Human Lung dendritische cellen: ruimtelijke verdeling en fenotypische Identification in Endobronchiale biopten middels immunohistochemie en flowcytometrie

Samenvatting

In de longen aanwezige immuuncellen, inclusief dendritische cellen (DC's) bij mensen, zijn cruciaal voor de verdediging tegen ingeademde ziekteverwekkers en allergenen. Echter, vanwege de schaarste aan menselijk longweefsel, zijn onderzoeken beperkt. Dit werk presenteert protocollen om humane mucosale endobronchiale biopten te verwerken voor het bestuderen van long-DC's met behulp van immunohistochemie en flowcytometrie.

Samenvatting

De longen worden voortdurend blootgesteld aan de externe omgeving, die naast onschadelijke deeltjes ook ziekteverwekkers, allergenen en toxines bevat. Om tolerantie te behouden of een immuunrespons te induceren, moet het immuunsysteem ingeademde antigenen op de juiste manier aanpakken. Longdendritische cellen (DC's) zijn essentieel om een delicaat evenwicht te behouden om immuniteit te initiëren wanneer dat nodig is, zonder bijkomende schade aan de longen te veroorzaken door een overdreven ontstekingsreactie. Hoewel er een gedetailleerd begrip is van het fenotype en de functie van immuuncellen zoals DC's in menselijk bloed, is de kennis van deze cellen in minder toegankelijke weefsels, zoals de longen, veel beperkter, omdat studies van menselijke longweefselmonsters, vooral van gezonde individuen, schaars zijn. Dit werk presenteert een strategie om een gedetailleerde ruimtelijke en fenotypische karakterisering van in de long verblijvende DC's in gezonde mensen te genereren die een bronchoscopie ondergaan voor de bemonstering van endobronchiale biopsieën. Er kunnen verschillende kleine biopsieën van elke persoon worden verzameld en vervolgens worden ingebed voor ultrafijne secties of enzymatisch worden verteerd voor geavanceerde flowcytometrische analyse. De beschreven protocollen zijn geoptimaliseerd om maximale informatie op te leveren uit kleine weefselmonsters die onder stabiele omstandigheden slechts een lage frequentie van DC's bevatten. Hoewel het huidige werk zich richt op DC's, kunnen de beschreven methoden direct worden uitgebreid om andere (immuun)cellen van belang in het mucosale longweefsel op te nemen. Bovendien zijn de protocollen ook direct toepasbaar op monsters verkregen van patiënten met longziekten waarbij bronchoscopie deel uitmaakt van het vaststellen van de diagnose, zoals chronische obstructieve longziekte (COPD), sarcoïdose of longkanker.

Inleiding

De longen zijn voortdurend in contact met de buitenomgeving en zijn zeer gevoelig voor zowel onschadelijke deeltjes en microben met het vermogen om ziekte te veroorzaken. Daarom is het essentieel voor het immuunsysteem potente immune responsen tegen binnendringende pathogenen te monteren, maar het is even belangrijk om tolerantie te behouden om geïnhaleerde antigenen die geen ziekte veroorzaken. Potente immune surveillance, wordt het ademhalingssysteem bekleed met een netwerk van immuuncellen, waaronder dendritische cellen (DCs). DCs zijn professionele antigeenpresenterende cellen met het unieke vermogen om naïeve T-cellen te activeren. In menselijke longen, resident DC treedt een antigeen en vervolgens verwerken en transporteren deze naar de long-drainerende lymfeknopen voor presentatie aan en activering van T-cellen ^{1, 2, 3.}

In het menselijke immuunsysteem, kan DCs worden onderverdeeld in verschillende subgroepen, met Distinct maar overlappende functies: cd1c ⁺ en CD141 ⁺ myeloïde DCs (MDCs) en CD123 ⁺ plasmacytoide DCs (PDC's) ^{4, 5.} Terwijl de meest gedetailleerde kennis over humane DCs afkomstig uit studies in bloed, is het nu duidelijk dat de menselijke longen ook haven zeldzame populaties van DC subsets met T-cel stimulerende capaciteit ^{6, 7, 8, 9.} Echter, accumuleren gegevens blijkt dat immuuncellen, zoals DCs verschillen in frequentie, fenotype en functie afhankelijk van de anatomische locatie ^10. Derhalve is het belangrijk om immuuncellen bestuderen van de desbetreffende weefsel hun bijdrage aan lokale immuniteit en tolerantie begrijpen. Bij elkaar genomen, dit onderstreept de noodzaak om long-resident DCs studeren bij de aanpak van longziekten, ondanks het bloed DC's die meer direct beschikbaar en toegankelijk bij mensen.

