 ml verdunde lysaat van deze stap op 4 ° C gedurende 30 minuten op een rotator. Aparte supernatant (pre-geklaard lysaat) uit kralen met magnetische rek. Gooi de kralen.
  7. Te koppelen primair antilichaam met Proteïne G-geconjugeerde magnetische korrels, incubeer 40 ul Proteïne G-geconjugeerde magnetische korrels (50% slurry) met 4 ug konijn polyklonaal anti-RBM3 antilichaam of konijnen IgG (negatieve controle) in 200 pl PBS plus Tween 20 buffer (PBST, 0,02% Tween 20) bij kamertemperatuur (KT) gedurende 40 minuten op een rotator.
  8. Aparte antilichaam-gekoppelde kralen en supernatant met een magnetische rek, en gooi de supernatant. Was de parels eenmaal met 200 pi PBST (0,02%).
  9. Voeg 1ml verdunde lysaten (of eventueel vooraf geklaard lysaten) aan de korrels, en incubeer op rotator bij 4 ° C overnacht.
  10. Op de volgende dag, scheiden de kralen en supernatant door een magnetisch rek, en gooi de supernatant. Was 3 x 10 min met 0,5 ml PBST (0,02%) voor elke buis bij 4 ° C op een rotator met een vaste snelheid van 20 rpm.
  11. Elueer eiwitten van de bolletjes door toevoeging 40 pl monsterbuffer (1x commerciële monsterbuffer en 50 mM 1,4-dithiothreitol (DTT)). Verhit bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Spin down en overdracht vloeistoffen naar een nieuwe 1,5 ml buis.
  12. Verdun ingang lysaten in monsterbuffer (eindconcentratie: 1x commerciële monsterbuffer en 50 mM DTT) en verwarm bij 70 ° C gedurende 10 minuten. Load input en immunologisch neergeslagen eiwitten van de laatste stap een prefab 4-12% bis-Tris gel. Het laadvolume van elk putje mag niet meer dan 20 pl. Voeren elektroforese in 1 x loopbuffer commerciële op ijs gedurende 35 min.
    LET OP: Load nucleaire en cytoplasmatische extracts in een verhouding van 1: 2 (V / V), die dezelfde oorspronkelijke hoeveelheid cellen weerspiegelt.
  13. Transporterende eiwitten op PVDF membraan 1x commerciële overdracht buffer bij 30 V gedurende 2 uur bij 4 ° C.
  14. Blok membraan met 5% magere melk in PBST (0,1% Tween 20) bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten op een schudapparaat.
  15. Incubeer het membraan met primaire antilichamen (zowel verdund in 1: 1000) in PBST (0,1%) bij 4 ° C overnacht.
  16. Was 3 x 10 minuten met PBST (0,1%) bij kamertemperatuur op een schudinrichting.
  17. Incubeer membraan met mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd anti-muis of anti-konijn secundaire antilichamen (zowel verdund in 1: 5000) in PBST (0,1%) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  18. Was 3 x 10 minuten met PBST (0,1%) bij kamertemperatuur op een schudinrichting.
  19. Gebruik 0,2 ml versterkte chemiluminescentie (ECL) substraatmengsel per cm2 membraan geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Vermijd alle licht van deze stap verder met uitzondering van rode lichten.
  20. Gooi vloeistof en blootstellen aan een röntgenfilm in een filmcassette. Ontwikkel film met behulp van een automatische film prHOUTBEWERKINGS machine.

