Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses

10K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55235

⸱

20 januari 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, 3School of Biology and Ecology, University of Maine, 4Division of Intramural Research, Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 5Department of Chemical and Biological Engineering, University of Maine

In dit artikel

Samenvatting

Systemische en lokale infectiemodellen met zebravissen voor humaan influenza A-virus worden gedemonstreerd. Met behulp van een systemisch infectiemodel kunnen zebravissen worden gebruikt om antivirale geneesmiddelen te screenen. Met behulp van een lokaal infectiemodel kunnen zebravissen worden gebruikt om reacties van gastheer immuuncellen te karakteriseren.

Samenvatting

Elk jaar hebben seizoensgebonden uitbraken van griep een diepgaande invloed op samenlevingen wereldwijd. Ondanks mondiale inspanningen blijft griep een hardnekkige gezondheidslast. De belangrijkste strategie om infecties te beperken is jaarlijkse vaccinatie. Bij personen die besmet zijn geraakt met griep, kunnen antivirale geneesmiddelen de symptomen verminderen. Er is een duidelijke en onvervulde behoefte om alternatieve strategieën te ontwikkelen om griep te bestrijden. Er zijn verschillende diermodellen gemaakt om de interacties tussen gastheer en griep te modelleren. Hier worden protocollen beschreven voor het genereren van zebravismodellen voor systemische en gelokaliseerde infectie met humaan influenza A-virus (IAV). Met behulp van een systemisch IAV-infectiemodel kunnen kleine moleculen met potentiële antivirale activiteit worden gescreend. Als bewijs van principe wordt een protocol beschreven dat de werkzaamheid van het antivirale middel Zanamivir bij IAV-geïnfecteerde zebravissen aantoont. Het laat zien hoe ziektefenotypen kunnen worden gekwantificeerd om de relatieve werkzaamheid van potentiële antivirale middelen bij IAV-geïnfecteerde zebravissen te scoren. De afgelopen jaren is er een toenemende waardering voor de cruciale rol die neutrofielen spelen in de humane gastheerreactie op griepinfectie. De zebravis heeft zich bewezen als een onmisbaar model voor de studie van de biologie van neutrofielen, met directe gevolgen voor de humane geneeskunde. Er wordt een protocol beschreven om een gelokaliseerde IAV-infectie te genereren in de Tg(mpx:mCherry) zebravislijn om de biologie van neutrofielen in de context van een gelokaliseerde virale infectie te bestuderen. Neutrofiel-rekrutering naar gelokaliseerde infectieplaatsen biedt een aanvullende kwantificeerbare fenotypus voor het beoordelen van experimentele manipulaties die therapeutische toepassingen kunnen hebben. Beide hier beschreven zebravisprotocollen beschrijven getrouw aspecten van humane IAV-infectie. Het zebravismodel bezit talrijke inherente voordelen, waaronder hoge vruchtbaarheid, optische helderheid, geschiktheid voor geneesmiddelenscreening en beschikbaarheid van transgene lijnen, inclusief die waarin immuuncellen zoals neutrofielen zijn gelabeld met fluorescerende eiwitten. De hier beschreven protocollen benutten deze voordelen en hebben het potentieel om kritieke inzichten te onthullen in host-IAV-interacties die uiteindelijk kunnen vertalen naar de klinische praktijk.

Inleiding

Volgens de World Health Organization (WHO), influenza infecteren 5-10% van de volwassenen en 20-30% van de kinderen en veroorzaken jaarlijks 3-5.000.000 ernstig ziek maken en tot 500.000 sterfgevallen wereldwijd 1. Jaarlijkse inentingen tegen griep blijft de beste optie om de ziekte te voorkomen. Inspanningen, zoals de WHO Global Action Plan hebben seizoensgebonden vaccin gebruik, de productie van vaccins capaciteit, en onderzoek en ontwikkeling verhoogd naar meer potente vaccins strategieën om de morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met seizoensgebonden influenza-uitbraken 2 te verminderen. Antivirale middelen zoals neuraminidase-remmers (bijv Zanamivir en Oseltamivir) zijn verkrijgbaar in sommige landen en bij het verminderen van de symptomen effectief zijn gebleken, wanneer het wordt toegediend binnen de eerste 48 uur na het optreden 3, 4, 5. Ondanks de wereldwijde inspanningen, inperking van seizoensgriep outbreaks blijft een geweldige uitdaging op dit moment, zoals influenzavirus antigene drift overschrijdt vaak actuele vermogen aan te passen aan de veranderende genoom van het virus 6. Vaccin strategieën gericht op nieuwe stammen van het virus moeten worden ontwikkeld op voorhand en zijn soms minder dan optimaal effectief gemaakt door onvoorziene veranderingen in de aard van de stammen die uiteindelijk de overhand hebben in een influenza-seizoen. Daarom is er duidelijk behoefte aan alternatieve therapeutische strategieën die infecties en vermindering van sterfte ontwikkelen. Door een beter begrip van de host-virus interactie, kan het mogelijk zijn om nieuwe anti-influenza medicijnen en adjuvante therapieën 7, 8 ontwikkelen.