De eerste studies die long-DCs resident bij mensen onderzocht zich primair op morfologie en de expressie van één markers, zoals HLA-DR en CD 11 c, in weefselsecties middels immunohistochemie ^{11, 12, 13.} Daarentegen recentere studies doorgaans gebruikt flowcytometrische analyses verschillende immuuncelsubklassen bestuderen. Aangezien het moeilijk is om een ​​celoppervlak marker die uniek identificeert een bepaald DC deelverzameling vinden potentiële beperking van studies die alleen vier kleuren flowcytometrie is het risico van het opnemen celpopulaties met gelijke fenotypische markers als DCs. Zo wordt CD11c uitgedrukt op alle myeloïde DC en de meeste monocyten. Anderzijds, in studies toepassing geavanceerdere flowcytometrie panelen werden goedaardige longweefsel van chirurgische resectie patiënten typisch gebruiktxref "> ^{10, 14, 15, 16,} hoewel het onduidelijk is of deze zeldzame populaties werkelijk representatief DCs bij gezonde proefpersonen. Kortom, zijn studies grotendeels beperkt door het feit dat operatief verwijderd of volledig menselijk longweefsel schaars.

Om een ​​aantal van deze beperkingen te overwinnen, dit werk wordt beschreven hoe u een gedetailleerde analyse van de ruimtelijke verdeling en een fenotypische identificatie van DCs in mucosale endobronchiale biopsieën verkregen bij gezonde vrijwilligers die een bronchoscopie ondergaan, uit te voeren. Verschillende kleine biopten kunnen worden verzameld van elk individu en vervolgens kan worden ingebed voor het snijden en analyse met behulp van immunohistochemie of enzymatisch verteerd voor geavanceerde flowcytometrische analyse. Via long weefsel in de vorm van endobronchiale biopsieën verkregen bronchoscopies verleent het voordeel dat het mogelijk de st voerenUdy op gezonde vrijwilligers, anders dan open chirurgie van de longen die voor de hand liggende redenen, is beperkt tot patiënten die thoracale chirurgie. Bovendien het weefsel dat wordt bemonsterd tijdens een bronchoscopie van gezonde vrijwilligers fysiologisch normaal, in tegenstelling tot een niet-getroffen gebied van longweefsel bij patiënten met een longziekte. Anderzijds, de biopsieën zijn klein en het aantal cellen teruggehaald, zelfs als pooling meerdere biopten, beperkt het soort analyses kunnen worden uitgevoerd.

Hoewel de huidige werk richt zich op DCs, de beschreven kan direct worden uitgebreid methoden om andere (immuun) cellen van belang dat in het menselijk mucosale longweefsel wonen bevatten. Bovendien zijn de protocollen zijn ook direct van toepassing op monsters verkregen van patiënten die lijden aan pulmonaire ziekten waarbij bronchoscopie hoort bij stellen van de diagnose, zoals chronische obstructieve longziekte (COPD), sarcoïdose, of longkanker.

Protocol

LET OP: Dit onderzoek werd in Umeå, Zweden goedgekeurd door de regionale Ethical Review Board.

