Methodenartikel

MitoCeption: overbrengen geïsoleerde menselijke MSC Mitochondriën aan glioblastoma Stamcellen

DOI:

10.3791/55245

⸱

22 februari 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine and Biotherapy (IRMB), INSERM U1183, Montpellier University, 2Institute of Neurosciences of Montpellier (INM), INSERM U1051, Montpellier University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier, wordt een protocol (MitoCeption) voorgelegd aan mitochondriën geïsoleerd uit menselijke mesenchymale stamcellen (MSC) over te dragen, glioblastoma stamcellen (GSC), met als doel het bestuderen van hun biologische effecten op het metabolisme en de functies SGR. Een soortgelijk protocol kan worden aangepast aan mitochondriën dragen tussen andere celtypen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriën spelen een centrale rol voor de celstofwisseling, de productie van energie en de controle van apoptose. Onvoldoende mitochondriale functie is verantwoordelijk voor de zeer uiteenlopende ziekten gevonden, variërend van neurologische aandoeningen aan kanker. Interessant mitochondria is onlangs aangetoond dat het vermogen weer worden overgedragen tussen celtypen, zoals uit menselijke mesenchymale stamcellen (MSC) om kankercellen in coculture omstandigheden met metabole en functionele consequenties voor de mitochondriën ontvangende cellen, verdere verbetering van de huidige belangstelling de biologische eigenschappen van deze organellen.

De effecten van de MSC overgedragen mitochondriën in de doelcellen van primair belang voor de biologische resultaat van deze cel-cel interacties begrijpen. De MitoCeption protocol beschreven voor de overdracht van de mitochondria vooraf geïsoleerd uit de donorcellen aan de doelcellen met behulp MSC mitochondriaen glioblastoma stamcellen (SGR) als modelsysteem. Dit protocol is eerder gebruikt om mitochondriën geïsoleerd overbrengen van MSCs tot MDA-MB-231 kankercellen beoefenaar. Deze mitochondria transfer protocol wordt hier aangepast voor GSCs dat de specifieke bijzonderheid van groeien als neurosferen in vitro te presenteren. De overdracht van de geïsoleerde mitochondria kan worden gevolgd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en confocale beeldvorming met behulp mitochondria vitale kleurstoffen. Het gebruik van mitochondria donor en doelcellen met verschillende haplotypen (SNPs) maakt ook detectie van het overgedragen mitochondriën gebaseerd op de concentratie van de cirkelvormige mitochondriaal DNA (mtDNA) in de doelcellen. Nadat het protocol is gevalideerd met deze criteria, kunnen de cellen die de overgedragen mitochondria verder geanalyseerd om het effect van de exogene mitochondriën biologische eigenschappen zoals celmetabolisme, plasticiteit, proliferatie en respons op behandeling vast te stellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriën zijn organellen in eukaryote cellen waar ze een centrale rol spelen bij voedselopname en energie en metabolietproductie. Deze organellen bevatten circulair mitochondriaal DNA (mtDNA), 16,6 kb lang, dat eiwitten van het elektron transport keten complexen, tRNA en rRNA 1 codeert. De functionaliteit van deze organellen is essentieel voor celhomeostase en verscheidene ziekten zijn geassocieerd met dysfunctie mitochondria 1, 2, 3. De status mitochondria is bijvoorbeeld in verband gebracht met ontsteking, chronische infecties en kanker, in het laatste geval met gevolgen voor metastase en therapieresistentie 4, 5, 6, 7.

Mitochondriën tonen de opmerkelijke capaciteit van krijgen overgedragen tussen "donor" en "target" cellen. Dit leidt tot veranderingen in de energetische metabolisme van de doelcellen en in andere functionele modificaties zoals weefselherstel en resistentie tegen chemotherapeutische middelen, zoals onlangs aangetoond door verschillende laboratoria 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. De menselijke mesenchymale stamcellen (MSC's) tonen het vermogen om mitochondriën te dragen aan een grote verscheidenheid aan doelcellen, zoals cardiomyocyten, endotheelcellen, pulmonaire alveolaire epitheelcellen, renale tubulaire cellen en kankercellen, leidend tot modificaties van de functionele eigenschappen van deze cellen 8,> 9, 10, 12, 17, 18.

