Methodenartikel

Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden

DOI:

10.3791/55219

⸱

25 februari 2017

 ,  , 
1Laboratory of Pathology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 2Experimental Transplantation and Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een methode om enkele zoogdiercellen te sorteren en om de expressie van maximaal 96 doelgenen van belang in elke cel te kwantificeren. Deze methode omvat het gebruik van interne qPCR-standaarden om de schatting van absolute transcripttellingen mogelijk te maken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meetingen van genexpressie van bulkpopulaties van cellen kunnen de aanzienlijke transcriptomische variatie van individuele cellen binnen die populaties verdoezelen. Metingen van genexpressie op enkele cellen kunnen helpen bij het beoordelen van de rol van ruis in genexpressie, het identificeren van correlaties in de expressie van paar genen en het onthullen van subpopulaties van cellen die anders reageren op een stimulus. Hier beschrijven we een procedure om de expressie van maximaal 96 genen te meten in enkele zoogdiercellen die zijn geïsoleerd uit een populatie die groeit in weefselkweek. Cellen worden door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) gesorteerd in lysebuffer, en de mRNA-soorten van belang worden reverse-getranscripteerd en geamplificeerd. Genexpressie wordt vervolgens gemeten met behulp van een microfluïdische real-time PCR-machine, die maximaal 96 qPCR-assays uitvoert op maximaal 96 monsters tegelijk. We beschrijven ook het genereren en gebruik van PCR-ampliconstandaarden om de schatting van het absolute aantal van elk transcript mogelijk te maken. In vergelijking met andere methoden om genexpressie in enkele cellen te meten, maakt deze aanpak de kwantificering van meer verschillende transcripten mogelijk dan RNA FISH tegen een lagere kostprijs dan RNA-Seq.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Afzonderlijke cellen in een populatie kan sterk verschillende reacties op een uniforme fysiologische stimulus 1, 2, 3, 4 vertonen. De genetische variatie van cellen in een populatie is één mechanisme voor deze verschillende reacties, maar er zijn ook een aantal niet-genetische factoren die de variabiliteit van de reacties kan verhogen, zelfs in een klonale populatie van cellen. Bijvoorbeeld kan de hoeveelheid melk eiwitten en andere belangrijke signaalmoleculen afhankelijk van een cel per cel basis, hetgeen leidt tot variatie in stroomafwaartse genexpressieprofielen. Bovendien kan genactivatie optreden bij kortdurende uitbarstingen van transcripten 5, 6 die kan worden beperkt tot een relatief klein aantal transcripten per burst 7, 8, 9. zodanigstochasticity in genactivering kan aanzienlijk bijdragen tot variabiliteit in biologische reacties en een selectief voordeel verschaffen in microörganismen 10 en zoogdiercellen 1, 2 reageert op een fysiologische stimulus. Door zowel genetische en niet-genetische bronnen van variatie, kan het genexpressie profiel van elke bepaalde cel in reactie op een stimulus sterk afwijken van de gemiddelde genexpressieprofiel verkregen uit de meting van de massa respons. Vaststelling van de mate waarin individuele cellen geven variabiliteit in reactie op een stimulus vereist technieken voor isolatie van afzonderlijke cellen, het meten van de expressieniveaus van transcripten van belang en de geautomatiseerde analyse van de resulterende expressieplasmide gegevens.

Er zijn verschillende manieren voor het bepalen van genexpressie in enkele cellen, die een breed scala van kosten, het aantal transcripten gesondeerd ennauwkeurigheid van de kwantificering. Bijvoorbeeld eencellige RNA-Seq biedt een grotere scherptediepte transcript dekking en het vermogen om duizenden verschillende transcripten voor de hoogst uitgedrukte genen in individuele cellen te kwantificeren; echter kunnen de kosten voor een dergelijke sequentie diepte onbetaalbaar, maar kosten blijven dalen. Omgekeerd, enkel-molecuul RNA fluorescentie in situ hybridisatie (FISH smRNA) biedt nauwkeurige kwantificering van transcripten voor zelfs low-genen tot expressie tegen een redelijke prijs per gen van belang; echter, kan slechts een klein aantal doelgenen worden getest in een bepaalde cel van deze benadering. Kwantitatieve PCR-gebaseerde testen beschreven in dit protocol, te midden tussen deze technieken. Deze assays maken gebruik van een microfluïdische real-time PCR machine te kwantificeren 96 transcripten plaats in een tijd tot 96 cellen. Terwijl elk van de bovengenoemde methoden heeft hardwarefuncties, de kosten van elke afzonderlijke qPCR assay relatieflaag. Dit protocol is een bewerking van een door een fabrikant van een microfluïdische real-time PCR machine (Protocol ADP 41, Fluidigm) voorgesteld. Om de schatting van het absolute aantal van elke transcript in een PCR-gebaseerde aanpak mogelijk te maken, hebben we het protocol om gebruik te maken van de interne controle van bereide target-gen amplicons die over meerdere experimenten kan worden gebruikt maken uitgebreid.

