Tandem affiniteitszuivering van eiwitcomplexen van eukaryote cellen

Samenvatting

We beschrijven hier een nieuwe, robuuste en efficiënte tandem affinity-zuivering (TAP) methode voor de expressie, isolatie en karakterisering van eiwitcomplexen uit eukaryote cellen. Dit protocol kan worden gebruikt voor de biochemische karakterisering van discrete complexen, evenals voor de identificatie van nieuwe interactoren en post-translationele modificaties die hun functie reguleren.

Samenvatting

De zuivering van actief eiwit-eiwit en eiwit-nucleïnezuur-complexen is cruciaal voor de karakterisering van enzymatische activiteiten en de novo identificatie van nieuwe subeenheden en post-translationele modificaties. Bacteriële systemen zorgen voor de expressie en zuivering van diverse interne polypeptiden en eiwitcomplexen. Echter, dit systeem de zuivering van eiwit subeenheden die post-translationele modificaties (bijvoorbeeld fosforylatie en acetylatie) bevatten, en de identificatie van nieuwe regulerende subeenheden die alleen aanwezig zijn / expressie in eukaryote systeem mogelijk. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van een nieuw, robuuste en efficiënte werkwijze tandem affiniteitszuivering (TAP) middels Strep- en FLAG-gemerkte eiwitten die de zuivering van eiwitcomplexen maakt met transiënt of stabiel tot expressie epitoop-gemerkte eiwitten van eukaryote cellen. Dit protocol kan worden toegepast op prot karakteriserenein complexe functionaliteit, post-translationele modificaties op complexe subeenheden ontdekken en op nieuwe regulerende complexe componenten identificeren met massaspectrometrie. Met name kan dit TAP toegelicht voor eiwitcomplexen gevormd door eukaryote of pathogene (viraal en bacterieel) componenten bestuderen, hetgeen aldus een breed scala aan downstream experimentele mogelijkheden. Wij stellen onderzoekers met eiwitcomplexen deze benadering op verschillende manieren kunnen gebruiken.

Inleiding

Eiwit-eiwit interacties (PPI) zijn cruciaal voor de nauwkeurige regeling van biologische processen ^1, en bestudeerd deze IPP kan informeren over de functie ^2. Verscheidene benaderingen zijn ontwikkeld voor het karakteriseren van protonpompremmers en voor de de novo identificatie van nieuwe regulerende eiwitcomponenten. In 1989, Stanley Velden en collega's meldde de gist-twee-hybride (Y2H) test ^3. Deze aanpak maakt het mogelijk om onpartijdige en uitgebreide identificatie van interactoren (prooien) voor een bepaald eiwit van belang (aas) in Saccharomyces cerevisiae. Naast de opmerkelijke bruikbaarheid voor het ontdekken PPI kan de Y2H assay worden gebruikt voor het karakteriseren van eiwitten paren in gistcellen, definiëren minimale interactie domeinen en identificeren van mutaties die dergelijke interacties te heffen. Door wijziging van de Y2H assay kan IPP eveneens bestudeerd in zoogdiercellenclass = "xref"> 4. Variaties van de Y2H assay (bijvoorbeeld gist drie-hybride systeem) kan ook worden toegepast om te bestuderen eiwit-RNA en eiwit-kleine organische ligand interacties in cellen.

Een andere veel gebruikte hulpmiddel PPI studeren in een homoloog systeem is de co-immunoprecipitatie (co-IP) test ^5. Door een antilichaam tegen een eiwit van belang immunoprecipitatie, co-IP assay kunnen onderzoekers PPI in cellen van verschillende omgevingsomstandigheden en experimentele het oog. Het gebruik van epitoop-gemerkte eiwitten (bijvoorbeeld FLAG, Myc, STREP en HA oa) in affiniteitszuivering (AP) methoden is de isolatie van eiwitten uit complexe eiwitmengsels meerdere downstream assays, zoals Western blot vergemakkelijkt zilverkleuring en enzymatische analyses. Geen van deze eerdere benaderingen maken de isolatie van grote hoeveelheden eiwitcomplexen voor verdere karakterisering zoals in vitro eenssays, ontdekking van regulatorische subeenheden door massaspectrometrie en identificatie van post-translationele modificaties. Een verbeterde versie van de AP methode heet Tandem AP (TAP), een zuiveringstechniek voor het bestuderen PPI door een fusie-eiwit met twee epitopen die wordt gezuiverd door middel van twee opeenvolgende APs ^{6, 7.} In dit artikel presenteren we een variant TAP methode voor het zuiveren van eiwit complexen waarin twee subeenheden worden gelabeld met verschillende epitopen en vervolgens door middel van twee opeenvolgende APs (STREP AP gevolgd door FLAG IP). Eerst geven we een minimalistische overzicht van TAP (figuur 1) en vervolgens een gedetailleerde beschrijving van de experimentele stappen (figuur 2), zodat onderzoekers ze kunnen toepassen op hun eiwitcomplex plaats.