Mitochondriën uitwisseling wordt nu als een veel gebruikt mechanisme dat een aantal verschillende celtypen te communiceren met elkaar en hun biologische eigenschappen wijzigen. Deze mitochondria uitwisseling kan plaatsvinden door middel van tunneling nanobuisjes (TNT) formatie, waarbij connexine 43-bevattende gap junctions 8 of M-Sec / TNFaip2 en de exocyst complex 19. Als alternatief werd de mitochondriën overdracht ook getoond te worden gemedieerd door arrestin-domein bevattend eiwit 1 gemedieerde microvesicles (ARMMs) 20. Interessant is dat de effectiviteit van de mitochondria overschrijving verbonden met de expressiesnelheid van de Rho GTPase 1 MIRO1 21, een belangrijke factor voor het verklaren van de verschillen in mitochondria overdracht efficacies tussen iPSC-MSCs en volwassen BM-MSC 22.

Desondanks schat aan gegevens betreffende cel-cel mitochondriën uitwisseling relatief weinig bekend over het metabolisme en biologische uitkomst van deze mitochondria overdracht. Daarom rechtvaardigt het opzetten van de juiste tools om de biologische effecten van deze overdracht volledig te kunnen beoordelen. Door de jaren heen een aantal technische benaderingen overbrengen mitochondria van donor naar acceptor cellen zijn voorgesteld. Dit omvat directe injectie van mitochondriën in oöcyten 23, 24, 25, celfusie te 26 genereren transmitochondrial cybriden, 27 en, meer recentelijk, de overdracht van geïsoleerde mitochondria gebruik fotothermische nanoblades 28.

Wij en anderen eerder aangetoond het vermogen van geïsoleerde mitochondria worden geïnternaliseerd door levende cellen, zoals waargenomen zowel in vitro als in vivo 29, 30, 31, via mechanismen voorgesteld macropinocytose 32 betrekken. Verder hebben we een methode ontwikkeld, genaamd MitoCeption om kwantitatief geïsoleerde mitochondria (van MSCs) aan doelcellen, zoals bijvoorbeeld de (lid) MDA-MB-231 borstkanker cellijn 31. Dit protocol werd aangepast hier voor de overdracht van geïsoleerde menselijke MSC mitochondriën glioblastoma stamcellen (GSC).

Glioblastoom zijn agressieve kwaadaardige tumoren van de hersenen die snel resistent zijn tegen behandeling te worden, vooral als gevolg van glioblastoma stamcellen (GSC) die aanwezig zijn in de tumor 33. Deze GSCs groeien als neurosferen in vitro en het genereren van tumoren in xenograft modellen. Kankercellen binnen glioblastoma hebben devermogen om cel-cel verbindingen te maken, zoals recent aangetoond voor astrocyten hersentumor cellen die interconnect via uitgebreid microbuizen, waardoor mitochondriën (als calcium en celkernen) kan migreren, wat resulteert in radiotherapie-resistente astrocytoom netwerken 34. Glioblastoma een groot aantal verschillende cellen rekruteren in de tumor micro-omgeving, zoals MSC's 35, 36. We toonden aan dat MSCs cel-cel verbindingen met GSC in coculture kunnen maken en hun mitochondria (gegevens niet getoond), die naar verwachting SGR functionele eigenschappen te wijzigen overdragen. Dit protocol beschrijft hoe de MitoCeption techniek kan worden gebruikt om mitochondriën geïsoleerd voren brengen van menselijke MSCs, menselijke GSCs met de bepaling van de functionele biologische uitkomst. De multipotente en zeer tumorigene GB4 GSC lijn 37 werd gebruikt in deze studie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dag 1