1. bronchoscopie monstername Endobronchiale biopten van Mensgebonden

1. Verkrijgen geïnformeerde toestemming van alle deelnemers.
2. Behandel patiënten met orale midazolam (4-8 mg) en intraveneuze glycopyrronium (0,2-04 mg) 30 minuten vóór de bronchoscopie. Solliciteer lokale verdoving met lidocaïne in het strottenhoofd en de bronchiën. Dat het onderwerp gorgelen met ~ 3 ml lidocaine 4% en 3 ml van toepassing op de tong basis en in het strottenhoofd via een injectiespuit strottenhoofd. Optimaliseer de lokale anesthesie met 8-10 doses van lidocaïne spray. Voer deze stap met het onderwerp zitten.
3. Steek een flexibele video bronchoscoop via de mond via een plastic mondstuk met het onderwerp in rugligging. Gebruik een speciaal gemaakte nevel katheter de topische anesthesie van het distale trachea en bronchi via de bronchoscoop voltooien. Hier gebruikt een dosis van ongeveer5-10 ml lidocaïne 2%.
4. Neem 6-9 endobronchiale mucosale biopsies van de hoofdcarina en de belangrijkste bronchiale divisies met behulp gefenestreerde pincet (Figuur 1). Naar aanleiding van de bronchoscopie en voor het verlaten van het ziekenhuis, laat het onderwerp rust voor 2-4 uur en hem / haar met een lichte maaltijd.

2. Inbedding de biopten in Glycol methacrylaat (GMA) Resin

NB: De GMA immunokleuring protocol werd oorspronkelijk bij Southampton University, histochemie Research Unit ¹⁷ ontwikkeld.

1. Fixatie: Voor immunohistochemie, verwijder de biopten van de tang en plaats ze direct in glazen flesjes met 3 ml ijskoude gedehydrateerd aceton en proteaseremmers (fenylmethylsulfonylfluoride (35 mg / 100 ml aceton) en joodaceetamide (370 mg / aceton 100 ml )). Fix het weefsel gedurende de nacht bij -20 ° C (figuur 2).
   OPMERKING: De volgende stappen moeten worden performed in een zuurkast met geschikte nitril. De inbedding kit bevat componenten die overgevoeligheid, irritatie en / of allergische huidreacties kan veroorzaken. Al het afval moet worden afgevoerd als gevaarlijk afval.
2. Uitdroging: Verwijder de aceton met remmers en vervangen door verse gedroogde aceton (zonder inhibitoren) gedurende 15 min bij kamertemperatuur (RT). Verwijder het aceton en vervangen door methylbenzoaat gedurende 15 min.
3. Infiltratie: Bereid een werkoplossing van 5% methylbenzoaat oplossing glycol methacrylaat monomeer; 10 ml is voldoende voor een flesje. Kunststofleidingen Pasteur pipetten, afzuigen van de oplossing methylbenzoaat en vervangen door 3 ml behandelingsoplossing. Incubeer de biopten en overmaat behandelingsoplossing bij 4 ° C gedurende 2 uur; Pasteur pipetten kan worden bij alle volgende oplossing veranderingen, waaronder inbedding oplossing.
4. Ruil de verwerking oplossing om de 2 uur (3x 2 uur incubatie), zodat de totale infiltratie tijd van de biopsies in de behandelingsoplossing ten minste 6 uur. Invoegpapier labels in het boveneinde van de inbedding capsules biopsies identificeren.
5. Bereid een inbedding oplossing van 75 mg benzoyl- peroxide in 10 ml methacrylaat monomeer. Voeg 0,25 ml N, N-dimethylaniline poly (ethyleenoxide) (gaspedaal) de inbedding oplossing om de polymerisatiereactie te starten. Verwijder de behandelingsoplossing en plaats een biopt in de desbetreffende inbedding capsule behulp van een tang.
6. Langzaam vult de inbedding capsule naar de top met het inbedden oplossing en sluit de dop. Vermijd de biopsie te verstoren en het creëren van grote luchtbellen. Incubeer de capsules bij 4 ° C totdat de hars volledig is gepolymeriseerd.
7. Bewaar de ingebedde biopsieën bij -20 ° C in een 50 ml buis met circa 5 g silicagel.