De menselijke gastheer-influenza A virus (IAV) interactie complex. Verschillende diermodellen van menselijke besmetting IAV zijn ontwikkeld om inzicht te krijgen in de host-virus interactie, including muizen, cavia's, katoen ratten, hamsters, fretten, en makaken 9. Terwijl het verstrekken van belangrijke gegevens die het begrip van gastheer-IAV dynamiek hebben verbeterd, elk model organisme bezit belangrijke nadelen die moeten worden overwogen bij een poging om de bevindingen te vertalen naar de humane geneeskunde. Bijvoorbeeld, muizen, die de meest gebruikte model zijn, niet gemakkelijk te ontwikkelen IAV-geïnduceerde infectie symptomen wanneer besmet met humane influenza-isolaten 9. Dit komt omdat muizen niet de natuurlijke tropisme voor humane influenza-isolaten sinds muis epitheelcellen tot expressie α-2,3 siaalzuurkoppelingen plaats van de α-2,6 siaalzuurkoppelingen uitgedrukt op menselijke epitheelcellen 10. De hemagglutinine eiwitten die in humane isolaten IAV gunstig binden en voer gastheer cellen die α-2,6 siaalzuurkoppelingen doorgaande receptor veroorzaakte endocytose 9, 11, 12, 13. Bijgevolg wordt nu aangenomen dat bij de ontwikkeling muismodellen voor humane influenza, zorg moet worden afgegeven bij een stam van muis paren met de geschikte stam van influenza om ziekte fenotypes die aspecten van de menselijke ziekte recapituleren bereiken. Daarentegen epitheelcellen in de bovenste luchtwegen van fretten bezitten α-2,6 siaalzuurkoppelingen dat menselijke cellen 14 lijken. Geïnfecteerde fretten hebben veel van de pathologische en klinische kenmerken waargenomen in de menselijke ziekten, met inbegrip van de pathogeniteit en overdraagbaarheid van de menselijke en het vogelgriepvirus 14, 15. Ze zijn ook zeer vatbaar zijn voor werkzaamheid van het vaccin studies. Toch is de fret model voor humane influenza heeft een aantal nadelen voornamelijk verband houden met hun omvang en de kosten van de veehouderij die overname te maken van statistisch significant data uitdagend. Bovendien hebben fretten eerder weergegeven verschillen in farmacokinetica drug, biobeschikbaarheid en toxiciteit die bepaling van de doelmatigheid bemoeilijken. Bijvoorbeeld, fretten vertonen toxiciteit voor de M2 ionkanalen inhibitor amantadine 16. Aldus is het duidelijk dat de keuze van een diermodel om vragen over menselijke iav infecties te bestuderen, is het belangrijk de inherente voordelen en beperkingen, en het aspect van de host-virus interactie die wordt onderzocht overwegen.

De zebravis, Danio rerio, een diermodel dat unieke mogelijkheden biedt voor het onderzoeken van microbiële infectie, gastheer immuunrespons en potentieel geneesmiddel therapieën 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. De aanwezigheid van α-2,6-gekoppelde siaalzuren aan het oppervlak van cellen in de zebravis voorgesteld de gevoeligheid voor IAV, die in infectie studies werd gedragen en afgebeeld in vivo onder toepassing van een fluorescerende reporter stam van IAV 19. In IAV geïnfecteerde zebravis, verhoogde expressie van de antivirale ifnphi1 en MXA transcripten aangegeven dat een aangeboren immuunreactie werd gestimuleerd en de pathologie weergegeven IAV geïnfecteerde zebravis, waaronder oedeem en weefsel, vergelijkbaar met dat voor humaan influenza . Bovendien is de IAV antivirale neuraminidase remmer Zanamivir beperkte mortaliteit en verminderde virale replicatie in de zebravis 19.