Als voorbeeld van deze techniek wordt de kwantificering van de expressie van genen gereguleerd door de tumorsuppressor p53 in MCF-7 humane borstcarcinoomcellen 11 beschreven. De cellen worden blootgesteld aan een chemisch agens dat DNA dubbelstrengige breuken induceert. Eerdere studies hebben aangetoond dat de p53 respons op DNA dubbelstrengs breuken vertoont veel heterogeniteit in individuele cellen, zowel wat p53 niveaus 12 en bij de activering van verschillende doelgenen 11. Bovendien p53 regelt de expressie van meer dan 100goed gekarakteriseerde target genen betrokken bij tal stroomafwaartse paden, zoals celcyclus, apoptose, senescentie en 13, 14. Aangezien de p53-gemedieerde respons in elke cel is complex en variabel, de analyse van het systeem beschikt over een benadering waarbij bijna 100 doelgenen kan gelijktijdig geprobed in individuele cellen, zoals hieronder beschreven. Met kleine aanpassingen (zoals alternatieve methoden voor eencellige isolatie en lysis) Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan een breed scala van zoogdier celtypen, transcripties en cellulaire reacties te bestuderen.

Met een goede voorbereiding vooraf, kan een rondje celsortering en genexpressie metingen worden uitgevoerd volgens dit protocol over een periode van drie dagen. De volgende timing wordt voorgesteld: van tevoren, selecteert u de transcripties van belang, te identificeren en valideren van de primerparen dat de cDNA versterken van die transcrIPTS, en de voorbereiding van de normen en primer mixen met behulp van deze primers. Op dag 1 na celtherapie, oogst en de cellen te sorteren, voert reverse transcriptie en specifieke amplificatie en behandeling van de monsters met een exonuclease om niet opgenomen primers te verwijderen. Op dag 2, het uitvoeren van kwaliteitscontroles op gesorteerde cellen met behulp van qPCR. Tenslotte op dag 3, meet de genexpressie in de cellen gesorteerd met behulp microfluïdische qPCR. Figuur 1 vat de stappen betrokken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Advance Voorbereiding