3. Opdeling van GMA-ingebedde Endobronchiale Biopsieën

1. Microscoop slide coating: Was de microscoop dia's in eenvaatwasser op een normale cyclus. Bedek de dia's en laat ze aan de lucht drogen.
2. Bereid een bekledingsoplossing van 10% poly-L-lysine (PLL) oplossing in gedestilleerd water. Dompel de dia's in coating-oplossing gedurende 5 minuten, en laat ze vervolgens aan de lucht drogen. Bewaar droge-PLL-gecoate glaasjes in hun originele dozen.
3. Wassen glasplaten stroken met 0,1% Tween 20 in gedestilleerd water. Spoel het glas met 70% ethanol en droog met keukenpapier. Geslepen glas bladen van de glazen strook met een mes maker. Bewaar de bladen in een container die beweging voorkomt dat de snijrand niet beschadigd of gekerfd.
4. Biopsie trimmen: Plaats de biopsie capsule in een capsule splitter en gekapt elke kant met behulp van een koolstof-staal single-edge mes. Verwijder de GMA-ingebedde biopsie en plaats deze stevig in een bankschroef. Trim overtollige GMA van rond de biopsie met behulp van de stalen blad.
5. GMA snijden.
   1. Bereid 0,05% ammonia-oplossing met gedestilleerd water. Plaats het glas mes en biopsie in the microtoom. Lijn de biopsie blok met het blad door aanpassing van de meshouder en de hoek van de biopsie blok zodat het blad plat rust tegen het oppervlak van het blok.
   2. Snijd 2 pm dikke secties met behulp van de microtoom op een langzame snijsnelheid en een tang om de overdracht en zweven hoofdstukken over de ammoniak water. Float de secties voor 45-90 sec, waardoor zachte antigen retrieval en ontvouwen van de sectie.
   3. Pick-up secties met microscoopglaasje. Controleer de biopsie histologie door snel te kleuren met toluidine blauw.
   4. Droog de objectglaasjes op een hete plaat ingesteld op 50 ° C en 500 pi gefilterde toluidine blauwkleuring toepassing op een gedeelte met een kunststof pasteurpipet. Verwarm de sectie op de hete plaat totdat er een groene ring begint te ontstaan ​​aan de rand van de vlek, en dan was het af met water.
   5. Met behulp van een lichtmicroscoop, controleer dan de biopsie histologie. Secties gebruikt voor immunohistochemie moeten goede gebieden van onbeschadigd lamina bevattenpropria en epitheel, met zo weinig klieren en slechts gladde spieren mogelijk.
   6. Zoals in paragraaf 3.4.2, gesneden secties die goed histologie hebben en pak ze met PLL-gecoate microscoopglaasjes voor immunohistochemische kleuring. Snijd ten minste twee secties van elke biopsie voor analyse. Droge dia ten minste 1 uur. Na het drogen kan secties in folie verpakt en tot 2 weken bewaard bij -20 ° C, of ​​zij kunnen direct worden immunostained.

4. Immunohistochemische kleuring van GMA-ingebedde Endobronchiale Biopsieën

OPMERKING: Natriumazide is giftig. Bereid de 0,1% natriumazide oplossing in een zuurkast en uit de buurt van zuren. Contact met zuren giftig gas.