1. Etikettering van de mesenchymale stamcel (MSC) Mitochondriën (optioneel)

  1. Twee dagen voor de bereiding mitochondria, zaad menselijke MSCs in een 100 mm kweekschaal, in 10 ml aMEM / 10% FBS, om 4 x 10 5 MSC's in cultuur op dag 1.
  2. MSCs spoelen met PBS (4 ml) en voeg 4 ml aMEM / FBS 1% (voorverwarmd tot 37 ° C).
  3. Voeg de vereiste hoeveelheid mitochondria vitale kleurstof en incubeer cellen gedurende 30 min in 37 ° C incubator.
  4. Verwijder de mitochondria kleurstofoplossing, tweemaal spoelen cellen met 4 ml voorverwarmd (37 ° C) aMEM / FBS 1% en voeg opnieuw 4 ml aMEM / 10% FBS. Incubeer cellen bij 37 ° C.
  5. Verander het kweekmedium (10 ml aMEM / FBS 10%) na 30 min en een andere keer, 2 uur later.

Dag 1

2. Etikettering van de Glioblastoma Stem Cells (GSC) (optioneel, zie Overleg sectie)

Celkweekmedium Samenstelling
GSC basismedium DMEM / F-12 gesupplementeerd met
Insuline 20 mg / ml
N2 supplement 1x
Glucose 3 g / l
L-glutamine 2 mM
GSC proliferatie medium Toe te voegen aan de basale medium:
B27 supplement 1x
EGF 10 ng / ml
bFGF 10 ng / ml
Fungine 10 mg / ml
Fungizone 0,25 mg / ml
Heparine 2 mg / ml
Ciprofloxacine 2 ug / ml
Gentamicine 2 ug / ml
MSC proliferatie medium & #945, MEM gesupplementeerd met
L-glutamine 2 mM
10% FBS
bFGF 2 ng / ml

Tabel 1: Culture Media.

  1. Distantiëren GSCs (GB4 cellijn 32 (10 x 10 6 cellen) gekweekt als neurosferen op poly-HEMA gecoate celkweek kolven (zie stap 3,1-3,12).
  2. GSC zaad in een 48-well plaat bij 10 5 cellen / putje in GSC proliferatie medium (500 pl) (zie tabel 1).
  3. Centrifugeer de plaat bij 270 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C.
  4. Voeg de vereiste hoeveelheid cellen vitale kleurstof en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  5. Voeg 500 pl GSC basaal medium (tabel 1) per putje van de 48-well plaat.
  6. Centrifugeer de plaat bij 270 x g bij 20 ° C gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant.
  7. Herhaal stap 2,5-2,6.
  8. Voeg 500 pl GSC basismedium en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
  9. Centrifugeer de plaat bij 270 x g bij 20 ° C gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant.
  10. Voeg 500 pl GSC proliferatie medium per putje van de 48-well plaat en incubeer in de 37 ° C incubator.
    Opmerking: De hoeveelheid GSC aangegeven (10 x 10 6 cellen) kan uitvoeren van verschillende dosis-respons experimenten en FACS controles. Zodra de experimentele omstandigheden nauwkeuriger gedefinieerd dit bedrag kan worden afgebouwd.

