Eiwit-eiwit interacties kunnen zowel in de kern als in het cytoplasma van een cel optreden. Om deze interacties te onderzoeken, worden traditionele co-immunoprecipitatie en moderne proximity ligatie-assay toegepast. In deze studie vergelijken we deze twee methoden om de verdeling van NF90-RBM3 interacties in de kern en het cytoplasma te visualiseren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Eiwit-eiwitinteracties zijn betrokken bij duizenden cellulaire processen en vinden plaats in een specifiek ruimtelijk context. Traditioneel is co-immunoprecipitatie een populaire techniek om eiwit-eiwitinteracties te detecteren. Daaropvolgende Western blot-analyse is de meest gebruikelijke methode om geco-immunoprecipiteerde eiwitten te visualiseren. Recentelijk is de proximity ligation assay een krachtig hulpmiddel geworden om eiwit-eiwitinteracties in situ te visualiseren en biedt de mogelijkheid om eiwit-eiwitinteracties door deze methode te kwantificeren. Net als conventionele immunocytochemie is de proximity ligation assay techniek ook gebaseerd op de toegankelijkheid van primaire antilichamen voor de antigenen, maar in tegenstelling detecteert proximity ligation assay eiwit-eiwitinteracties met een unieke techniek die rolling-circle PCR omvat, terwijl conventionele immunocytochemie alleen co-lokalisatie van eiwitten laat zien.
Nuclear factor 90 (NF90) en RNA-bindend motief eiwit 3 (RBM3) zijn eerder aangetoond als interacterende partners. Ze zijn voornamelijk gelokaliseerd in de celkern, maar migreren ook naar het cytoplasma en reguleren signaalroutes in het cytoplasmatische compartiment. Hier vergeleken we de NF90-RBM3 interactie in zowel de kern als het cytoplasma door co-immunoprecipitatie en proximity ligation assay. Daarnaast bespraken we de voordelen en beperkingen van deze twee technieken bij het visualiseren van eiwit-eiwitinteracties met betrekking tot ruimtelijke verdeling en de eigenschappen van eiwit-eiwitinteracties.
Inleiding
Nucleaire factor 90 (NF90) is een multi-isovorm eiwit met tal van functies, waaronder de reactie op virale infectie, regulering van interleukine-2 post-transcriptie en regulering van miRNA biogenese 1-3. RBM3 een RNA-bindend eiwit, die deze vertaling en miRNA biogenese en kan worden geïnduceerd door verschillende stressoren waaronder hypothermie en hypoxie 4-6. Onlangs vonden we NF90 en RBM3 in een eiwitcomplex 7. De interactie van NF90 en RBM3 essentieel eiwit kinase RNA-achtige endoplasmatisch reticulum kinase (PERK) moduleren in ongevouwen eiwit reactie 7. Zowel NF90 en RBM3 bevinden zich hoofdzakelijk in de kern, maar e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Co-immunoprecipitatie
- Zaad HEK293 cellen bij 2 x 10 5 cellen per putje in een 6-well plaat in 2 ml Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) supplement met 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 U / ml penicilline-streptomycine (Pen-Strep) .
- Kweek cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
- Was de cellen met koude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) driemaal. Oogst de cellen door centrifugatie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Bereid nucleaire en cytoplasmatische fracties behulp van commerciële nucleaire en cytoplasmatische extractie reagentia. Volg de instructies van de fabrika....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont aan dat NF90 en RBM3 zowel kerneiwitten en slechts een kleine fractie aanwezig in het cytoplasma. Met name zijn er drie verschillende banden gekleurd positief voor RBM3. De kleinste net onder 20 kDa geeft de juiste maat van RBM3 (het voorspelde molecuulgewicht van RBM3 is 17 kDa). De oorsprong van de twee andere banden nog worden onderzocht. Co-immunoprecipitatie experimenten met RBM3 als lokaas eiwit bleek dat NF90-RBM3 interacties overwegend in de kern e.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn verschillende voordelen evenals tekortkomingen voor beide methoden. Als relatief nieuwe techniek, een duidelijk voordeel van nabijheid ligatie assay is het haalbaar om eiwit-eiwit interacties op single-cell level in plaats van een partij van heterogene cellen helderen. Beelden met een hoge resolutie en omvang (bijvoorbeeld door confocale microscoop) de mogelijkheid voor de kwantificering door het tellen van enkele fluorescerende vlekken. Daarentegen kan de conventionele combinatie van co-immunoprecipita.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door de Zwitserse Nationale Wetenschapsstichting (SNSF, 31003A_163305).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D6429 | Hoge glucose 4.500 mg/L |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin (PenStrep) | BioConcept | 4-01F00-H | |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908.3 | |
| Dynabeads Protein G | Novex, Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| DRBP76 (NF90/NF110) antibody | BD Transduction Laboratories | 612154 | gebruik 1:1.000 voor WB en 1:100 voor ICC/PLA |
| RBM3 antibody | ProteinTech | 14363-1-AP | gebruik 1:1.000 voor WB en 1:100 voor ICC/PLA |
| Lamin A/C antibody | Cell Signaling Technology | #2032 | gebruik 1:1.000 voor WB |
| anti-GAPDH antibody | Abcam | ab8245 | gebruik 1:1.000 voor WB |
| normal rabbit IgG | Santa Cruz | sc-2027 | |
| anti-rabbit IgG, HRP-linked secundaire antibody | Cell Signaling Technology | #7074 | gebruik 1:5.000 voor WB |
| anti-mouse HRP secundaire antibody | Carl Roth | 4759.1 | gebruik 1:5.000 voor WB |
| Clarity Western ECL Blotting Substrate | Bio-Rad | #1705060 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP0002 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Novex, Thermo Fisher Scientific | NP00061 | |
| Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane | GE Healthcare Life Sciences | 10600021 | |
| Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide | Corning BioCoat | 354632 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Normal goat serum (NGS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink PLA probe Anti-rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink Detection Reagents Red | Sigma | DUO92008 | |
| Duolink Wash Buffers Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Duolink Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381 | |
| Microscope | Olympus | AX-70 | |
| CCD camera | SPOT | Insight 2MP Firewire | |
| X-ray film | Fujifilm | Super RX | |
| Film processing machine | Fujifilm | FPM-100A |
Referenties
- Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
- Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