1. Tekenen rond secties met behulp van een diamant getipt pen en schik de dia's op een kleuring rek.
2. Voer een Peroxidase blok. Bereid een peroxidase blok oplossing van 0,3% waterstofperoxide in 0,1% natriumazide oplossing. Apply 1 ml peroxidase blok secties en incubeer gedurende 30 minuten.
3. Bereid een wasoplossing van 0,05 M Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS), pH 7,6. Was de glaasjes in TBS, 3 x 5 min.
4. Bereid een 1% BSA in DMEM blokkeeroplossing. Doe dit op voorhand en in grote volumes, hoeveelheid en bevriezen totdat het nodig is. Giet de dia's en incubeer de secties in blok oplossing gedurende 30 minuten om niet-specifieke antilichamen te blokkeren bindend. Als aspecifieke binding nog steeds optreedt, omvatten een 30 min incubatiestap met 5% serum blok van dezelfde soort als het secundaire antilichaam.
5. Verdun primair antilichaam (CD45 of CD1a) in TBS met de gewenste concentratie (CD45 verdund bij 1: 1000; CD1a verdund op 1: 1,00) en deze toepassen op dia's. Coverslip de secties en incubeer overnacht bij RT.
6. Was de glaasjes in TBS driemaal. Verdun gebiotinyleerd secundair antilichaam (gericht tegen de primaire antilichaam gastheersoort, in casu konijnen anti-muizen F (ab _'2)) in TBS om de gewenste concentratie (1:300 verdunning) en deze toepassen op dia's. Incubeer gedurende 2 uur bij KT.
7. Bereid een streptavidine- biotine-peroxidase complex ten minste 30 minuten voor gebruik. Zorg ervoor dat er genoeg is om alle dia's te dekken. Was de glaasjes in TBS driemaal. Breng de oplossing van de glijbanen en incubeer gedurende 2 uur bij KT.
8. Was de glaasjes in TBS driemaal. Bereid 3-amino-9-ethylcarbazool (AEC) peroxidase substraatoplossing (gemaakt volgens de instructies van de fabrikant). Toepassen op de dia en incubeer gedurende 20-30 min of totdat de gewenste kleurintensiteit ontwikkelt.
9. Spoel de dia's in stromend water gedurende 5 minuten. Tegenkleuring de secties met gefilterde Mayer's hematoxyline oplossing gedurende 2 minuten. Was de dia's in stromend water gedurende 5 minuten.
10. Giet de dia's en hebben betrekking op de secties met permanente waterig montage medium. Droog de objectglaasjes bij 80 ° C in een droogoven. Laat de dia's om af te koelen, en vervolgens monteer ze met DPX en plaats een dekglaasje.

5. Staining Analyse

1. Analyseer de secties 40x vergroting met behulp van een lichtmicroscoop met een gemonteerde camera verbonden met een computer.
   Opmerking: Voor mobiele analyse Aantal positief gekleurd, kernhoudende cellen in de lamina propria en bronchiale epitheel intact, exclusief gebieden van gladde spier, klieren, grote bloedvaten, en verkeerde of beschadigd weefsel.
2. Middel de cellen en corrigeren gemiddelde aantal cellen voor het gebied van de lamina propria en de lengte van het epitheel. Het gebied van de lamina propria en de lengte van het epitheel kan worden berekend met een beeldanalyseprogramma.

6. enzymatische afbraak van Endobronchiale Biopsieën

1. Wassen biopsies: een steriele tang, plaats intact biopsieën in een 15 ml conische buis met 10 ml Hank's gebufferde zoutoplossing (HBSS) (figuur 3). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een schudapparaat bij 30 rpm. Breng de biopten een steriele dish door decanteren van de inhoud van de 15 ml buis met HBSS.
2. Verstoren slijm met DTT: Vervang HBSS in de buis met 10 ml HBSS bevattende 5 mM 1,4-dithiothreitol (DTT). Breng de biopten terug in de 15 ml buis met steriele pincet. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een schudapparaat bij 30 rpm.
3. Vortex de buis zachtjes gedurende 15 sec. Breng de biopsieën op een steriele schaal door decanteren van de inhoud van de 15 ml buis met HBSS en DTT.
4. de biopten overbrengen aan het kweekmedium: Vervang de HBSS en DTT in de buis met 10 ml RPMI 1640 kweekmedium. Breng de biopten terug in de 15 ml buis met steriele pincet. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een schudapparaat bij 30 rpm.
5. Verteren biopsies met collagenase en DNase.
   1. Bereid een oplossing van collagenase digestie II (0,25 mg / ml) en DNase (0,2 mg / ml) in voorverwarmde RPMI bevattende 1 M HEPES-oplossing. Voeg 500 ul van ontsluitingsoplossing per putje in een 48-well tissue culture plaat.
   2. Plaats 1 biopsie per putje in de spijsvertering oplossing. Incubeer de plaat op een schuddend platform voor 60 min bij 37 ° C bij 220 rpm. Pipet op en neer na 30 minuten opnieuw te verspreiden de biopten, en na 60 min, om het weefsel volledig te splitsen.
6. Het voorbereiden van enkele cel suspensies.
   1. Zwembad samen de verteerde biopten van de putjes in een 50 ml buis door deze door een 40 um cel zeef. Verzamel de overige cellen door het wassen van de putjes met ijskoude FACS buffer (met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die 2% foetaal runderserum).
   2. Knijp het restmateriaal op de cel zeef met de achterkant van de plunjer van een injectiespuit. Centrifugeer de gedigereerde cellen bij 400 g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 ml ijskoude FACS buffer. Tel de cellen handmatig met behulp van een hemocytometer en trypan blauwe vlekken op de levensvatbaarheid van de cellen te beoordelen.