In dit rapport, een protocol voor het initiëren van het systeemic IAV infecties in de zebravis embryo's wordt beschreven. Het gebruik van zanamivir bij klinisch relevante doses als een proof-of-principle, is het nut van deze zebravis IAV infectie model voor het screenen van verbindingen voor antivirale activiteit aangetoond. Daarnaast is een protocol voor het genereren van een gelokaliseerde infectie epitheliaal IAV in de zebravis zwemblaas, een orgaan dat wordt beschouwd als anatomisch en functioneel analoog aan het zoogdier longen 21, 29, 30, 31 zijn beschreven. Gebruik van deze gelokaliseerde iav infectiemodel kunnen neutrofiel rekrutering van de plaats van infectie worden gevolgd, zodat onderzoek naar de rol van neutrofielen biologie IAV infecties en ontstekingen. Deze zebravismodellen vult bestaande diermodellen van humane IAV infecties en zijn bijzonder bruikbaar voor het testen van kleine moleculen en immuuncel respons vanwege de mogelijkheid van verhoogde sTATISTISCHE vermogen, vermogen tot matige hoge throughput assays en het vermogen om immuuncellen gedrag en functie volgen met lichtmicroscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle werkzaamheden moeten worden uitgevoerd met behulp bioveiligheidsniveau 2 (of BSL2) standaarden beschreven door de Amerikaanse Centers for Disease Control (CDC) en in overeenstemming met de door Institutional Animal Care en gebruik Commissies (IACUC) richtlijnen. Gelieve te overleggen met de juiste ambtenaren om de veiligheid en de naleving te waarborgen.

1. zebravis Onderhoud

  1. Paaien zebravis en verzamel het vereiste aantal embryo's voor de experimenten. Indien nodig, massa kweekbakken, zoals die beschreven door Adatto et al. 32, kan worden gebruikt om grote aantallen ontwikkelingsgebied-gefaseerde embryo's te verzamelen.
  2. Laat embryo's te ontwikkelen tot de gewenste ontwikkelingsstadium (48 uur na de bevruchting voor een systematische IAV infectie [deel 3] of 5 dagen na de bevruchting voor een gelokaliseerde, blaasontsteking zwemmen [deel 4]) in diepe petrischaaltjes bij lage dichtheid (< 100 embryo's / gerecht) bij 28 ° C in steriel ei water met 60 ug / ml zeezout (bijvoorbeeld Instant Oceaan) in gedestilleerd water.
    1. Het verwijderen van dode embryo's met plastic overdracht pipetten en verander ei water per dag om een ​​optimale gezondheid en ontwikkeling te waarborgen.

2. Voorbereiding van de materialen en reagentia

  1. Bereid een 4 mg / ml voorraad oplossing van tricaïne-S (de pH instellen op 7,0-7,4) in gedestilleerd water en autoclaaf. Bewaren bij 4 ° C.
  2. Trek borosilicaatglas capillairen met filamenten met behulp van een micropipet trekker (bijv Micropipet Puller met de volgende instellingen: drukinstelling = 100, warmte = 550, trekt = [geen waarde], snelheid = 130, time = 110).
    OPMERKING: Vóór knippen van de naald, de lengte waar de naald begint taps naar de punt van de naald zou ongeveer 12-15 mm. Dit kan echter variëren op basis van voorkeur en toepassing. Een langere, meer geleidelijke tapsheid kan meer de voorkeur vanwege de toegenomen vermogen om de embryo doorboren en de verlaagde risk van de naald buigen of breken.
  3. Smelt 2 g agarose in 100 ml ei water met behulp van een magnetron. Maak platen waarop line-up en injecteer de embryo's door het gieten van gesmolten agarose in diepe petrischalen en te laten stollen.
  4. Maak een 10 mg / ml voorraad van zanamivir in nuclease-vrij water. Aliquot en bevriezen bij -20 ° C.
  5. Smelt 0,5 g agarose in 50 ml ei water met behulp van een magnetron te maken embryo montage agarose. Handhaven waterbad van 50 ° C tot gebruik bij beeldvorming.

3. Systemische IAV Infection (48 uur na de bevruchting)

LET OP: Alle onderzoek personeel moeten overleggen met hun begeleiders en artsen met betrekking tot de vaccinatie vóór de aanvang van de werkzaamheden met de IAV.