Om de toepasbaarheid van de TAP methode te tonen, kozen we voor een goed gekarakteriseerd cycline-CDK complex (aangeduid als PTEFB kinase), dat uit de regulerende subeenheid cycline T1 (CycT1) en een kinase (CDK9) en is betrokken bij de regulatie van de transcriptie door RNA polymerase II (Pol II) ^{8, 9, 10.} P-TEFb fosforyleert het C-terminale domein van Pol II en de bijbehorende negatieve verlengingsfactoren, die transcriptionele pauzeren verlicht de promotor en vergemakkelijkt daardoor transcriptie elongatie ^{11, 12, 13.} Bij deze bekende interactie in het achterhoofd, STREP-tag CycT1 en-FLAG tag CDK9 waren meer dan uitgedrukt in HEK293T cellen. Een wederzijdse TAP experiment werd uitgevoerd met STREP tag CDK9 en FLAG-tag CycT1 verder bevestigen dat het eiwit interactie is onafhankelijk van het gebruikte epitopen. Cellen werden verzameld en gelyseerd 48 uur na transfectie. Het oplosbare lysaat werd gezuiverd door middel van TAP (STREP AP gevolgd door FLAGIK P). Input en gezuiverde eiwitten werden geanalyseerd met western blot en zilverkleuring (Figuur 3).

Protocol

1. Plating Cellen

1. Eén dag voor transfectie, plaat 3,5 x 10 ⁶ HEK293T-cellen in 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS) en 1% (v / v) penicilline / streptomycine (10.000 U / ml voorraad) per 100 mm schaal. Plate 3-5 schalen van 100 mm per experiment / voorwaarde om voldoende eiwit herstel te bewerkstelligen.
   Opmerking: Het aantal platen moet worden bepaald voor elk experiment / conditie, die zal afhangen van de expressieniveaus en de oplosbaarheid van het eiwitcomplex plaats. Als alternatief, als grootschalige zuivering nodig, cellijnen kunnen worden aangepast aan groei in suspensie in spinner flessen ^2, maar deze methode werkt niet voor transiënte transfecties.

2. cellen te transfecteren of induceren stabiele cellijnen

1. Op de volgende dag, controleer dan de cellen onder de microscoop. 80% confluent voordat proce - cellen moeten 70 zijnEding.
2. Transfecteren van de cellen met een totaal mengsel van 7 ug plasmide DNA en 21 pl transfectiereagens per 100 mm schaal. Transfecteren van cellen met een vector die GFP (Tabel 1) als controle voor transfectie-efficiëntie.
   OPMERKING: Bij gebruik van een HEK293-T-Rex en dergelijke stabiele cellijn die de expressie van twee of meer complexe subeenheden in reactie op doxycycline ^{14, 15} induceert, zal de inductor moeten de cellen worden toegevoegd en gedurende 48 uur. Evenzo zou een stabiele cellijn die de expressie van GFP na toevoeging van de inductor induceert eveneens vereist voor validatiedoeleinden. Ga verder met stap 2.7.
3. Bereid de transfectie mengsel per 100 mm schaal. In een 1,5 ml microcentrifugebuis, meng 500 pi DMEM niet aangevulde met 7 ug totaal plasmide DNA (corresponderend met twee of meer plasmiden). In een aparte microcentrifugebuis, meng 500 pi unsupplemented DMEM wie 21 ui van het transfectiereagens. Herhaal dit voor elke transfectie reactie.
4. Pipetteer de transfectiereagens oplossing in de plasmide-DNA-oplossing (niet oplossingen in omgekeerde volgorde door elkaar). Meng door pipetteren minstens 4 keer.
5. Incubeer dit mengsel bij kamertemperatuur gedurende 10 - 15 minuten, maar niet langer dan 15 min.
6. Kantel de plaat naar een media-reservoir te creëren en voorzichtig pipet de transfectie mengsel druppelsgewijs op de binnenkant van de plaat zonder verstoring van de cellen. Zet de schotel naar zijn oorspronkelijke vlakke stand en schud zachtjes aan het mengsel te verdelen.
7. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde celkweek incubator met 5% CO ₂ (deze toestand wordt hierna "weefselkweek incubator"). Vervang de media 5 uur na transfectie (optioneel).