Dag 2

3. Seeding van glioblastoma Stem Cells

  1. Verzamel de GSC neurosferen (10 x 10 6 cellen) door centrifugatie bij 270 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C in een 50 ml buis.
  2. Was de cellen met 5 ml HBSS en centrifugeer bij 270 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C.
  3. Zuig het supernatant.
  4. Voorzichtig resuspendeer de SGR pellet in 100 ui trypsine-EDTA (0,25%) (per 10 x 10 6 cellen)
  5. Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 min.
  6. Voeg 10 gl CaCl2 (20 mM) en 2 gl DNase I (10 mg / ml).
  7. Distantiëren de neurospheres door zachtjes en neer te pipetteren (30-50x) met een P200 pipet. Vermijd bubbels. Controleer onder de microscoop dat alle GSC's worden gescheiden.
  8. Voeg 10 ul trypsine inhibitor (5%) en 10 ml HBSS.
  9. Centrifugeer GSCs bij 270 xg gedurende 7 minuten bij 20 ° C.
  10. Verwijder het supernatant en voeg 10 ml GSC basaal medium (tabel 1).
  11. GSC rekenen met een Thoma telkamer en centrifugeer de cellen bij 270 xg gedurende 7 minuten bij 20 ° C.
  12. Voeg de juiste hoeveelheid GSC proliferatie medium (tabel 1) bij de cellulaire concentratie van 10 6 GSC / ml bereikt.
  13. Zaad 10 5 GSC (100 pl van de celsuspensie) per putje van een 96-wells plaat.
  14. Centrifugeer de platen bij 270 xg gedurende 7 minuten bij 20 ° C te GSCs krijgen op het bottom putten.
  15. Incubeer de 96-well plaat bij 37 ° C wanneer deel 5.

Dag 2

4. MSC Mitochondriën Isolation

  1. Stel de microbuis centrifuge temperatuur tot 4 ° C.
  2. Bereid twee 1,5 ml buisjes "A" en "C" met de reagentia voor de mitochondriën extractie (200 ul reagens A en 400 pi reagens C, zowel met de EDTA-vrije protease remmers). Bereid 2 andere tubes, het label "MSC" en "Mito". Houd alle buizen op ijs. Ook bereiden buizen voor de mitochondriën seriële verdunningen.
  3. MSCs wassen met 10 ml voorverwarmd (37 ° C) PBS.
  4. MSCs wassen met 2 ml trypsine (geen EDTA) gedurende 10 sec en voeg 1 ml trypsine (zonder EDTA). Incubeer cellen gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C.
  5. Herstellen van de MSC's door het toevoegen van 10 ml aMEM / FBS 10%, over te dragen aan een 50 ml buis.
  6. Centrifugeer cellen bij 270 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C.
  7. Verwijder het supernatant en voeg10 ml aMEM / 10% FBS aan de cel pellet.
  8. Tel de MSC's met een Malassez telkamer.
  9. Centrifuge MSCs (4-5 x 10 5) bij 270 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C.
  10. Verwijder het supernatant, voeg 10% 1 m ijskoude aMEM / FBS aan de celpellet en overbrengen van de cellen naar de "MSC" gemerkte buis (bereid bij stap 4.2). Houd de buis op ijs.
  11. Centrifugeer de buis met het MSC's bij 900 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  12. Verwijder alle resten van het medium van de buis.
  13. Voeg 200 ul van Mitochondriën Isolation Reagent A (met de EDTA-vrije protease remmers). Vortex bij gemiddelde snelheid gedurende 5 seconden en laat buizen op ijs gedurende precies 2 minuten.
  14. Voeg 2,5 ul van Mitochondriën Isolation Reagens B. Vortex op maximale snelheid gedurende 10 seconden, en dan laat buizen op ijs. Herhaal elke 30 seconden gedurende 5 min.
  15. Voeg 200 ul van Mitochondriën Isolation Reagens C (met de EDTA-vrije protease remmers). Meng door het kantelen van de buis (roughly 30 keer, niet vortex). Centrifugeer de buis bij 700 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
  16. Breng de supernatant (dat het MSC mitochondria) op "Mito" tube (bereid bij stap 4.2).
  17. Centrifugeer bij 3000 xg, 15 minuten bij 4 ° C, de mitochondria pellet krijgen. Verwijder het supernatant. De pellet bevat het geïsoleerde mitochondria.
  18. Spoel de mitochondria pellet met 200 ul van de reagens C. Vervolgens centrifuge bij 12.000 xg, 5 min bij 4 ° C, de mitochondria pellet krijgen.

