In de longen aanwezige immuuncellen, inclusief dendritische cellen (DC's) bij mensen, zijn cruciaal voor de verdediging tegen ingeademde ziekteverwekkers en allergenen. Echter, vanwege de schaarste aan menselijk longweefsel, zijn onderzoeken beperkt. Dit werk presenteert protocollen om humane mucosale endobronchiale biopten te verwerken voor het bestuderen van long-DC's met behulp van immunohistochemie en flowcytometrie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Human Lung dendritische cellen: ruimtelijke verdeling en fenotypische Identification in Endobronchiale biopten middels immunohistochemie en flowcytometrie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De longen worden voortdurend blootgesteld aan de externe omgeving, die naast onschadelijke deeltjes ook ziekteverwekkers, allergenen en toxines bevat. Om tolerantie te behouden of een immuunrespons te induceren, moet het immuunsysteem ingeademde antigenen op de juiste manier aanpakken. Longdendritische cellen (DC's) zijn essentieel om een delicaat evenwicht te behouden om immuniteit te initiëren wanneer dat nodig is, zonder bijkomende schade aan de longen te veroorzaken door een overdreven ontstekingsreactie. Hoewel er een gedetailleerd begrip is van het fenotype en de functie van immuuncellen zoals DC's in menselijk bloed, is de kennis van deze cellen in minder toegankelijke weefsels, zoals de longen, veel beperkter, omdat studies van menselijke longweefselmonsters, vooral van gezonde individuen, schaars zijn. Dit werk presenteert een strategie om een gedetailleerde ruimtelijke en fenotypische karakterisering van in de long verblijvende DC's in gezonde mensen te genereren die een bronchoscopie ondergaan voor de bemonstering van endobronchiale biopsieën. Er kunnen verschillende kleine biopsieën van elke persoon worden verzameld en vervolgens worden ingebed voor ultrafijne secties of enzymatisch worden verteerd voor geavanceerde flowcytometrische analyse. De beschreven protocollen zijn geoptimaliseerd om maximale informatie op te leveren uit kleine weefselmonsters die onder stabiele omstandigheden slechts een lage frequentie van DC's bevatten. Hoewel het huidige werk zich richt op DC's, kunnen de beschreven methoden direct worden uitgebreid om andere (immuun)cellen van belang in het mucosale longweefsel op te nemen. Bovendien zijn de protocollen ook direct toepasbaar op monsters verkregen van patiënten met longziekten waarbij bronchoscopie deel uitmaakt van het vaststellen van de diagnose, zoals chronische obstructieve longziekte (COPD), sarcoïdose of longkanker.
Inleiding
De longen zijn voortdurend in contact met de buitenomgeving en zijn zeer gevoelig voor zowel onschadelijke deeltjes en microben met het vermogen om ziekte te veroorzaken. Daarom is het essentieel voor het immuunsysteem potente immune responsen tegen binnendringende pathogenen te monteren, maar het is even belangrijk om tolerantie te behouden om geïnhaleerde antigenen die geen ziekte veroorzaken. Potente immune surveillance, wordt het ademhalingssysteem bekleed met een netwerk van immuuncellen, waaronder dendritische cellen (DCs). DCs zijn professionele antigeenpresenterende cellen met het unieke vermogen om naïeve T-cellen te activeren. In menselijke longen, resident....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
LET OP: Dit onderzoek werd in Umeå, Zweden goedgekeurd door de regionale Ethical Review Board.
1. bronchoscopie monstername Endobronchiale biopten van Mensgebonden
- Verkrijgen geïnformeerde toestemming van alle deelnemers.
- Behandel patiënten met orale midazolam (4-8 mg) en intraveneuze glycopyrronium (0,2-04 mg) 30 minuten vóór de bronchoscopie. Solliciteer lokale verdoving met lidocaïne in het strottenhoofd en de bronchiën. Dat het onderwerp gorgelen met ~ 3 ml lidocaine 4% en 3 ml van toepassing op de tong basis en in het strottenhoofd via een injectiespuit strottenhoofd. Optimaliseer de lokale anesthesie met 8-10 do....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Studies karakteriseren ademhalingssysteem weefsel-resident immuuncellen, zoals DCs, beperkt, voornamelijk vanwege het feit dat operatief verwijderd of volledig menselijk longweefsel schaars. Hier, een minder invasieve werkwijze voor het verkrijgen van longweefsel endobronchiale biopsies (EBB) van gezonde vrijwilligers en ontwikkelde protocollen bij de immuuncellen in het weefsel cytometrie studie gebruikt immunohistochemie of flow geschetst.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit document beschrijft hoe u een gedetailleerde ruimtelijke en fenotypische karakterisatie van longweefsel-ingezeten DCs bij gezonde mensen te genereren met behulp van immunohistochemie en flowcytometrie op endobronchiale mucosale biopten tijdens bronchoscopie verzameld. In de volgende paragrafen kritische stappen in het protocol worden in detail besproken.