  1. Selecteer tot 96 genen van belang waarvan de expressie zal worden gemeten.
    OPMERKING: Ten minste één van deze genen zou een "huishoud gen" zoals ACTB of GAPDH, dat bekend is tot expressie op een betrekkelijk hoog en constant niveau onder de in het experimentele omstandigheden. Dit gen wordt gebruikt om positief gesorteerd putjes (stap 8,1) en geamplificeerde monsters (stap 10.1) te identificeren.
    OPMERKING: Bij het voorbeeld experiment goed gekarakteriseerd, directe doelwit van p53 met allerlei gekende functies 11, 14 en GAPDH als een housekeeping controle werden geselecteerd. Zie Referentie 11 voor de volledige lijst van target genen en primer sequenties die in deze studie.
  2. Identificeren van potentiële primerparen die specifiek zijn voor de genen van belang (bijvoorbeeld, met behulp van de wetenschappelijke literatuur of een primer design tool zoals Primer-BLAST) 15. Laat de primers gesynthetiseerd en hen te handhaven op een voorraad concentratie van 100 uM in nuclease-vrij water.
    LET OP: Deze primers moeten 15-25 basen lang zijn; produceren van een amplicon 90-130 baseparen (bp) lang; overspannen een exon junctie, indien aanwezig, om de kans op het amplificeren van genomisch DNA te verminderen; hebben smelttemperaturen van 60 ± 1 ° C; en hebben een minimale secundaire structuur 16. Deze primers worden gebruikt voor het primen reverse transcriptie, cDNA amplificeren van de transcripten van belang, en meet genexpressie in DNA bindende kleurstof gebaseerde qPCR.
  3. Valideren de primers.
    1. Eerst verkrijgen cDNA uit de cellen van belang. Oogst RNA uit de cellen met een RNA oogsten kit volgens de instructies van de fabrikant of standaard moleculair biologische werkwijzen 17. Reverse-transcriberen het RNA in cDNA met behulp van een reverse transcriptie kit met willekeurige hexameren volgens de instructies van de fabrikant of standaard methods 17.
    2. Voor elk primerpaar, opgericht qPCR met DNA-bindende kleurstof master mix, voorwaartse en achterwaartse primers, en het cDNA van de vorige stap, naar aanleiding van de aanbevelingen van de master mix fabrikant voor suggereerde reactie omstandigheden. Run deze reacties op een real-time PCR machine met behulp van een thermische cyclus protocol aanbevolen door de master mix fabrikant die smelt curve overname omvat.
    3. Na de qPCR, voert het geamplificeerde DNA monsters op een 2% w / v agarosegel en het DNA te visualiseren via een DNA intercalerende kleurstof volgens een standaard protocol 17.
    4. Bepaal de efficiëntie van het primerpaar door het construeren van een standaardkromme seriële verdunningen van cDNA (in stap 1.3.1) volgens een standaard protocol 16.
      LET OP: Een goede primer pair zal een smelt curve opleveren met een enkele, goed gedefinieerde piek en een enkele band in de verwachte locatie op de gel 16, up class = "xref"> 17 (figuur 2). Als de smelt curve meerdere pieken of een "schouder" of wanneer de gel meerdere banden of een uitstrijkje, worden de primers amplificeren een off-doelsequentie. Redesign elke primers die zijn waargenomen aan off-target sequenties versterken en herhaal de vorige validatie stappen als dat nodig is. Een goede primerpaar zal ook een rendement van 90-110%, met R 2 ≥0.985 de standaardkromme 16; herontwerp alle primers die de doelmatigheid of R 2 vallen buiten deze bereiken.
  4. Bereid normen van gezuiverd DNA amplicons.
    1. Voor elk gevalideerd primerpaar:
      1. Amplify het interessegebied van cDNA met behulp van een high-fidelity DNA polymerase volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor polymerase primer en matrijs-DNA concentraties reactieomstandigheden en PCR cyclingcondities, of met een standaard PCR-protocol"xref"> 17.
      2. Voer het geamplificeerde cDNA op een 2% w / v agarosegel en breng de band met een DNA intercalerende kleurstof 17. Accijnzen de band die het amplicon met een schone scheermesje en plaats de gel stuk in een microcentrifugebuis.
      3. Zuiver het amplicon van de gel met een standaard extractieprocedure gel, zoals een agarase-gebaseerde extractie 17 of een spin-kolom gel extractie kit volgens de instructies van de fabrikant.
      4. Meet de concentratie van amplicon met een op fluorescentie gebaseerde kwantitatieve dsDNA kit volgens instructies van de fabrikant. Verdeel de gemeten concentratie dsDNA de bekende molecuulgewicht van het amplicon basis van het amplicon sequentie het aantal moleculen per amplicon pl verkrijgen.
      5. In een 2,0 ml laag-bindende microfugebuis, voeg 2 pl gezuiverde amplicon tot een volume van DNA suspensie buffer zodat de uiteindelijke concentratie ampLicon is 5 x 10 8 moleculen / ul.
    2. Wanneer alle amplicons zijn gezuiverd en gecombineerd 18 pi van elke gezuiverde amplicon in een 2,0 ml laag-bindende microcentrifugebuis. Voeg DNA suspensie buffer tot een totaal volume van 1800 gl maken; dus de concentratie van elke amplicon 5 x 10 6 moleculen / pl.
      LET OP: Dit mengsel, dat cDNA amplicons bevat van alle genen van belang in bekende equimolaire hoeveelheden, zal dienen als een standaard in de single-cell qPCR.
    3. Vortex deze "5E6" standaard grondig, centrifugeren gedurende 10 sec bij 2000 xg, en verdeel het in 20 ul fracties in low-bindende PCR-buizen. Bewaar de fracties bij -80 ° C.
  5. Bereid de specifieke doelgroep amplificatie (STA) primer mix (10x).
    1. In een 15 ml conische buis, combineer 25 pi van elk 100 uM stock primer (tot 192). Voeg DNA suspensie buffer tot een totaal volume van 5000 gl maken.
      Merk opconcentratie van elke primer in dit mengsel is 500 nM. Elke plaat van gesorteerde cellen zal 105,6 ul van deze primer mix gebruiken om prime het omgekeerde transcriptie en specifieke doelgroepen versterking. Het volume van de primer mix hier gegeven is genoeg om 45 platen te maken om te sorteren. Het is raadzaam om een ​​voldoende grote hoeveelheid primer mix zodat deze slechts eenmaal te worden; schaal volumes nodig.
    2. Meng goed door vortexen, te verdelen in 110 ul fracties en de fracties op te slaan bij -20 ° C.
  6. Bereid assay mengsels, één voor elk primerpaar voor gebruik in microfluïdische chip-gebaseerde qPCR.
    1. In elk putje van een 96-well PCR plaat, combineer 3,0 pl van de 100 pM forward primer voor een bepaald gen, 3,0 pl van de overeenkomstige 100 uM reverse primer, 24,0 pl DNA suspensie buffer en 30,0 pl 2x assay loading reagens .
    2. Vortex deze plaat rotatie gedurende 10 sec bij 500 xg en bewaar bij -20 ° C.
  7. Maak twee thermische cycli programma's: RTSTA (reverse transcriptie en specifieke doelgroep versterking; tabel 1) en EXOI (exonuclease I behandeling, tabel 2).

2. Behandeling

  1. De plaat zoogdiercellen op een weefselkweekschaal zodanig dat ze groeien tot de gewenste samenvloeiing op het moment van de behandeling, afhankelijk van de omstandigheden van het experimentele onderzoek. Voor de in dit onderzoek voorbeeld plate 4 x 10 5 MCF-7 p53-Venus cellen 18 per 6 cm schaaltje in RPMI met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, en 250 ng / ml amfotericine B. Incubeer de cellen gedurende twee dagen bij 37 ° C met 5% CO2 totdat ze 50% confluentie bereiken.
  2. Behandel de cellen om de conditie van belang op basis van de experimentele studie vast. Voor de in dit onderzoek voorbeeld incubeer MCF-7-p53 Venus cellen met 400 ng / ml neocarzinostatine gedurende 3 uur, 8,5 uur, 14 uur of 24 uur.

3. Lysis Buffer Voorbereiding voor celsortering

NB: Het maken van een enkele plaat van lysisbuffer duurt ongeveer 1 uur. Het is raadzaam om te sorteren en meerdere platen, zoals celsortering inefficiënt kan zijn en leveren vele putjes zonder detecteerbare cel.