5. Overdracht van geïsoleerde MSC Mitochondriën om GSCs (MitoCeption)

  1. Voeg 200 ul van de vooraf gekoelde (0 ° C) GSC proliferatie medium naar de mitochondriën pellet geïsoleerd uit MSCs (4 x 10 5).
  2. Verdun de mitochondria preparaat (in GSC proliferatie gemiddeld) consistent 20 ui mitochondriale suspensie toevoegen GSCs.
  3. Voeg het volume van geïsoleerde mitochondria in de putjes van de 96-well plaat met de GSC (uit stap 3,15), in de gewenste concentratie (0,1 tot 10 ug). Voeg de mitochondria langzaam, dicht bij de bodem van de put, die het gehele oppervlak ten minste eenmaal.
  4. Bestrijding MSC mitochondria vitale kleurstof lekkage dezelfde hoeveelheden van de mitochondria preparaat (0,1 tot 10 ug) toevoegen aan putjes van een 96-well plaat met GSC proliferatie medium alleen (geen GSC) (zie deel 6,2 voor vitale kleurstof lekdetectie).
  5. Centrifugeer de 96-well plaat met de mitochondria ontvanger GSCs de mitochondria MSC (stap 5.3) en de stuurplaat (stap 5,4) bij 1500 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
  6. Plaats de kweekplaten in de 37 ° C celincubator onmiddellijk na centrifugeren.
    Opmerking: De mitochondria overdrachtsprotocol voert het centrifugeren van de mitochondriën vering van de gekweekte cellen op de passende centrifugatie kracht, met een aantal centrifugeren kunnen worden aangepast afhankelijk van de system mitochondria donor / ontvanger-cellen.

Dag 3

6. Analyse van de mitochondria Transfer door FACS en confocale Imaging

  1. Bereiding van GSC monsters voor FACS-analyse
    Opmerking: Als MSC mitochondria werden gelabeld met een vitale kleurstof vooraf (paragraaf 1), kan de efficiëntie worden gevolgd door FACS, 24 uur na de mitochondriën overdracht.
    1. Centrifugeer de 96-well plaat met de MitoCepted GSCs bij 270 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C.
    2. Verwijder het supernatant.
    3. Voeg 100 ul trypsine (geen EDTA) in elk putje. Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 min. Pipet op en neer naar de neurosferen gevormd in de 24 uurs periode distantiëren.
    4. Voeg 100 ul van GSC basale medium.
    5. Centrifugeer de plaat bij 270 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C en werp de supernatant.
    6. Resuspendeer GSC's in 300 ul GSC basaal medium en transfer naar FACS aangepaste buizen.
    7. Voer de FACS eenalysis.
  2. Controle voor mitochondria vitale kleurstof lekkage uit de geïsoleerde mitochondriën (FACS)
    Noot: Het doel van deze stap is de achtergrond FACS signaal dat zou duiden op een echte MSC overdracht mitochondria maar eerder het enkele lekken van vitale kleurstof van de gelabelde MSC mitochondriën voor MitoCeption (stap 5,3) te bepalen.
    1. Zaad SGR cellen zoals beschreven in stap 3,1-3,15.
    2. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    3. Centrifugeer de 96-well plaat met mitochondria slechts (van stap 5,4-5,6) bij 1500 g gedurende 5 min bij 20 ° C.
    4. Zuig het kweekmedium van de GSC 96-well plaat (stap 6.2.2) en vervang deze door het medium geïncubeerd met mitochondriën alleen (supernatant van stap 6.2.3).
    5. Incubeer de 96-well plaat met de GSC bij 37 ° C gedurende 2 uur.
    6. Ga als in de stappen 6.1.1 tot en met 6.1.7 voor FACS-analyse.
  3. Voorbereiding van de GSC samples voor confocale beeldvorming
    Opmerking: Indien de overdracht van MSC mitochondriën om GSCs moet worden geanalyseerd met behulp van fluorescentie beeldvorming, zowel MSC en GSCs moet vooraf respectievelijk worden geëtiketteerd, met mitochondriën (stap 1) en mobiele (stap 2) vitale kleurstoffen.
    1. Bereid GSCs zoals in de stappen 6.1.1 tot en met 6.1.5.
    2. Resuspendeer GSCs in 2 ml GSC proliferatie medium dat 2% FBS en zaad in 35 mm cultuur gerechten (glazen bodem).
    3. Voeren confocale beeldvorming op GSCs met de overgedragen fluorescerende mitochondria MSC 24 uur later.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De procedurestappen waarin de isolering van mitochondriën uit mesenchymale stamcellen (MSC) en de overdracht van het beoogde glioblastoma stamcellen (GSC) van MitoCeption zijn weergegeven in figuur 1. GSCs zijn kanker stamcellen gekweekt als neurospheres om hun stamcellen eigenschappen te behouden. Voor het protocol, worden GSCs gezaaid als enkele cellen van een paar uur voor de overdracht van de mitochondria (stap 3) tot een hogere mitochondria overdracht efficiency toe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Steeds studies tonen aan dat cellen mitochondriën kunnen uitwisselen en dat deze mitochondriën ingrijpende effecten op de doelcel metabolisme en functie. Daarom is het essentieel om de juiste spullen voor mitochondria kwantitatief uit de donorcellen deze doelcellen goed bestuderen van de biologische effecten mogelijk te maken.