  1. Handmatig dechorionate embryo op de dag van het experiment met behulp van # 5 tang. Zorg verwijderen en inslapen embryo's die zijn geblesseerd tijdens het proces 200 ug / ml tricaïne oplossing.
  2. voorbereiding of IAV voor Micro-injectie
    OPMERKING: Stammen die is aangetoond dat zebravis embryo infectieziekten influenza A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), influenza A X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31) en de fluorescente reporter influenza stam NS1-GFP 33. Details over APR8 en X-31, en andere stammen, kan gevonden worden op de Influenza Onderzoek Databank
    1. Propageren NS1-GFP-stam van IAS op geëmbryoneerde kippeneieren zoals eerder beschreven 34, 35. Verzamelen aliquot en het titreren allantoïsvocht dat iav en bewaar bij -80 ° C. Pre-getitreerd APR8 en X-31 virussen kunnen commercieel worden aangeschaft.
      1. Net voor infectie, snel ontdooien een IAV hoeveelheid in gehandschoende handen en vervolgens snel te plaatsen op ijs om het verlies van titer te verminderen.
    2. viral verdunning
      1. Als u de APR8 of X-31 virussen, te verdunnen tot 3,3 x 10 6 ei infectieuze dosis 50% (EID50) / ml in steriele, ijskoude PBS supplemteerde met 0,25% fenol rood (om te helpen bij de visualisatie) in een laminaire stroming kap. Tegelijkertijd het opzetten van een controle met steriele PBS met 0,25% fenol rood.
      2. Bij gebruik NS1-GFP-stam 33 verdund tot ~ 1,5 x 10 2 plaquevormende eenheden (PFU) per nl in steriele, ijskoude PBS met 0,25% fenolrood (om te helpen bij visualisatie) in een laminaire stroming kap. Tegelijkertijd het opzetten van een controlegroep met allantoïsvocht van geïnfecteerde kippeneieren verdund als het virus in steriele PBS met 0,25% fenol rood.
      3. Handhaaf IAV op ijs pas klaar voor gebruik.
    3. Pipet virusoplossing in micro-injectie naalden gebruikt microloader tips vlak voor gebruik. Steek micro-injectie naald in de juiste houder van de injectie-inrichting (bijv MPPI-3 druk injectiesysteem).
    4. Tijdens het bekijken van onder de stereo microscoop, voorzichtig clip de micro-injectie naald met scherpe, gesteriliseerde # 5 tang.
      NB: Het is recommenDED dat de micro-injectie tip geleidelijk worden afgekapt.
    5. Druk het voetpedaal van de druk inspuitsysteem en injecteer in een daling van de microscoop immersie olie op een kalibratie micrometer. Meet de diameter van de druppel. Bereken het volume van de druppel met de formule V = 4 / 3πr 3, waarbij V het volume nl en r de straal in urn.
      OPMERKING: Als de daling diameter te klein is, kunnen extra glas worden geknipt of de druk en de timing instellingen kunnen worden aangepast. Als de druppel diameter te groot is, kan de druk en timing instellingen worden aangepast.
    6. Bandenspanning en timinginstellingen van de druk injector en / of reclip de naaldpunt tot het gewenste injectievolume is bereikt (gewoonlijk 1-3 nl). Drukinstellingen tussen 20 en 30 psi en pulsduur omgeving tussen 40 en 80 msec zijn typisch. Stel tegendruk zodat het tellers capillaire druk, maar niet lek IAV (netto nul druk).
  3. Lijn Embryo's voor injectie
    1. Verdoven dechorionated embryo's in 200 ug / ml tricaïne.
    2. Zodra de beweging ophoudt, transfer 10-20 embryo's tot een 2% agarose plaat (opgesteld in paragraaf 2.3) met een plastic pipet. Gebruik plastic pipet om overtollige vloeistof te verwijderen.
    3. Voorzichtig uitlijnen embryo's voor micro-injectie met een brand-gepolijst en verzegeld borosilicaatglas capillair. Met behulp van een stereo-microscoop, voorzichtig oriënteren embryo's, zodat het kanaal van Cuvier of de ader achterste kardinaal is in lijn met de micro-injectie naald (Figuur 1A).
  4. IAV Micro-injectie
    1. Steek de micro-injectie naald in het kanaal van Cuvier of de ader achterste kardinaal. Druk voetpedaal om de gewenste hoeveelheid IAV injecteren in de bloedsomloop van het embryo (Figuur 1A). Embryo's kunnen meerdere keren worden geïnjecteerd indien nodig.
      LET OP: De injectie bolus moet worden geveegd in de circulatie en distribbijge- hele lichaam. Als injectievolume verzamelt op de plaats van injectie, verwijder embryo van experiment en euthanaseren.
    2. Herhaal injecties op verschillende embryo controleoplossing specifiek voor de stam van het virus gekozen. Voor APR8 en X-31, gebruik maken van de in paragraaf 3.2.2.1 beschreven controle; voor de NS1-GFP, gebruik maken van de in paragraaf 3.2.2.2 beschreven controle.
  5. Transfer embryo's gelabelde platen met steriel ei water en plaats in incubators bij 33 ° C.
    OPMERKING: Geïnfecteerde embryo's worden gekweekt bij 33 ° C om verbeterde virale replicatie ondersteunen. Bovendien, incubatie bij 33 ° C beter bootst de temperatuur van het menselijke bovenste luchtwegen, die in nauw contact met lagere temperaturen in de externe omgeving en is waar iav besmettingen. Embryo's kunnen wennen aan een breed temperatuurbereik 34.