  1. Maak de bank, pipetten, buis rek, koude PCR-plaat houders, en handschoenen met DNA ontsmetting oplossing als voorbereiding op de PCR.
  2. Verdun de RNAse remmer 2,64 U / gl door het toevoegen van voorraad RNAse inhibitor om nuclease-vrij water in een 1,5 ml buis.
    Opmerking: Dit laat RNAse inhibitor de lysisbuffer toegevoegd zonder pipetteren sub-ul volumes.
  3. Voeg lysis buffer voor de cellen door combinatie van de in tabel 3 vermelde bestanddelen.
  4. Transfer 92,4 ul van de lysisbuffer van de cellen in een afzonderlijke buis; Dit zal de lysis buffer voor het amplicon normen.
  5. Met behulp van low-bindende pipetpunten en microcentrifugebuizen, bereiden 200 pl en 500 pl E. coli DNA verdund tot 3,1 pg / pl en 6,2 pg / pl respectievelijk met DNA suspensie buffer.
  6. Voeg 184,8 pi 3,1 pg / pl E. coli DNA aan de lysis buffer voor de cellen.
    OPMERKING: De E. coli DNA-drager dient om de omvang van niet-specifieke primer binding mogelijkheden verbreden en waardoor de waarschijnlijkheid dat primer dimerisatie leidt tot een PCR-product te verminderen.
  7. Bereid normen.
    1. Label zes low-bindend microcentrifugebuizen als 5e5, 5e4, ... 5e0.
    2. Voeg 90 pl DNA suspensie buffer van "5e5" tube.
    3. Voeg 90 ul van 6,2 pg / pl E. coli DNA aan elk van de vijf andere buizen. Houd alle buizen op ijs.
      OPMERKING: Integratie carrier DNA in de normen maakt de totale massa van DNA in de standaard putjes vergelijkbaar met die in de 1-cel wells; Dit vermindert de probability dat de concentratie van normen worden beïnvloed door DNA te binden aan buizen of pipetpunten.
    4. Neem een monster van het "5E6" standaard (5 x 10 6 moleculen / ul van elke amplicon, bereid in stap 1,4) uit opslag. Kort vortexen en spin kort (5 sec bij 500 xg), zodat de vloeistof op de bodem van de buis.
    5. Met behulp van een low-bindende pipet, voeg 10 ul van 5E6 norm aan de "5e5" tube. Vortex kort, rotatie (5 sec bij 500 xg), en zet de slang terug op het ijs.
    6. Pipet 10 ul van de "5e5" buis in de "5e4" tube. Vortex kort, rotatie (5 sec bij 500 xg), en weer op het ijs.
    7. Herhaal deze seriële verdunningen, waarbij elke buis ontvangt 10 gl van de vorige buis, totdat alle buizen een verdunning van standaard.
  8. Bereid een rij van 12 PCR buizen met doppen. Verdeel 67 ui "cel" lysis buffer aan elke buis. Cap de buizen en spin down kort (5s bij 500 xg) indien nodig.
  9. Met behulp van een 12-kanaals pipet, distribueren 9 pl "cel" lysisbuffer uit de rij van PCR buizen in elk putje van de eerste 7 rijen van een PCR-plaat (figuur 3).
  10. Verdeel 7 pl "standaard" lysis buffer aan elk putje van de laatste rij van de plaat (figuur 3).
  11. Door lage bindende pipetpunten, voeg 2 ul standaard aan elk putje van de onderste rij volgens de plaat kaart (Figuur 3).
    LET OP: 2 pi van 5 x 10 0 moleculen / ul norm bedraagt 10 moleculen, enz.
  12. Voeg 2 pl 3,1 pg / pl E. coli DNA in het 10-cellen en 100-cellen putjes; Voeg 2 pi 6,2 pg / pl E. coli DNA in de niet-celputjes.
    Opmerking: Elke 1-cel, 10-cellen en 100-cel en 6,2 pg E. coli DNA, benadert de massa van genomisch DNA in een menselijke cel. Elke standaard en no-cel en heeft 12,4 pg of E. coli DNA, ongeveer twee menselijke cellen waard.
  13. Dicht de plaat met een steriele thermische afdichting, rotatie gedurende 5 sec bij 500 xg en bewaar bij 4 ° C totdat de cellen klaar voor het sorteren.

4. Cell Sorter Setup

  1. Programmeer de fluorescentie geactiveerde cel sorteerder sorteren in een 96-wells plaat volgens de plaat kaart (Figuur 3); geen cellen worden gesorteerd in putten H1-H8 of H11-H12.
  2. Controleer of de cel sorter goed is gericht voor het sorteren in een PCR-plaat.
    1. Stel de hoek van het soort stroom zo gering mogelijk; Deze instelling vergroot de kans dat de cellen worden gesorteerd naar de bodem van putjes plaats raken de zijkanten.
    2. Om de machine te richten, te verzegelen een lege PCR-plaat en het gebruik van de test stroom op 'sort' druppels PBS op het zegel van de lege plaat, volgens de instructies van de machine 19; de druppels zal landen op the oppervlak van de afdichting op een positie boven het midden van de put. Voor het beste resultaat, controleert het doel over de lengte en de breedte van de plaat.
    3. Als de druppels niet te landen op de juiste plaats, veeg ze van het oppervlak van de afdichting, opnieuw te kalibreren de cel sorter volgens de instructies van de machinefabrikant, en herhaal tot de druppels in het soort stroom correct worden afgezet.