7. Flow cytometrische analyse van enkele cellen van Endobronchiale biopten na enzymatische afbraak

1. Resuspendeer de celpellet ongeveer 1 x 10 ⁶ cellen in 200 ui FACS-buffer.
2. Toevoegen cellevensvatbaarheid kleurstof voor uitsluiting van dode cellen volgens het protocol van de fabrikant.
3. Voeg 5 ul van FcR blokkerende reagens en incubeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
4. Voeg celoppervlak antilichamen tegen CD45 (2 ui), geslacht (CD3, CD20, CD56, CD66abce en CD14; 2 pi elk), CD16 (0,5 ui), HLA-DR (3 ui), CD11c (5 ui), CD123 (5 ui), cd1c (3 ui) en CD103 (2 ui) en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Details betreffende antilichamen kunnen worden gevonden in het gedeelte werkwijzen, maar titreren en optimaliseren van de antilichamen om de precieze flowcytometer gebruikt. Wassen overtollige antilichamen met PBS gedurende 5 minuten bij 400 x g. Het verwerven van de monsters verse op een flowcytometer of voorafgaand vaststellen van de cellen in 1% paraformaldehyde later acquisition.
5. Identificeer humane DCs in longen biopten met behulp van een flowcytometrie test ¹⁸ (figuur 4).
   Opmerking: Het gebruik van een stromingscytometrie-analyse software, worden immuuncellen onderscheiden van andere longcellen door gating op CD45. Dode cellen kunnen worden uitgesloten als cellen die positief zijn voor de LIVE-/ DEAD kleurstof zijn. Van alle levende CD45 ⁺ cellen, geslacht cellen (B-cellen, T-cellen, NK-cellen, neutrofielen en monocyten) worden uitgesloten met een cocktail van antilichamen tegen CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14 en CD16 in een kanaal. Naar aanleiding van dat, HLA-DR ⁺ cellen de identificatie van alle menselijke DCs zal toestaan. MDC kan worden onderscheiden van PDC's op basis van de expressie van CD11c en het gebrek aan CD 11 c, respectievelijk. MDC kan verder worden onderverdeeld in cd1c ⁺ MDC of CD141 ^+.

Resultaten

Studies karakteriseren ademhalingssysteem weefsel-resident immuuncellen, zoals DCs, beperkt, voornamelijk vanwege het feit dat operatief verwijderd of volledig menselijk longweefsel schaars. Hier, een minder invasieve werkwijze voor het verkrijgen van longweefsel endobronchiale biopsies (EBB) van gezonde vrijwilligers en ontwikkelde protocollen bij de immuuncellen in het weefsel cytometrie studie gebruikt immunohistochemie of flow geschetst.

Discussie

Dit document beschrijft hoe u een gedetailleerde ruimtelijke en fenotypische karakterisatie van longweefsel-ingezeten DCs bij gezonde mensen te genereren met behulp van immunohistochemie en flowcytometrie op endobronchiale mucosale biopten tijdens bronchoscopie verzameld. In de volgende paragrafen kritische stappen in het protocol worden in detail besproken.