De hier beschreven protocol was oorspronkelijk uitgewerkt mitochondriën geïsoleerd uit menselijke mesenchymale stamcellen dragen aan de hechtende kanker cellijn MDA-MB...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), waarmee CJ en ML.V. zijn aangesloten, heeft een octrooiaanvraag ingediend op de MitoCeption techniek (EP14306154.7).

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Andrea Parmeggiani (L2C en DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier), evenals leden van het laboratorium voor nuttige discussies, Christophe Duperray voor hulp bij de FACS-analyse, het Montpellier RIO imaging faciliteit (MRI) voor het leveren van de adequate omgeving voor FACS en confocale microscopie. BNM werd ondersteund door een afgestudeerde beurs van de Labex Numev (conventie ANR-10-LabX-20). AB werd ondersteund door een undergraduate beurs van de Universiteit van Warschau en de Europese Unie (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV is een staf wetenschapper van het Nationaal Centrum voor Wetenschappelijk Onderzoek (CNRS).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Mitochondria Isolation Kit for Tissue Fisher Scientific 10579663
N-2 Supplement (100x)Fisher Scientific11520536
B-27 Supplement W/O VIT A (50x)Fisher Scientific 11500446
HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ SigmaH4385
poly Heme Sigma P3932
aMEM w/o glutamineOzymeBE12-169F
DMEM/F-12 without glutamineFisher Scientific 11540566
L-Glutamine Invitrogen 25030-024 
Glucose Sigma G7021
Insuline Sigma I 1882 
Human bFGF R&D Systems233-FB-025
Human EGF Peprotech AF-100-15 
HeparinSigmaH3149 
CaCl2MERCK2382
Trypsine InhibitorSigma T9003
DNase ISIGMA 10104159001
Trypsine 0.25% / EDTA 1 mMInvitrogen 25200056
TrypsinGibco 15090-046
Protease inhibitors EDTA freeSigma4693159001
Ciprofloxacine Sigma17850-5G-F
Fungine Invivogenant-fn-1
Fungizone Thermofisher15290018
GentamycinEuromedexEU0410
MitoTracker Green FMMolecular ProbesM7514
MitoTracker Red CMXRosMolecular Probes M7512
MitoTracker Deep Red FMMolecular Probes M22426 
CellTracker Green CMFDAMolecular ProbesC7025
CellTracker Blue CMF2HCMolecular ProbesC12881
RIPASanta Cruzsc-24948
FluoroDish Sterile Culture DishWorld Precision InstrumentsFD35-100
HemacytometerFisher Scientific267110
FACS tubesBeckman Coulter2.523.749
FACS apparatusGallios  3L 10C
LC FAST START DNA MASTER PLUS Roche3515885001