3. Controle Transfectie of Inductie Efficiency

1. Op 24 uur na transfectie werden de cellen te visualiseren onder een grieporescent microscoop om te controleren op transfectie-efficiëntie (of inductie van controle HEK293T-Rex stabiele cellijn die GFP). Incubeer nog eens 24 uur.

4. STREP Affinity Purification (STREP AP)

1. Verzamelen van de cellen
   1. Op 48 uur na transfectie, verwijder de kaart en voeg 8 ml koude 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Pipet op en neer om cellen los te maken van de plaat.
   2. Verzamelen en breng de celsuspensie in een 15 ml buis en spin de cellen neer op 800 xg gedurende 4 min bij 4 ° C.
   3. Verwijder het supernatant PBS. Herhaal de spin neer (800 xg gedurende 1 min bij 4 ° C) PBS om resten te elimineren. Bewaar de cel pellet bij -80 ° C voor toekomstig gebruik of volg de onderstaande procedure om eiwitzuivering blijven.
2. Lyseren van de cellen
   1. Resuspendeer de cel pellets met behulp van 5 x het volume celpellet (~ 250 ul per plaat) van Passive Lysis Buffer(PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM _MgCl2, 1 mM DTT, proteaseremmer cocktail tablet, 5% v / v glycerol en 1,0% NP-40) en breng de celsuspensie een 1,5 ml microcentrifugebuis.
   2. Kort vortex de suspensie en nutate gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
   3. Spin down de celsuspensie bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
   4. Breng de oplosbare lysaten in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis en gooi de celpellets. 10% van het eindvolume van het oplosbare lysaat als "STREP AP Input". Bewaren bij 4 ° C.
3. In evenwicht brengen van de STREP kralen
   LET OP: Gebruik STREP parels voor de eerste AP stap! Complexen naar beneden getrokken met STREP kralen te herstellen aanzienlijk meer eiwitten dan die naar beneden getrokken met FLAG kralen.
   1. Zetten (n × 40 pl) + n gl van 50% STREP kraal slurry (n = aantal monsters) en spin neer bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C.
      OPMERKING: Gebruik wide-mouthed tips om pipet kralen.
   2. Verwijder de supernatant en voeg 500 ul van PLB aan de korrels. Nutate de korrels mengsel gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Spin down bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C.
      1. Herhaal dit voor een totaal van 3 wassingen. Resuspendeer de kralen in PLB tot een eindvolume van 40 pi n x.
   3. Voeg 40 ul van 50% STREP kraal suspensie aan elk cellysaat monster en nutate gedurende 2 uur bij 4 ° C.
4. STREP AP
   1. Spin down oplossing bij 1500 g gedurende 2 min bij 4 ° C.
   2. Verwijder de supernatant en opslaan als "STREP AP doorstroming (FT)" bij 4 ° C.
   3. Voeg 500 gl STREP AP wasbuffer I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM _MgCl2, 1 mM DTT, 5% glycerol en 0,2% NP-40) aan de korrels. Nutate de korrels mengsel gedurende 5 minuten bij 4 ° C en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
      1. Herhaal dit voor een totaal van 4 wasbeurten.
         NB: Voor de vierde spoeling, breng de kralenoplossing een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis aan het eiwit achtergrond te verminderen. Deze stap is essentieel.
   4. Voeg 500 ul wasbuffer II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl en 1 mM EDTA) en equilibreren de kralen door het omkeren van de buizen. Spin down op 1500 xg gedurende 2 minuten bij 4 ° C en gooi de supernatant.
   5. Elueer het eiwit van interesse met 50 ui STREP elutiebuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA en 2,5 mM desthiobiotine). Vortex bij 800 rpm gedurende 15 min bij 4 ° C.
   6. Spin down de kralen aan 1500 xg gedurende 1 min bij 4 ° C. Verzamel de bovenstaande vloeistof. Dit gedeelte komt overeen met de "AP STREP elutie" sample.
   7. Sparen de fractie kralen bij 4 ° C voor een tweede elutie, die zou kunnen opleveren om de helft van de hoeveelheid eiwit verkregen met de eerste elutie. Aliquot 10% van de STREP AP Elution voor zilverkleuring en / of Western blotting^16.
5. In evenwicht brengen van de FLAG kralen
   1. Neem (nx 16 ul) + n ul van FLAG kralen oplossing (n = aantal monsters) en spin neer op 1500 xg gedurende 2 minuten bij 4 ° C.
      OPMERKING: Gebruik brede mond tips om pipet kralen.
   2. Verwijder de supernatant en voeg 500 ul van FLAG wasbuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA en 0,1% NP-40) aan de korrels. Spin down bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Herhaal dit voor een totaal van 3 wassingen.
   3. Resuspendeer de kralen in FLAG wasbuffer tot een eindvolume van 16 pl nx.
   4. Voeg 16 ul van de FLAG kraal slurry de resterende STREP AP elutie nutate en overnacht bij 4 ° C.