4. Gelokaliseerde, Swim Blaas IAV Infectie in Tg (MPX: mCherry) transgene zebravis (5 dagen na de bevruchting)

  1. Bereiding van IAV voor Microinjection
    1. Verdun de NS1-GFP-stam en controle oplossing voor injectie zoals beschreven in paragraaf 3.2.
    2. Bereid naalden zoals beschreven in paragraaf 2.2.
    3. Lijn Tg (MPX: mCherry) 35 larven die opgeblazen zwemblazen zoals beschreven in paragraaf 3.3 met de volgende uitzondering. Lijn larven zodanig dat de naald de zwemblaas kunnen doorboren en het virus kan worden gestort op de achterkant van de zwemblaas, zoals eerder beschreven 36 (Figuur 2A).
  2. IAV Micro-injectie
    1. Steek de micro-injectie naald in de zwemblaas en injecteer het gewenste volume (bv 5 nl) naar de achterkant van de structuur (Figuur 2A).
      OPMERKING: De injectie bolus te verzamelen in de richting van het achterste en de zwemblaas van de luchtbel moet be verplaatst naar voren. GFP expressie moet beginnen worden waargenomen op 3 uur na injectie.
    2. Herhaalde injecties controleoplossing specifiek voor de virusstam gekozen, zoals beschreven in paragraaf 3.4.2.
  3. Transfer larven platen met steriel ei water en plaats in incubators bij 33 ° C.

5. Antivirale Drug Treatment

NB: De onderstaande protocol beschrijft de Zanamivir behandeling eerder aangetoond in Gabor et al. 19. Dit protocol kan worden aangepast om andere antivirale middelen screenen en het potentieel worden aangepast om meerdere verbindingen in een 96 wells plaat, high-throughput screening format.

  1. Op 3 uur na infectie, vervang ei water van NS1-GFP-and-control besmette vis met steriel ei water met 0, 16,7 of 33,3 ng / ml Zanamivir.
    Opmerking: Deze concentraties werden gekozen om te trachten de fysiologische niveaus bereikt fo replicerenllowing toediening van zanamivir bij menselijke patiënten (100, 200, of 600 mg, iv, tweemaal daags of 10 mg geïnhaleerd, tweemaal daags). De serumconcentraties bij menselijke patiënten varieerde 9,83-45,3 ng / ml 36.
  2. In de loop van 5 dagen, veranderen ei water elke 12 uur en te vervangen door steriele ei water met daarin de juiste hoeveelheid zanamivir.
  3. Track Course van infectie.
    1. Verdoven zebravis in 200 ug / ml tricaïne. Monitor GFP expressie door stereo fluorescentiemicroscopie verschillen in infectie patronen tussen IAV-geïnfecteerde en controle vis en tussen de vis ondergedompeld in de verschillende concentraties van geneesmiddelen visueel observeren.
    2. Volg morbiditeit en mortaliteit in de loop van 5 dagen.
      1. Record observaties over infectie dynamiek gerelateerd aan de ziekte pathologie, waaronder tekenen van lethargie en het bewijs van oedeem, verschillen in pigmentatie, oculaire en craniofaciale misvormingen, en lordose. pathologietypisch blijkt controle geïnfecteerde vissen bij 24-48 uur na injectie, afhankelijk van de hoeveelheid virus ingespoten. Verzamel beelden 24 uur na injectie.
      2. Om de 24 uur gedurende 5 dagen na infectie, noteert u het aantal doden, ziekelijk, en gezonde larven. De dood wordt bepaald door de afwezigheid van een merkbare hartslag. Plot gegevens zoals gewenst. Bijvoorbeeld plotgegevens als gestapelde staafdiagram met percentages van gezonde, ziekelijk of dode vissen uitgezet op de y-as en de behandelde groep op de x-as. 19
        LET OP: De sterfte kan worden gescoord door Kaplan-Meier survival schattingen. Afhankelijk van de toepassing, kan het zinvol zijn om alternatieve benaderingen voor het scoren vis morbiditeit, met inbegrip van een scoring matrix die de mate van morbiditeit op basis van de eerder genoemde pathologische kenmerken waargenomen kunnen kwantificeren ontwikkelen.
      3. Neem contact op met een statisticus te zijn om de juiste statistische analyses toe te passen.