2. Immunocytochemie en Proximity Ligatie Assay

  1. Zaad HEK293 cellen bij 1,5 x 10 4 cellen per kamer in één 8-kamer poly-D-lysine gecoate dia in 0,4 ml DMEM aangevuld met 10% FBS en 100 U / ml Pen-Strep.
  2. Kweek cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
  3. Aspireren medium en vast de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Aspireren PFA, en wassen 3 x 10 min met 0,5 ml PBS per kamer.
  5. Doorlaatbaar en blok cellen met 0,5% Triton X-100 en 5% normaal geit serum (NGS) in PBS bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  6. Incubeer met primaire antilichamen in 0,1% Triton X-100 en 5% NGS in PBS op een schudder bij 4 ° C overnacht. Verdunde monoklonaal anti-NF90-antilichaam en konijn polyklonaal anti-RBM3 antilichaam 1: 100 in PBS dubbele kleuring. Voor negatieve controle, onafhankelijk weglaten van beide primaire antilichamen en weglaten beide antilichamen in een derde controle.
    NB: Gebruik geen commerciële blokkeren en verdunnen van reagentia.
  7. Was 3 x 10 min met 0,5 ml PBS per kamer.
  8. Onderworpen aan immunocytochemie of proximity ligation assay protocols
    1. immunocytochemie
      1. Incuberen met 1: 500 verdund groene fluorescente kleurstof gekoppeld anti-muis en rode fluorescerende kleurstof-gekoppelde anti-konijn secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Vermijd het licht van deze stap verder.
      2. Tegenkleuring kernen met 4 ', 6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) verdund 1: 5000 in PBS bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
      3. Was 3 x 10 min met 0,5 ml PBS per kamer.
      4. Verwijder de kamers van het glasplaatje en droog. Monteer met 250 μ, montage medium per slide.
    2. Proximity ligation assay
      1. Bereid nabijheid ligatie assay probes. Meng en verdun twee proximity ligation assay probes (anti-muis en anti-konijn secundaire antilichamen bevestigd met verschillende oligonucleotiden die th kan ligerenruwe toevoeging van twee andere oligonucleotiden ligatie oplossing) zowel 1: 5 in 0,1% Triton X-100 en 5% NGS in PBS, met een totaal volume van 320 ui voor een 8-kamer schuif (ongeveer 40 pi per cm 2) . Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
      2. Verwijder de kamers van het glasplaatje en voeg de verdunde probes. Incubeer in een vochtige incubator bij 37 ° C gedurende 1 uur.
      3. Bereid ligatie oplossing. Meng 8 ui ligase, 64 ui 5 x ligatie voorraad en 248 ul H 2 O.
      4. Tik de vloeistof af van de glijbaan, en was 2 x 5 min in 1x Wash Buffer A (geleverd bij de kit).
      5. Voeg ligatie-oplossing en incubeer in een vochtige incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
      6. Bereid amplificatie oplossing. Mix 4 pl polymerase, 64 pi 5x versterking voorraad en 252 ul H 2 O. Vermijd licht van deze stap verder.
      7. Tik off vloeistof van de glijbaan, en was 2 x 2 min in 1x Wash Buffer A.
      8. Voeg de amplification oplossing en incubeer in het donker vochtigheid incubator bij 37 ° C gedurende 100 min.
      9. Tik de vloeistof af van de glijbaan, en was 2 x 10 minuten in 1 x Wash Buffer B (geleverd bij de kit). Was gedurende 1 minuut in 0.01x Wash Buffer B.
      10. Droog de glijbaan en monteer met 250 pi van een commercieel montage medium (met DAPI) per slide.
  9. Onderzoek fluorescentiesignalen onder een microscoop met een 10x oculair en 20X objectief. Acquire beelden van een CCD-camera.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 toont aan dat NF90 en RBM3 zowel kerneiwitten en slechts een kleine fractie aanwezig in het cytoplasma. Met name zijn er drie verschillende banden gekleurd positief voor RBM3. De kleinste net onder 20 kDa geeft de juiste maat van RBM3 (het voorspelde molecuulgewicht van RBM3 is 17 kDa). De oorsprong van de twee andere banden nog worden onderzocht. Co-immunoprecipitatie experimenten met RBM3 als lokaas eiwit bleek dat NF90-RBM3 interacties overwegend in de kern e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende voordelen evenals tekortkomingen voor beide methoden. Als relatief nieuwe techniek, een duidelijk voordeel van nabijheid ligatie assay is het haalbaar om eiwit-eiwit interacties op single-cell level in plaats van een partij van heterogene cellen helderen. Beelden met een hoge resolutie en omvang (bijvoorbeeld door confocale microscoop) de mogelijkheid voor de kwantificering door het tellen van enkele fluorescerende vlekken. Daarentegen kan de conventionele combinatie van co-immunoprecipita...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de Zwitserse Nationale Wetenschapsstichting (SNSF, 31003A_163305).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM)SigmaD6429Hoge glucose
4.500 mg/L
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific10270106
Penicillin-Streptomycin (PenStrep)BioConcept4-01F00-H
NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction ReagentsThermo Fisher Scientific78833
1,4-Dithiothreitol (DTT)Carl Roth6908.3
Dynabeads Protein GNovex, Thermo Fisher Scientific10003D
DRBP76 (NF90/NF110) antibodyBD Transduction Laboratories612154gebruik 1:1.000 voor WB en 1:100 voor ICC/PLA
RBM3 antibodyProteinTech14363-1-APgebruik 1:1.000 voor WB en 1:100 voor ICC/PLA
Lamin A/C antibodyCell Signaling Technology#2032gebruik 1:1.000 voor WB
anti-GAPDH antibodyAbcamab8245gebruik 1:1.000 voor WB
normal rabbit IgGSanta Cruzsc-2027
anti-rabbit IgG, HRP-linked secundaire antibodyCell Signaling Technology#7074gebruik 1:5.000 voor WB
anti-mouse HRP secundaire antibodyCarl Roth4759.1gebruik 1:5.000 voor WB
Clarity Western ECL Blotting SubstrateBio-Rad#1705060
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris GelNovex, Thermo Fisher ScientificNP0321BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP0002
NuPAGE Transfer Buffer (20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP00061
Amersham Hypond P 0.2 PVDF membraneGE Healthcare Life Sciences10600021
Poly-D-Lysine 8 Well Culture SlideCorning BioCoat354632
Paraformaldehyde (PFA)SigmaP6148
Normal goat serum (NGS)Gibco, Thermo Fisher ScientificPCN5000
Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugateThermo Fisher ScientificA-11001
Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugateThermo Fisher ScientificA-11011
4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)SigmaD9542
Duolink PLA probe Anti-mouse PLUSSigmaDUO92001
Duolink PLA  probe Anti-rabbit MINUSSigmaDUO92005
Duolink Detection Reagents RedSigmaDUO92008
Duolink Wash Buffers FluorescenceSigmaDUO82049
Duolink Mounting Medium with DAPISigmaDUO82040
Mowiol 4-88Sigma81381
MicroscopeOlympusAX-70
CCD cameraSPOTInsight 2MP Firewire
X-ray filmFujifilmSuper RX
Film processing machineFujifilmFPM-100A

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
  2. Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
  3. Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
  4. Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
  5. Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
  6. Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
  7. Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
  8. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  9. Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
  10. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
  11. Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
  12. Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Nucleaire cytoplasmatische fractiesWestern blot analyseimmunocytochemieHEK293 cellenNF90 RBM3 interactieanalyse van cellulaire compartimentenfluorescentiemicroscopie

Gerelateerde artikelen