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
  2. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  3. Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles. BMC Biol. 12 (1), 34(2014).
  4. Schulze, A., Harris, A. L. How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption. Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).
  5. Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. Cancer stem cell metabolism. Breast Cancer Res. 18 (1), 55(2016).
  6. LeBleu, V. S., et al. PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis. Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).
  7. Liu, S., Feng, M., Guan, W. Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond. Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).
  8. Islam, M. N., et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).
  9. Pasquier, J., et al. Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance. J Transl Med. 11, 94(2013).
  10. Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. Exp Cell Res. 316 (15), 2447-2455 (2010).
  11. Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
  12. Liu, K., et al. Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer. Microvasc Res. 92, 10-18 (2014).
  13. Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).
  14. Gurke, S., et al. Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells. Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).
  15. Vallabhaneni, K. C., Haller, H., Dumler, I. Vascular smooth muscle cells initiate proliferation of mesenchymal stem cells by mitochondrial transfer via tunneling nanotubes. Stem Cells Dev. 21 (17), 3104-3113 (2012).
  16. Wang, X., Gerdes, H. H. Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells. Cell Death Differ. 22 (7), 1181-1191 (2015).
  17. Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).
  18. Acquistapace, A., et al. Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer. Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).
  19. Hase, K., et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex. Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).
  20. Phinney, D. G., et al. Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs. Nat Commun. 6, 8472(2015).
  21. Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
  22. Zhang, Y., et al. iPSC-MSCs with High Intrinsic MIRO1 and Sensitivity to TNF-a Yield Efficacious Mitochondrial Transfer to Rescue Anthracycline-Induced Cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 7 (4), 749-763 (2016).
  23. Takeda, K., et al. Influence of intergeneric/interspecies mitochondrial injection; parthenogenetic development of bovine oocytes after injection of mitochondria derived from somatic cells. J Reprod Dev. 58 (3), 323-329 (2012).
  24. Takeda, K., et al. Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes. Biol Reprod. 72 (6), 1397-1404 (2005).
  25. Van Blerkom, J., Sinclair, J., Davis, P. Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochondrial donation and the issue of heteroplasmy. Hum Reprod. 13 (10), 2857-2868 (1998).
  26. Ishikawa, K., et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis. Science. 320 (5876), 661-664 (2008).
  27. Kaipparettu, B. A., Ma, Y., Wong, L. J. Functional effects of cancer mitochondria on energy metabolism and tumorigenesis: utility of transmitochondrial cybrids. Ann N Y Acad Sci. 1201, 137-146 (2010).
  28. Wu, T. H., et al. Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells. Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).
  29. Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).
  30. Kitani, T., et al. Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory. Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).
  31. Caicedo, A., et al. MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function. Sci Rep. 5, 9073(2015).
  32. Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells. Sci Rep. 6, 26057(2016).
  33. Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).
  34. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  35. Shinojima, N., et al. TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells. Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).
  36. Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme. Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).
  37. Guichet, P. O., et al. Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors. Glia. 61 (2), 225-239 (2013).
  38. Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing. BMC Genomics. 14, 881(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mitochondri le overdrachtmesenchymale stamcellenisolatie van mitochondriafluorescentie geactiveerde cel sorteringconfocale beeldvorminganalyse van mitochondriaal DNAbeoordeling van het celmetabolismeneurosfeer kweektunnellerende nanotubuli

Gerelateerde artikelen