6. neutrofielen migratie

LET OP: De onderstaande protocol beschrijft een methode voor het bijhouden van neutrofielen migratie naar de zwemblaas na een gelokaliseerde, epitheliale IAV infectie. De beschreven werkwijzen kunnen worden gewijzigd om de effecten van genetische en chemische manipulaties testen. Met deze techniek is het mogelijk om de onderliggende mechanismen neutrofiel karakteriseren, bij een IAV infectie.

  1. Montage zebravis for Imaging
    1. Verdoven larven te beelden in 200 ug / ml tricaïne.
    2. Transfer een individuele Tg (MPX: mCherry) larve die is geïnfecteerd met NS1-GFP een putje van een 24 goed, glazen bodemplaat in een kleine druppel ei water (~ 50-100 pi). Herhaal dit met andere IAV-geïnfecteerde en controle vis.
    3. Voeg langzaam 1% agarose embryo montage media aan elk putje (paragraaf 2.5), het verzorgen grote luchtbellen te introduceren.
      1. Voorzichtig de positie van de larve passen zodat het op zijn kant is geplaatst.Goody en Henry 37 beschrijven hoe probes die goed functioneren in deze applicatie gebruik van insect pinnen die in borosilicaatglas capillairen met filamenten zijn gemonteerd en superglued in de plaats te maken.
    4. Zodra de agarose verhardt, voorzichtig de afzonderlijke putjes te vullen met ei water die 200 ug / ml tricaïne.
    5. Met een confocale microscoop, capture az stack reeks helderveld en fluorescentie beelden met behulp van een 20x doelstelling gericht op de zwemblaas.
      1. Stel de boven- en ondergrens zodat ze allemaal zichtbaar waarneembare groene en rode fluorescentie vangen.
      2. Maak foto's op 2,0 psec / pixel met de stappen die zijn ≤ 4 micrometer. Het verhogen van de tijd per pixel en het verminderen van de afstand tussen de stappen (bv 0,5-1,0 pm) verhoogt de beeldresolutie en kwaliteit.
      3. Genereer een twee-dimensionaal beeld door het samenvoegen van lagen.
      4. Vergelijk het aantal MPX-mCherry-positieve neutrofielen aanwezig in de zwemblazen van IAV-geïnfecteerde and-control geïnjecteerd zebravis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier elementen waaruit blijkt hoe IAV systemische infectie bij zebravis kan worden gebruikt om de werkzaamheid van geneesmiddelen (Figuur 1A) testen worden voorzien. Embryo's in 48 uur na de bevruchting zijn geïnjecteerd met APR8 (figuren 1C, 1F), X-31 (figuren 1D, 1G) of NS1-GFP (Figuur 1H-1I) via het kanaal van Cuvier een virale infectie initiëren. Een ander cohort van embryo's op 48 uur na de bevruchting werde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Om de voordelen verkregen uit een klein proefdiermodel voor menselijke gastheer-pathogeen interacties modelleren maximaliseren, is het belangrijk om vraagstellingen en testen hypothesen die kapitaliseren op de inherente voordelen van het modelsysteem omlijsten. Als model voor de menselijke IAV infectie, de zebravis heeft een aantal sterke punten, met inbegrip van hoge vruchtbaarheid, optische helderheid, ontvankelijkheid voor drug discovery, en de beschikbaarheid van transgene lijnen die immuuncellen zoals neutrofielen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Mark Nilan bedanken voor de verzorging en het onderhoud van de zebravis en Meghan Breitbach en Deborah Bouchard voor het vermeerderen van NS1-GFP en het bepalen van IAV-titers. Dit onderzoek werd ondersteund door NIGMS-subsidie NIH P20GM103534 en de Maine Agricultural and Forest Experiment Station (Publicatienummer 3493).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Instant OceanSpectrum BrandsSS15-10
100 mm x 25 mm steriele wegwerpbare petrischalen VWR89107-632
Overdrachtpijpjes Fisherbrand13-711-7M
Tricaine-S (MS-222)Western Chemical
Borosilikatiet glas capillair met filament Sutter Instrument BF120-69-10
Flaming/Brown micropipet aftrekmachine Sutter InstrumentP-97
AgaroseLonza50004
ZanamivirAK ScientificG939
Dumont #5 pincet Electron Microscopy Sciences72700-D
Microloader tipsEppendorf930001007
Microscoop immersie olieOlympusIMMOIL-F30CC
Microscoop stageschaalbalk AmScopeMR095
MPPI-3 drukinjector Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscoopOlympusSZ61
TerugslagventielApplied Scientific InstrumentationBPU
Micropipet houder kitApplied Scientific InstrumentationMPIP
VoetschakelaarApplied Scientific InstrumentationFSW
MicromanipulatorApplied Scientific InstrumentationMM33
MagneetbasisApplied Scientific InstrumentationMagnetic Base
Fenol rood Sigma-Aldrich P-4758
Koud temperatuur incubatorVWR2020
SteREO Discovery.V12Zeiss
VerlichtingZeissHXP 200C
Koude lichtbronZeiss CL6000 LED
Meerkuiplis met glazen bodem, 24 putjesMattekP24G-0-13-F
Confocale microscoopOlympusIX-81 with FV-1000 laser scanning confocal systeem
Fluoview softwareOlympus
Prism v6GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus Charles River 490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) Charles River 490715
Influenza NS1-GFPVernoemd in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry)Vernoemd in Lam et al. 2013

