Methodenartikel

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

DOI:

10.3791/55255

⸱

24 mei 2017

 ,  ,  , 
1Stem Cell and Regenerative Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR, 2Computational and Systems Biology, Genome Institute of Singapore, A*STAR

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier worden we gedetailleerd beschreven over de methode van S- vergelijking van P- soralen verknoopt, L igated en S gekozen H ybrids (SPLASH), die genoom-wide mapping van intramoleculaire en intermoleculaire RNA-RNA interacties in vivo mogelijk maakt . SPLASH kan toegepast worden om RNA-interacties van organismen te bestuderen, waaronder gist, bacteriën en mensen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het weten hoe RNA's met zichzelf en met anderen interageren, is de sleutel tot het begrijpen van RNA-gebaseerde genregulering in de cel. Terwijl voorbeelden van RNA-RNA-interacties, zoals microRNA-mRNA-interacties, zijn aangetoond dat de expressie van genen wordt geregeld, is de volledige mate waarin RNA-interacties zich voordoen in de cel nog steeds onbekend. Eerdere methoden om RNA-interacties te bestuderen hebben voornamelijk betrekking op subsets van RNA's die interactie hebben met een bepaald eiwit- of RNA-soort. Hierin geven we een methode aan, genaamd S- vergelijking van P- soralen verknoopt, L igated, en S gekozen H ybrids (SPLASH), die genoom-breed vastleggen van RNA-interacties in vivo op een onpartijdige manier mogelijk maakt. SPLASH maakt gebruik van in vivo crosslinking, proximity ligatie en high throughput sequencing om wereldwijd intramoleculaire en intermoleculaire RNA base pairing partners te identificeren. SPLASH kan worden toegepast op verschillende organismen, waaronder bacteriën, gist en menselijke cellen, evenals aS diverse cellulaire condities om het begrip van de dynamiek van RNA organisatie onder diverse cellulaire contexten te vergemakkelijken. Het volledige experimentele SPLASH-protocol duurt ongeveer 5 dagen om te voltooien en de berekeningswerkstroom duurt ongeveer 7 dagen om te voltooien.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het bestuderen van hoe macromoleculen elkaar vouwen en interageren, is de sleutel tot het begrijpen van genregulering in de cel. Hoewel er in het afgelopen decennium veel moeite werd gelegd om te begrijpen hoe DNA en eiwitten bijdragen tot genregulatie, is er relatief minder bekend over posttranscriptie van genexpressie. RNA voert informatie in zowel zijn lineaire volgorde als in zijn secundaire en tertiaire structuur 1 . Het vermogen om met zichzelf en met anderen te koppelen, is belangrijk voor zijn functie in vivo . Recente vooruitgang in high-through RNA secundaire structuuronderzoek heeft waardevolle inzicht gegeven in de locaties van dubbele en enkelstrengige gebieden in de transcriptome 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer informatie over de pairing interaction partners is nog steeds grotendeels ontbreken. Om te bepalen welke RNA-sequentie in wisselwerking met een ander RNA-gebied in het transcriptomeet is, hebben we wereldwijde paar-wise informatie nodig.

Mapping pair-wise RNA interacties op een globale, onpartijdige manier is traditioneel een grote uitdaging geweest. Terwijl eerdere benaderingen, zoals CLASH 9 , hiCLIP 10 en RAP 11 , worden gebruikt om RNA-interacties op grote schaal te identificeren, worden deze technieken typisch RNA-basisparen in kaart gebracht voor een subset van RNA's die ofwel interactie hebben met een bepaald eiwit of RNA-soort. Recente ontwikkelingen bij het bestuderen van globale RNA-interacties omvatten de methode RPL 12 , die geen RNA-interacties in vivo stabiliseert en derhalve alleen een subset van in vivo interacties kan vastleggen. Om deze uitdagingen te overwinnen hebben we en anderen ontwikkeld genoom-brede, onbevooroordeelde strategieën voor maP RNA-interacties in vivo , onder gebruikmaking van gemodificeerde versies van de crosslinkerpsoralen 13 , 14 , 15 . In dit protocol beschrijven we de details voor het uitvoeren van S- vergelijking van P- soralen verknoopt, L igated en S gekozen H ybrids (SPLASH), die biotinyleerde psoralen gebruikt om RNA's in vivo te crosslinken, gevolgd door proximale ligatie en high-through sequencing naar Identificeer RNA base-pairing partners genoom breed ( figuur 1 ) 15 .

In dit manuscript beschrijven we de stappen om SPLASH uit te voeren met behulp van gekweekte aanhechtende cellen, in dit geval HeLa-cellen. Hetzelfde protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan suspensie zoogdiercellen en aan gist- en bacteriecellen. In het kort worden HeLa-cellen behandeld met biotinyleerde psoralen en bestraald bij 365 nm om interactie RNA-basisparen in vivo te crosslinken. De RNA's worden dan geëxtraheerd uit de cellen, gefragmenteerd en verrijkt voor verknopingsgebieden onder toepassing van streptavidine kralen. Interactieve RNA-fragmenten worden dan gelijktijdig gelijktijdig gelijktijdig gelegeerd en in een cDNA-bibliotheek gemaakt voor diepvolgorde. Bij sequentiebepaling worden de chimere RNA's op het transcriptoom / genoom toegewezen om de RNA-interactie-gebieden die met elkaar gepaard zijn te identificeren. We hebben SPLASH succesvol gebruikt om duizenden RNA-interacties in vivo te identificeren in gist en verschillende menselijke cellen, waaronder intramoleculaire en intermoleculaire RNA base pairing in diverse klassen van RNA's, zoals snoRNAs, lncRNAs en mRNAs, om te kijken naar de structurele organisatie en interactiepatronen Van RNA's in de cel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Behandeling van HeLa-cellen met biotinyleerde psoralen- en RNA-extractie