5. Cell Harvest en sorteren

  1. Trypsinize de cellen afhankelijk van de cellijn. Bijvoorbeeld, voor MCF-7 cellen, zuig het medium uit de cellen Spoel de cellen met 1 ml 0,05% trypsine en incubeer de cellen met 2 ml 0,05% trypsine gedurende 5 minuten bij 37 ° C en 5% CO 2 .
  2. Voeg 8 ml celkweekmedium de getrypsiniseerd cellen en de overdracht van alle 10 ml celsuspensie aan een 15 ml buis. Centrifugeer gedurende 4 min bij 400 x g.
  3. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in PBS + 2% FBS.
    LET OP: Een kleinere resuspensie volume concentreert de cellen en vergemakkelijkt celsortering; een 500 ul resuspensie volume werkt goed voor een 6 cm schaaltje cellen bij 50% confluentie.
  4. Breng de celsuspensie aan een 5 ml flowcytometrie buis pipetteren door een 40 urn filter om klompjes cellen te verwijderen.
  5. Centrifugeer de plaat lysisbuffer bij 400 g gedurende 30 seconden bij 4 ° C voor het sorteren van de cellen zodat de vloeistof op de bodem van de putjes.
  6. Plaats de buis met de celsuspensie in de cel sorteerder. Open de afdichting op de plaat lysisbuffer en zorgvuldig sorteren van de cellen van belang in de plaat volgens de plaat kaart en de instructies van de fabrikant celsorteerinrichting 19. Om ervoor te zorgen dat de afzonderlijke cellen worden gesorteerd op de maximale zuiverheid, voert u de machine in "single cell" mode en gebruik maken van standaard flowcytometrie venstertijd gebaseerd op voorwaartse en zijwaartse verstrooiing 19.
    LET OP: In devoorbeeldexperiment, poort de cellen op basis van p53-Venus fluorescentie isoleren helderste 15% van de individuele cellen 11.
  7. Verzegel de plaat met een nieuw, steriel thermische afdichting en centrifugeer bij 400 xg gedurende 1 min bij 4 ° C. Plaats de plaat in de thermische cycler en voer het RTSTA programma (zie stap 1.7).
    LET OP: Deze voert reverse transcriptie van het mRNA uit de gesorteerde cellen en versterkt het cDNA van de transcripten van belang.

6. exonucleasebehandeling

  1. Meng verdund exonuclease I combineren van de in tabel 4 vermelde bestanddelen. Bereid een rij van 12 PCR buizen met doppen. Verdeel 30,5 ul van verdunde exonuclease I in elke buis. Cap de buizen en spin kort (5 sec bij 500 xg), zodat de vloeistof op de bodem van de buis.
  2. Wanneer de RTSTA klaar is, draai het monster plaat gedurende 5 sec bij 500 x g. Met behulp van een 12-kanaals pipet, distribueren 3,6 gl verdunde exonucleaseIk in elk putje van de plaat.
  3. Sluit de plaat met een steriele thermische afdichting en draai kort (5 sec bij 500 xg). Plaats de plaat in de thermische cycler en voer het EXOI programma (zie stap 1.7).
    OPMERKING: Deze stap degradeert elke primers overblijft na een specifieke doelgroep versterking, zodat ze niet zal bemoeien met de toekomstige PCR.

7. Monsterverdunning

  1. Wanneer de exonuclease behandeling is voltooid, voeg 32,4 ul TE-buffer aan elk putje van de monsterplaat; Dit is een optionele stopplaats, en samples gedurende enkele dagen bewaard bij -20 ° C.

8. Sort Quality Control Met behulp van qPCR

Opmerking Omdat celsortering niet perfect efficiënt Deze stap is noodzakelijk om te bepalen welke putjes van de plaat gesorteerde eigenlijk een cel ontvangen. Deze monsters kunnen dan worden gebruikt voor verdere analyse.

  1. Meet de huishouding genexpressie in elk monster door qPCR.
    1. Bereid 900 pi DNA bindende kleurstof qPCR master mix voor 96 reacties volgens het protocol gebruik van primers van de polymerase fabrikant voor een van de housekeeping genen geselecteerd in stap 1.1; de exacte concentratie reactiebuffer, polymerase, primers, enz. Voor deze omzetting is afhankelijk van de specifieke gebruikte polymerase.
    2. Verdeel 9 pi master mix aan elk putje van een 96-well PCR-plaat. Voeg 1 pl monster van de monsterplaat het overeenkomstige putje van de PCR-plaat.
    3. Voer de plaat op een real-time PCR machine met behulp van een thermische cycli protocol door de fabrikant master mix voorgesteld of volgens een standaard protocol 20.
  2. Analyseer de qPCR gegevens 20; Een voorbeeld van qPCR data van het soort kwaliteitscontrole stappen hieronder wordt getoond in figuur 4.
    1. Controleer of de metingen van de no-cel putten vertonen een laag (achtergrond) niveauvan genexpressie of geen expressie helemaal.
    2. Controleer of metingen van 1-cel putjes verdelen duidelijk in twee groepen: positieve monsters met hoge genexpressie en negatieve monsters met achtergrondniveaus van expressie of geen expressie helemaal, vergelijkbaar met de niet-celputjes.
      LET OP: De monsters met een hoge genexpressie vertegenwoordigen werkelijke gesorteerde cellen; mensen met een achtergrond expressie moeten worden uitgesloten van verdere analyse.
    3. Controleer of metingen van de 10-cellen en 100-cellen putjes tijdens genexpressie hoger dan in de positieve wells 1-cel, waardoor de mogelijkheid dat inefficiënte sortering kunnen veroorzaken die putten minder cellen dan gewenst.
    4. Controleer dat de metingen van de standaard putten gelijkmatig verdeeld zijn in logaritmische ruimte (dat wil zeggen, dat de C t waarde gelijkelijk verdeeld zijn).
  3. Na het identificeren van alle positieve 1-cel monsters, maak een "Sample Mixes" plaat kaart om positieve 1-ce kaartll monsters naar een nieuwe 96-well plaat. Bestaat uit acht putten voor normen op deze plaat kaart. Zie figuur 5 voor een voorbeeld.