Referenties

  1. W.H.O. Influenza (Seasonal). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
  2. W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. , Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
  3. De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov. 5 (12), 1015-1025 (2006).
  4. von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat Rev Drug Discov. 6 (12), 967-974 (2007).
  5. Fiore, A. E., et al. Antiviral Agents for the Treatment and Chemoprophylaxis of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , 1-26 (2011).
  6. Krammer, F., Palese, P. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 167-182 (2015).
  7. Ren, H., Zhou, P. Epitope-focused vaccine design against influenza A and B viruses. Curr Opin Immunol. 42, 83-90 (2016).
  8. Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323, 115-139 (2014).
  9. Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
  10. Ibricevic, A., et al. Influenza virus receptor specificity and cell tropism in mouse and human airway epithelial cells. J Virol. 80 (15), 7469-7480 (2006).
  11. Skehel, J. J., Wiley, D. C. RECEPTOR BINDING AND MEMBRANE FUSION IN VIRUS ENTRY: The Influenza Hemagglutinin. Annu Rev Biochem. 69 (1), 531(2000).
  12. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  13. Stencel-Baerenwald, J. E., Reiss, K., Reiter, D. M., Stehle, T., Dermody, T. S. The sweet spot: defining virus-sialic acid interactions. Nature Rev Microbiol. 12 (11), 739-749 (2014).
  14. Herlocher, M. L., et al. Ferrets as a Transmission Model for Influenza: Sequence Changes in HA1 of Type A (H3N2) Virus. J Infect Dis. 184 (5), 542-546 (2001).
  15. Belser, J. A., Katz, J. M., Tumpey, T. M. The ferret as a model organism to study influenza A virus infection. Dis Model Mech. 4 (5), 575-579 (2011).
  16. Cochran, K. W., Maassab, H. F., Tsunoda, A., Berlin, B. S. Studies on the antiviral activity of amantadine hydrochloride. Ann N Y Acad Sci. 130 (1), 432-439 (1965).
  17. de Oliveira, S., Boudinot, P., Calado, A., Mulero, V. Duox1-derived H2O2 modulates Cxcl8 expression and neutrophil recruitment via JNK/c-JUN/AP-1 signaling and chromatin modifications. J Immunol. 194 (4), 1523-1533 (2015).
  18. de Oliveira, S., et al. Cxcl8 (IL-8) mediates neutrophil recruitment and behavior in the zebrafish inflammatory response. J Immunol. 190 (8), 4349-4359 (2013).
  19. Gabor, K. A., et al. Influenza A virus infection in zebrafish recapitulates mammalian infection and sensitivity to anti-influenza drug treatment. Dis Model Mech. 7 (11), 1227-1237 (2014).
  20. Galani, I. E., Andreakos, E. Neutrophils in viral infections: Current concepts and caveats. J Leukoc Biol. 98 (4), 557-564 (2015).
  21. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  22. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
  23. Mathias, J. R., et al. Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1. J Cell Sci. 120 (19), 3372-3383 (2007).
  24. Shelef, M. A., Tauzin, S., Huttenlocher, A. Neutrophil migration: moving from zebrafish models to human autoimmunity. Immunol Rev. 256 (1), 269-281 (2013).
  25. Walters, K. B., Green, J. M., Surfus, J. C., Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Live imaging of neutrophil motility in a zebrafish model of WHIM syndrome. Blood. 116 (15), 2803-2811 (2010).
  26. Yoo, S. K., et al. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Dev Cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  27. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J Leukoc Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  28. Yoo, S. K., et al. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
  29. Winata, C. L., et al. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 222-236 (2009).
  30. Perry, S. F., Wilson, R. J., Straus, C., Harris, M. B., Remmers, J. E. Which came first, the lung or the breath? Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 129 (1), 37-47 (2001).
  31. Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., Wheeler, R. T. Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. J Vis Exp. (93), e52182(2014).