Kritische Stappen met het Protocol
Snijden en immunohistochemie: Het is cruciaal om de biopsie blokken bij -2.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag de vrijwilligers die klinisch materiaal hebben bijgedragen aan dit onderzoek bedanken. We zijn ook dankbaar voor het personeel van het ministerie van Volksgezondheid en Clinical Medicine, Division of Medicine / Respiratory Medicine, University Hospital, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) voor het verzamelen van alle klinische materiaal.
Dit werk werd ondersteund door subsidies aan AS-S van de Zweedse Research Council, de Zweedse Hart-Lung Foundation, de Zweedse Stichting voor Strategische Research, en het Karolinska Institutet.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bronchoscopie | |||
| Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
| Lichtbron | Olympus | Exera CV-160 | |
| Fenestreerbare forceps | Olympus | FB21C | Wordt gebruikt om biopten te nemen |
| Bite Block | Conmed | 1429 | 20 mm x 27 mm |
| Glucose 25% | 500 ml intraveneus | ||
| Glycopyrroniumbromide 0,2 mg/ml | Intraveneus. Voorkomt afscheiding van slijm/speeksel | ||
| Mengsel Midazolam 1 mg/ml p.o | Kan worden gebruikt voor extra ontspanning | ||
| Lidocaine, 40 mg/ml | Mond en keel toediening / Gegargeld | ||
| Lidocaine 100 mg/ml spray | Toegediend aan de achterkant van de keel | ||
| Lidocaine 20 mg/ml spray | Toegediend via bronchoscoop aan de luchtwegen | ||
| GMA verwerking en inbedding | |||
| Glazen flacons | 5 ml | ||
| Aceton | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
| Moleculaire zeefjes, 4 Å | Alfa Aesar | 88120 | 3-4 mm diameter pellets |
| Fenylmethysulfonylfluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0,035 g/100 ml aceton |
| Iodoacetamid | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0,37 g/100 ml aceton |
| Polyethyleen-plat TAAB inbedding capsules | TAAB laboratoria | C094 | 500x 8 mm diameter, polyethyleen, platte bodem capsules |
| Capsule houder | TAAB laboratoria | C054 | Houdt 25 8 mm capsules |
| JB-4 GMA inbeddingskit | Polysciences | 00226 | Bevat JB-4 oplossing A (0026A-800), JB-4 oplossing B (0026B-3.8), benzoylperoxide (02618-12) |
| Methylbenzoaat | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
| Silica gel met vochtindicator | Scharlau | GE0043 | 2,5-6 mm |
| GMA sneden | |||
| Glazen microscoopglazen | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Gesneden randen, gefroste eind |
| Poly-L-Lysine oplossing | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 voor werkoplossing |
| Glazen stripjes voor ultramicrotomie | Alkar | ||
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wasoplossing (0,1% Tween20) |
| LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
| Capsule splitter | TAAB laboratoria | C065 | |
| Koolstofstaal enkelzijdige mesjes | TAAB laboratoria | B054 | |
| Vijzel | |||
| Ammoniak, 25% | VWR | 1133.1000 | 2 ml in 1 L, 1:500 (0,05%) |
| Microtoom | Leica | Leica RM 2165 | |
| Lichtbron | Leica | Leica CLS 150 XE | |
| Microscoop met zwenkstandaard | Leica | Leica MZ6 | |
| GMA Immunohistochemie | |||
| Diamantpunt pen | Histolab | 5218 | |
| Waterstofperoxide 30% oplossing | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
| Natriumaziet | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Tris | Roche | 10708976001 | |
| Natriumchloride | VWR chemicaliën | 27810.295 | |
| Rundserumalbumine | Millipore | 82-045-2 | Probumine BSA diagnostische kwaliteit |
| Dulbecco's aangepast arendsmedium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Anti-menselijke CD45 antilichaam | BioLegend | 304002 | Muis monoklonaal, klon HI30, isotype IgG1k. Werkconcentratie van 500 ng/ml |
| Anti-menselijke CD1a antilichaam | AbD Serotech | MCA80GA | Muis monoklonaal, klon NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Werkconcentratie van 10 µg/ml |
| Muis monoklonaal IgG1 isotype controle | Abcam | ab27479 | |
| Muis monoklonaal IgG2a isotype controle | Dako | X094301-2 | |
| Vectastain ABC Elite standaardkit | Vector Labs | PK-6100 | |
| AEC (3-amino-9-ethylcarbazool) peroxidase substraat kit | Vector Labs | SK-4200 | |
| Mayers hematoxyline | HistoLab | 01820 | |
| Permanent Aqueous Montage Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
| Droogoven | |||
| DPX permanente montageoplossing | VWR | 360292F | |
| Lichtmicroscoop | Leica | Leica DMLB | |
| Microscoopcamera | Leica | Leica DFC 320 | |
| Analysesoftware | Leica | Leica Qwin V3 | |
| Enzymatische vertering | |||
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Collageenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Forceps | |||
| Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
| 50 ml conische buizen | Falcon | 14-432-22 | |
| 40 | |||
Referenties
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