9. Gene Expression meting met behulp van microfluïdische qPCR

LET OP: Voor elke stap in deze sectie, pipet alleen voor de eerste stop om de vorming van bellen in de reagentia te minimaliseren.

  1. Open een rij van 8 buisjes PCR. Als er meerdere platen van de monsters, het openen van een tweede rij van 8 PCR-buizen en label de buizen 1-8. Deze rij zal zijn voor het bundelen van de normen van meerdere platen.
  2. In een 1,5 ml tube, meng 360 pi van DNA-bindende kleurstof qPCR master mix met 36 ul van DNA-bindende kleurstof monster laden reagens. Vortex kort en draaien voor 10 sec bij 2.000 x g. Verdeel het mengsel (396 pi) in de ongelabelde PCR rij van 8 buisjes, plaatsen 48 pl in elke buis.
  3. Onder toepassing van een 8-kanaals pipet, verdelen 3,3 ul van de master mix / monster laden reactiemengsel in elk putjevan een nieuwe 96-well PCR plaat. Label deze plaat, "Sample Mixes."
  4. Voor elke PCR plaat monsters:
    1. Vortex de plaat gedurende 10 sec en centrifugeren gedurende 10 sec bij 500 x g. Verwijder het deksel en breng 2,7 pi van elke positieve 1-cel monster de bijbehorende goed op de Sample Mixen plaat voor de 1-cel putten aangegeven op het bord kaart.
    2. Als er slechts één plaat van monsters, overdracht 2,7 pi van elke geamplificeerde standaard zijn corresponderende goed op Sample mixt Bevestigingsplaat volgens de plaat kaart.
    3. Als er meerdere platen monsters, overdracht 2,7 pi van elke geamplificeerde standaard zijn overeenkomstige positie in de rij gelabelde PCR buizen. standaarden toe te voegen van de huidige plaat van monsters aan alle normen er al. Seal de plaat van de monsters bij gedaan met behulp van een afsluitende film.
  5. Als er meerdere borden van monsters:
    1. Vortex de rij van PCR-buisjes met normen voor10 sec en draaien voor 10 sec bij 2.000 x g. Transfer 2,7 pi van elke buis van gemengde normen in de overeenkomstige goed op de Sample Mixen plaat volgens de plaat kaart.
  6. Laad de NTC putten met 2,7 ul van nuclease-vrij water, waar aangegeven op het bord kaart. Sluit de Sample Mixen plaat en bewaar bij 4 ° C totdat het nodig is.
  7. Schil de sticker van de bodem van een nieuwe microfluïdische chip qPCR. Met behulp van een injectiespuit van de controle lijn vloeistof met de dop nog op, duw elke accumulator voorjaar om het los te maken, en injecteer elke accumulator met 150-200 ul van controle lijn vloeistof.
  8. Plaats de chip in het laden machine en voer de "Prime" script. Dit duurt ~ 20 minuten.
  9. Wanneer priming wordt gedaan, vortex en spin down de platen van assay mixen (bereid in stap 1.6) en sample mixen.
  10. Onder toepassing van een 8-kanaals pipet 4,5 ul van elk testmengsel in de linkerkant van de microfluïdische chip qPCR volgens het schema in g> Figure 6. Pipet zeer zorgvuldig te voorkomen dat luchtbellen onder aan de putjes. Wanneer u klaar bent, sluit de plaat van assay mixen en bewaar bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.
  11. Transfer 4,5 pi van elk monster mengsel naar de rechterkant van de microfluïdische chip qPCR volgens figuur 6. Plaats de chip in de laden machine en voer de "Laad Mix" script. Dit duurt ~ 90 minuten.
  12. Schakel de microfluïdische real-time PCR machine, start het verzamelen van gegevens software, en zet de lamp om het op te warmen. Dit duurt ~ 20 minuten.
  13. Wanneer de belasting Mix script wordt uitgevoerd, controleert u of er geen lijnen over de chip-dit zou een laad probleem aan te geven. Verwijder zorgvuldig eventuele stofdeeltjes uit de chip met behulp van Scotch tape of lab tape. Plaats de chip in de microfluïdische real-time PCR-machine en voer het verzamelen van gegevens script. Gebruik de analyse software om de resultaten te inspecteren en de gegevens exporteren voor verdere analyse.
_title "> 10. Gegevensanalyse