  32. Adatto, I., Lawrence, C., Thompson, M., Zon, L. I. A New System for the Rapid Collection of Large Numbers of Developmentally Staged Zebrafish Embryos. PLoS ONE. 6 (6), e21715(2011).
  33. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  34. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture. 269 (1), 1-20 (2007).
  35. Lam, P. -y, Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Heat Shock Modulates Neutrophil Motility in Zebrafish. PLoS ONE. 8 (12), e84436(2013).
  36. Shelton, M. J., et al. Zanamivir pharmacokinetics and pulmonary penetration into epithelial lining fluid following intravenous or oral inhaled administration to healthy adult subjects. Antimicrob Agents Chemother. 55 (11), 5178-5184 (2011).
  37. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish Shellfish Immunol. 25 (4), 341-350 (2008).
  38. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 14 (10), 721-731 (2015).
  39. Brandes, M., Klauschen, F., Kuchen, S., Germain, R. N. A systems analysis identifies a feedforward inflammatory circuit leading to lethal influenza infection. Cell. 154 (1), 197-212 (2013).
  40. Narasaraju, T., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am J Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
  41. Pillai, P. S., et al. Mx1 reveals innate pathways to antiviral resistance and lethal influenza disease. Science. 352 (6284), 463-466 (2016).
  42. Stifter, S. A., et al. Functional Interplay between Type I and II Interferons Is Essential to Limit Influenza A Virus-Induced Tissue Inflammation. PLoS Pathog. 12 (1), e1005378(2016).
  43. Vlahos, R., Stambas, J., Selemidis, S. Suppressing production of reactive oxygen species (ROS) for influenza A virus therapy. Trends Pharmacol Sci. 33 (1), 3-8 (2012).
  44. Palic, D., Andreasen, C. B., Ostojic, J., Tell, R. M., Roth, J. A. Zebrafish (Danio rerio) whole kidney assays to measure neutrophil extracellular trap release and degranulation of primary granules. J Immunol Methods. 319 (1-2), 87-97 (2007).
  45. Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  46. Mathias, J. R., et al. Characterization of zebrafish larval inflammatory macrophages. Dev Comp Immunol. 33 (11), 1212-1217 (2009).
  47. Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Curr Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
  48. Drescher, B., Bai, F. Neutrophil in viral infections, friend or foe? Virus Res. 171 (1), 1-7 (2013).
  49. Iwasaki, A., Pillai, P. S. Innate immunity to influenza virus infection. Nat Rev Immunol. 14 (5), 315-328 (2014).
  50. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  51. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends Immunol. 31 (8), 318-324 (2010).
  52. Tate, M. D., Brooks, A. G., Reading, P. C. The role of neutrophils in the upper and lower respiratory tract during influenza virus infection of mice. Respir Res. 9, 57(2008).
  53. Tate, M. D., et al. Neutrophils ameliorate lung injury and the development of severe disease during influenza infection. J Immunol. 183 (11), 7441-7450 (2009).
  54. Tumpey, T. M., et al. Pathogenicity of influenza viruses with genes from the 1918 pandemic virus: functional roles of alveolar macrophages and neutrophils in limiting virus replication and mortality in mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
  55. Wheeler, J. G., Winkler, L. S., Seeds, M., Bass, D., Abramson, J. S. Influenza A virus alters structural and biochemical functions of the neutrophil cytoskeleton. J Leukoc Biol. 47 (4), 332-343 (1990).
  56. de Oliveira, S., et al. Cxcl8-l1 and Cxcl8-l2 are required in the zebrafish defense against Salmonella Typhimurium. Dev Comp Immunol. 49 (1), 44-48 (2015).
  57. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukoc Biol. 98 (4), 523-537 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Inflenzamodel in zebravissenscreening van antivirale geneesmiddelenneutrofielrekruteringsystemische virale infectiegelokaliseerd infectiemodelTg mpx mCherry zebravissenmicroinjectietechniekconfocale microscopie beeldvormingZanamivir effici ntietestimmuunrespons van de gastheer
Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.