5. FLAG IP

1. Spin down de FLAG parels suspensie bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Bewaar het supernatant en opslaan als "FLAG IP flow-through" (FT) bij 4 ° C.
2. Voeg 50081, l van FLAG wasbuffer aan de oplossing. Nutate gedurende 5 minuten bij 4 ° C en centrifugeer bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Herhaal dit voor een totaal van 4 wast en verwijder het supernatant na elke wasbeurt.
   Opmerking: Voor de vierde spoeling, overdracht van de proteïne-kralenoplossing een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis om de achtergrond te verminderen. Deze stap is essentieel.
3. Verwijder de bovenstaande vloeistof uit de laatste spin en voeg 30 ul van FLAG wasbuffer die 200 ng / ul van FLAG-peptide in de kralen. Vortex bij 800 rpm gedurende 2 uur bij 4 ° C.
4. Spin down de suspensie bij 1500 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Oogst de supernatant en bewaar bij 4 ° C als de "FLAG IP Elution."
   OPMERKING: De elutie monsters kunnen worden bevestigd door zilverkleuring en / of Western blot met behulp van standaard protocollen ¹⁶ en zijn klaar voor verdere eiwitassays. Bij het opzetten van een western blot, draaien alle van de volgende monsters: (1) STREP AP Input, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutiop, (4) FLAG IP FT, en (5) FLAG IP Elutie. Volumes geladen moeten worden bepaald voor elk experiment. Alle verzamelde monsters en korrels kunnen voor kortstondige opslag en bij -80 ° C voor langdurige opslag worden bewaard bij 4 ° C. TAP monsters kunnen worden geanalyseerd met massaspectrometrie om de identiteit van de onderdelen controleren op nieuwe post-translationele modificaties (PTM) identificeren en / of voor een nieuw eiwit interactie met het gezuiverde complex ^{2, 17} ontdekken. Daartoe na het uitvoeren van een Coomassie gel of zilverkleuring, banden kan worden uitgesneden uit de gel met een schone scalpel. Diverse uitstekende recensies die massaspectrometrie methoden te bespreken werden eerder gepubliceerd ^{18, 19.}

Resultaten

In dit artikel tonen we de toepassing van de TAP methode om de goed gekarakteriseerde CycT1 CDK9-complex (ook bekend als P-TEFb kinase).

Plasmiden die Cycline T1-STREP (CycT1: S) en CDK9-FLAG (CDK9: F) of CDK9-STREP (CDK9: S) en cycline T1-FLAG (CycT1: F) (Tabel 1) werden getransfecteerd in HEK293T-cellen . Negatieve controles opgenomen transfecties met een lege vector en CDK9: F of CycT1: F plasmiden ...

Discussie

De hier beschreven voor de expressie en isolatie van eiwitcomplexen van eukaryote cellen protocol is niet beperkt tot de biochemische eigenschappen van deze moleculaire samenstellingen, maar kan ook worden gebruikt voor de identificatie van nieuwe interactorenen post-translationele modificaties die de functie kan regelen. Het gebruik van affiniteitsmerkers is niet beperkt tot hetgeen vermeld in dit protocol; maar onze ervaring leert dat het gebruik STREP als eerste AP stap verbetert aanzienlijk de opbrengst van het uite...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH3002.2FS
Fetaal bovien serum	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH30071
Penicillin/Streptomycin	MP Biomedicals	MP091670049
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836153001
STREP-Tactin Superflow	IBA Lifesciences	2-1208-010
STREP-tag elutie buffer	IBA Lifesciences	2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	F2426
Corning 100 mm × 20 mm stijl celkweekschotel behandeld nonpyrogen polystyreen 20/sleeve	Corning	430167
Protein Lo-Bind Eppendorf	Eppendorf	022431081
Digital Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-370
48 gats microbuis schuimrek	Fisher Scientific	02-215-386
Labquake shaker rotisserie	Thermo	415110