Kritische Stappen met het Protocol

Snijden en immunohistochemie: Het is cruciaal om de biopsie blokken bij -2...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bronchoscopie
Bronchoscope BF1T160	Olympus	BF1T160
Lichtbron	Olympus	Exera CV-160
Fenestreerbare forceps	Olympus	FB21C	Wordt gebruikt om biopten te nemen
Bite Block	Conmed	1429	20 mm x 27 mm
Glucose 25%			500 ml intraveneus
Glycopyrroniumbromide 0,2 mg/ml			Intraveneus. Voorkomt afscheiding van slijm/speeksel
Mengsel Midazolam 1 mg/ml p.o			Kan worden gebruikt voor extra ontspanning
Lidocaine, 40 mg/ml			Mond en keel toediening / Gegargeld
Lidocaine 100 mg/ml spray			Toegediend aan de achterkant van de keel
Lidocaine 20 mg/ml spray			Toegediend via bronchoscoop aan de luchtwegen
GMA verwerking en inbedding
Glazen flacons			5 ml
Aceton	Sigma-Aldrich	32201-1L
Moleculaire zeefjes, 4 Å	Alfa Aesar	88120	3-4 mm diameter pellets
Fenylmethysulfonylfluoride	Sigma-Aldrich	P-7626	0,035 g/100 ml aceton
Iodoacetamid	Sigma-Aldrich	I-6125	0,37 g/100 ml aceton
Polyethyleen-plat  TAAB inbedding capsules	TAAB laboratoria	C094	500x 8 mm diameter, polyethyleen, platte bodem capsules
Capsule houder	TAAB laboratoria	C054	Houdt 25 8 mm capsules
JB-4 GMA inbeddingskit	Polysciences	00226	Bevat JB-4 oplossing A (0026A-800), JB-4 oplossing B (0026B-3.8), benzoylperoxide (02618-12)
Methylbenzoaat	Sigma-Aldrich	27614-1L
Silica gel met vochtindicator	Scharlau	GE0043	2,5-6 mm
GMA sneden
Glazen microscoopglazen	ThermoFisher Scientific	10143562CEF	Gesneden randen, gefroste eind
Poly-L-Lysine oplossing	Sigma-Aldrich	P8920-500mL	1:10 voor werkoplossing
Glazen stripjes voor ultramicrotomie	Alkar
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287	Wasoplossing (0,1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker	LKB
Capsule splitter	TAAB laboratoria	C065
Koolstofstaal enkelzijdige mesjes	TAAB laboratoria	B054
Vijzel
Ammoniak, 25%	VWR	1133.1000	2 ml in 1 L, 1:500 (0,05%)
Microtoom	Leica		Leica RM 2165
Lichtbron	Leica		Leica CLS 150 XE
Microscoop met zwenkstandaard	Leica		Leica MZ6
GMA Immunohistochemie
Diamantpunt pen	Histolab	5218
Waterstofperoxide 30% oplossing	AnalaR Normapur	23619.264
Natriumaziet	Sigma-Aldrich	S8032
Tris	Roche	10708976001
Natriumchloride	VWR chemicaliën	27810.295
Rundserumalbumine	Millipore	82-045-2	Probumine BSA diagnostische kwaliteit
Dulbecco's aangepast arendsmedium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5546
Anti-menselijke CD45 antilichaam	BioLegend	304002	Muis monoklonaal, klon HI30, isotype IgG1k. Werkconcentratie van 500 ng/ml
Anti-menselijke CD1a antilichaam	AbD Serotech	MCA80GA	Muis monoklonaal, klon NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Werkconcentratie van 10 µg/ml
Muis monoklonaal IgG1 isotype controle	Abcam	ab27479
Muis monoklonaal IgG2a isotype controle	Dako	X094301-2
Vectastain ABC Elite standaardkit	Vector Labs	PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazool) peroxidase substraat kit	Vector Labs	SK-4200
Mayers hematoxyline	HistoLab	01820
Permanent Aqueous Montage Medium	AbD Serotech	BUF058C
Droogoven
DPX permanente montageoplossing	VWR	360292F
Lichtmicroscoop	Leica		Leica DMLB
Microscoopcamera	Leica		Leica DFC 320
Analysesoftware	Leica		Leica Qwin V3
Enzymatische vertering
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	55021C
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	DTT-RO
Collageenase II	Sigma-Aldrich	C6885
DNase	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R8758
Forceps
Platform rocker	Grant instruments	PMR-30
50 ml conische buizen	Falcon	14-432-22
40