  1. Verwijder de metingen waarvoor de qPCR amplificatie curven slechte kwaliteit (dat wil zeggen, waarbij de curven niet de standaard sigmoïdale amplificatiecurve lijken) 20.
  2. Verwijderen monsters met meer dan 30 slechte kwaliteit of nul metingen of waarvoor housekeeping genexpressie (zie stap 1,1) veel lager is dan de meeste andere monsters (Figuur 7).
  3. Voor elk gen, schat de juiste smeltpiek locatie als de mediaan van de smelt pieklocaties uit elk monster. Als een meting heeft een smelt piek op meer dan 1 ° C van de mediaan, verwijder die meting uit overweging 20.
  4. Voor elk gen, het creëren van een standaard curve aan het mRNA telling in elk monster met behulp van een spreadsheet of scripttaal 20 te schatten.
    OPMERKING: De normen in dit experiment uit 10, 100, 1000 of 10.000 moleculendsDNA overeenkomt met elk transcript plaats. Als reverse transcriptie perfect efficiënt waren, zou de normen overeenkomen met 20, 200, 2000 en 20.000 moleculen mRNA, aangezien mRNA en cDNA enkelstrengs. In de praktijk is dit niet het geval, dus uitdrukken metingen een schatting in eenheden van moleculen x E RT, waarbij RT E is de efficiëntie van reverse transcriptie.
    1. Voor elke standaard en identificeren m, het aantal moleculen van ssDNA (tweemaal het aantal moleculen dsDNA) voor amplificatie (bijvoorbeeld 20 moleculen, 200 moleculen, etc.).
    2. Voor elke standaard goed, identificeren van de C t-waarde van qPCR 20.
    3. Met de waarden van m en t C, uitvoeren van een lineaire regressie met behulp van de volgende vergelijking met een standaard kromme met parameters a en b voor elk gen te genereren en bepaal de R2 waarde alsn indicator van de goedheid van fit:
      figure-protocol-1
    4. Van de standaard curve, bereken de PCR efficiëntie E voor elk gen:
      figure-protocol-2
      OPMERKING: De waarde E veel groter is dan 1,0 (bijvoorbeeld E> 1,1) is niet fysiek realistisch; een R2 waarde voor de lineaire regressie minder dan 1,0 (bijvoorbeeld, R 2 <0,985) betekent dat de normen niet betrouwbaar werken. Deze problemen algemeen aan dat de laagste amplicon standaard onder een drempel van betrouwbare kwantificering, en dus moeten de laagste standaard uit de lineaire regressie worden uitgesloten. Wanneer een bevredigende lineaire regressie niet mogelijk is met ten minste drie unieke normen, gooi de expressiemetingen voor het gen.
    5. Als de lineaire regressie voldoende Gebruik de resulterende fit parameters a en b </ em> voor elk gen van het aantal mRNA moleculen schatten m est (in eenheden van moleculen x E RT) van het overeenkomstige gen in elke eencellige monster uit de gemeten Ct waarde:
      figure-protocol-3
    6. Wijs een meting m est <1 als m est = 0. Ook wijzen een meting zonder versterking in qPCR en dus geen C t waarde m est = 0.
      OPMERKING: Metingen met m est lager dan de laagste of groter dan de hoogste norm in de regressie worden gevonden door extrapolatie van de standaardkromme. Deze schattingen zijn niet noodzakelijkerwijs ongeldig, maar moet met de nodige voorzichtigheid worden beschouwd.
  5. Visualiseer de single-cell genexpressie data.
    1. Maak een beeswarm perceel (Dorn, J. en de Heilige, T., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange / 37105) waarin elk punt is de genexpressie in een bepaalde cel; Een voorbeeld is getoond in figuur 8.
    2. Voeg een viool perceel (Dorn, J., 2012, http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/23661) waarin de breedte van de "viool" geeft de frequentie van expressiemetingen rond een bepaald niveau in de populatie cellen geanalyseerd; Een voorbeeld is getoond in figuur 8.
      OPMERKING: Meer geavanceerde analyse kunnen de verhoudingen in expressie tussen sonde genenparen 21, 22 en kan genexpressie netwerken afleiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een algemeen overzicht van het protocol wordt weergegeven in figuur 1, inclusief stappen voor celtherapie, het isoleren van afzonderlijke cellen door FACS, het genereren en pre-amplificatie van cDNA-bibliotheken van eencellige lysaten, de bevestiging van eencellige cDNA bibliotheken gesorteerde putten, en de meting van genexpressie door qPCR.

Ter voorbereiding van eencellige isolatie en genexpressie-analyse, i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben voorgesteld een werkwijze voor het isoleren van afzonderlijke zoogdiercellen van een populatie van hechtende cellen gekweekt in kweek en voor het testen van de expressie van ongeveer 96 genen in elke cel. Goede voorbereiding vooraf is essentieel voor deze methode goed te werken. Vooral ontwikkelen en testen primerparen die specifiek zijn voor de transcripten van belang (stap 1,2-1,3) tijdrovend maar belangrijke stappen, zoals de primers bepaalt de kwaliteit van de eencellige metingen. Zodra betrouwbare primerp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen graag bedanken V. Kapoor in de CCR ETIB Flow Cytometry Core voor haar hulp bij het uitvoeren van de cel sortering tijdens de ontwikkeling van dit protocol. We danken ook M. Raffeld en de CCR LP Moleculaire Diagnostiek Unit en J. Zhu en de NHLBI DNA Sequencing and Genomics Core voor hun hulp bij het uitvoeren van de qPCR tijdens de ontwikkeling van dit protocol. Dit onderzoek werd ondersteund door de Intramurale Program van de NIH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase InhibitorThermoFisher4374966
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabsM0530S
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay KitThermoFisherQ33120 
2.0 ml low adhesion microcentrifuge tubesUSA Scientific1420-2600
DNA Suspension BufferTeknovaT0221
Axygen 0.2 ml Maxymum Recovery Thin Wall PCR TubesCorningPCR-02-L-C
GE 96.96 Dynamic Array DNA Binding Dye Sample & Assay Loading Reagent KitFluidigm100-3415
HyClone RPMI 1640 mediaGE Healthcare Life SciencesSH30027.01
Fetal Bovine Serum, Certified (US)ThermoFisher16000-044
Antibiotic-Antimycotic SolutionCorning30-004-CI
NeocarzinostatinSigmaN9162
ELIMINaseDecon Labs1101
SUPERase-InThermoFisherAM2696
CellsDirect One-Step qRT-PCR KitThermoFisher11753500
E. coli DNAAffymetrix14380 10 MG
ThermalSeal Sealing Film, SterileExcel ScientificSTR-THER-PLT
BD FACSAria IIuBD Biosciences
HyClone Trypsin 0.05%GE Healthcare Life SciencesSH30236.01
PBS, 1xCorning21-040-CV
Falcon 40 µm Cell StrainerCorning352340
Exonuclease INew England BioLabsM0293S
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROXBio-Rad172-5210
96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (microfluidic qPCR chip)FluidigmBMK-M-96.96
IFC Controller HX (loading machine)Fluidigm
BioMark or BioMark HD (microfluidic qPCR machine)Fluidigm
Real-Time PCR Analysis software Fluidigm
MATLAB softwareMathWorks

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feinerman, O., Veiga, J., Dorfman, J. R., Germain, R. N., Altan-Bonnet, G. Variability and Robustness in T Cell Activation from Regulated Heterogeneity in Protein Levels. Science. 321 (5892), 1081-1084 (2008).
  2. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  3. Geva-Zatorsky, N., Rosenfeld, N., et al. Oscillations and variability in the p53 system. Mol. Syst. Biol. 2 (1), (2006).
  4. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
  5. Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of Transcriptional Bursting in Bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
  6. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biol. 4 (10), e309+(2006).
  7. Senecal, A., Munsky, B., et al. Transcription Factors Modulate c-Fos Transcriptional Bursts. Cell Rep. 8 (1), 75-83 (2014).
  8. Dey, S. S., Foley, J. E., Limsirichai, P., Schaffer, D. V., Arkin, A. P. Orthogonal control of expression mean and variance by epigenetic features at different genomic loci. Mol. Syst. Biol. 11 (5), 806+(2015).
  9. Dar, R. D., Razooky, B. S., et al. Transcriptional burst frequency and burst size are equally modulated across the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (43), 17454-17459 (2012).
  10. Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).
  11. Porter, J. R., Fisher, B. E., Batchelor, E. p53 Pulses Diversify Target Gene Expression Dynamics in an mRNA Half-Life-Dependent Manner and Delineate Co-regulated Target Gene Subnetworks. Cell Syst. 2 (4), 272-282 (2016).
  12. Lahav, G., Rosenfeld, N., et al. Dynamics of the p53-Mdm2 feedback loop in individual cells. Nat. Genet. 36 (2), 147-150 (2004).
  13. Levine, A. J., Oren, M. The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 749-758 (2009).
  14. Riley, T., Sontag, E., Chen, P., Levine, A. Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (5), 402-412 (2008).
  15. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinf. 13 (1), 134(2012).
  16. PCR Technologies: A Technical Guide. , Sigma-Aldrich. St. Louis, MO. (2014).
  17. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  18. Batchelor, E., Mock, C. S., Bhan, I., Loewer, A., Lahav, G. Recurrent initiation: a mechanism for triggering p53 pulses in response to DNA damage. Mol. Cell. 30 (3), 277-289 (2008).
  19. Flow Cytometry: Principles and Applications. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
  20. Real-time PCR. , Taylor & Francis. (2006).
  21. Song, L., Langfelder, P., Horvath, S. Comparison of co-expression measures: mutual information, correlation, and model based indices. BMC Bioinf. 13 (1), 328(2012).
  22. Margolin, A. A., Nemenman, I., et al. ARACNE: An Algorithm for the Reconstruction of Gene Regulatory Networks in a Mammalian Cellular Context. BMC Bioinf. 7 (Suppl 1), (2006).
  23. Haff, L. A. Improved quantitative PCR using nested primers. PCR Methods Appl. 3 (6), 332-337 (1994).
  24. Hashimshony, T., Senderovich, N., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biol. 17, 77(2016).
  25. Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073(2012).
  26. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  27. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nat. Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
  28. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat. Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FACS sorteringmicroflu dische qPCRabsolute transcriptkwantificatiecellysisbufferseri le verdunningRT STA programmaexonuclease I behandelingdata analyseprotocol

Gerelateerde artikelen