  1. Cultuur HeLa cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runder serum (FBS) en 1% penicilline streptomycine (PS) in een 10 cm plaat.
  2. Was de HeLa-cellen tweemaal met 5 ml 1x PBS. Draag de overmaat PBS volledig uit de schotel door de schotel verticaal te plaatsen gedurende 1 minuut.
  3. Voeg 1 ml PBS met 200 μM biotinyleerde psoralen en 0,01% w / v digitonine, gelijkmatig aan de cellen en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Terwijl biotinylated psoralen de cel kan binnengaan, is de doorlatendheid veel hoger wanneer de cellen gedurende 5 minuten blootgesteld worden aan lage hoeveelheden digitonine (0,01%)
  4. Verwijder het deksel van de 10 cm-plaat die de behandelde HeLa-cellen bevat en plaats het gerecht plat op ijs. Bestral de schotel die de cellen bevat met 365 nm UV gedurende 20 minuten op ijs, op een afstand van 3 cm van de UV-lampen, met behulp van de UV-crosslinker.
  5. Isoleer tOtal RNA van HeLa cellen door guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie volgens het protocol van de fabrikant. Voeg 1: 1 volume isopropanol toe om het RNA bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten te precipiteren.
    Pauzepunt: RNA kan voor onbepaalde tijd bij -20 ° C in isopropanol worden opgeslagen. In deze stap kan een dot blot worden uitgevoerd om te controleren of biotinylated psoralen succesvol in de cellen heeft binnengebracht en in vivo verknochte RNA's heeft ( Figuur 2 ).
  6. Centrifugeer het neergeslagen RNA bij 20.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C om het RNA te herstellen. Verwijder de supernatant en voeg 1 ml 70% koude ethanol toe aan de RNA-pellet om het RNA te wassen.
  7. Centrifugeer de monsters bij 20.000 xg gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en laat de pellet gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur drogen.
  8. Voeg nucleasevrij water toe aan de RNA-pellet en kwantificeer de concentratie van RNA met behulp van UV-spectrometer.
    Pauzepunt: RNA kan bij -80 ° C worden opgeslagen na fWimpervries in vloeibare stikstof.

2. RNA-fragmentering

  1. Voorverhit 15 μL 2x RNA fragmentatiebuffer en 10 μl van het RNA monster (1 μg / μl) individueel in 0,2 ml PCR buizen, bij 95 ° C gedurende 1 min. Meng 10 μL van de verwarmde 2x RNA fragmentatiebuffer met 10 μl RNA monster door pipetteren omhoog en omlaag. Incubeer het monster gedurende 5 minuten bij 95 ° C. Stop de reactie door snap afkoelen van de reactie op ijs.
  2. Overdracht en pool de 2 fragmentatie reacties op een 1,5 ml microfuge buis. Voeg 40 μL nucleasevrij water toe aan de reactie, 10 μl 3 M natriumacetaat, 1 μL glycogeen en 300 μl 100% ethanol aan de fragmenteringsreactie. Incubeer het RNA gedurende ten minste 1 uur bij -20 ° C om het RNA te precipiteren.
  3. Centrifugeer het neergeslagen RNA bij 20.000 xg gedurende 30 minuten, verwijder het supernatant en was het RNA met gebruik van 1 ml 70% ethanol.
  4. Centrifugeer het RNA bij 20.000 xg gedurende 15 minuten, remOve het supernatant en ontbind het RNA in 20 μl nuclease vrij water.

3. Selectie van RNA-grootte en elutie

  1. Voeg 20 μL RNA laadkleuring toe aan het herstelde RNA in de microfuge buis. Verhit het RNA met de RNA laadverf bij 95 ° C gedurende 3 minuten en plaats het op 2 minuten voor ijs.
  2. Voeg 3 μL RNA laadkleefstof toe aan 0,25 μL 10 nt DNA ladder in een microfuge buis. Verhit de ladder bij 95 ° C gedurende 3 minuten en leg het op 2 minuten op ijs.
  3. Laad de gedenatureerde ladder en monsters op een 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE urea gel en grootte fractioneer door elektroforese gedurende 40 minuten bij 180 V. Verhit de gel in 10 ml TBE buffer met 1: 10.000 nucleïnezuur gel vlek voor 5 Min in het donker.
  4. Steek een schone 0,6 ml microfuge buis onderaan met een 24 G-naald en plaats deze in een 2 ml microfuge buis.
  5. Visualiseer de banden op de post-stained gel met behulp van een transilluminator en snijd een gel plakje die overeenkomt met 90-110 nt. Breng de gelskijf over in de gebroken 0,6 ml microfuge buis in de 2 ml microfuge buis. Deze grootteselectie wordt uitgevoerd om de chimere fragmenten mogelijk te maken om een ​​minimale lengte te hebben om naar de transcriptoom te plassen en om te onderscheiden tussen proximity-ligated products versus unligated products in downstream size selectie stappen.
  6. Centrifugeer de gel plakjes bij 12.000 xg bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten om de gelskijf te versnipperen en te verzamelen in de 2 mL microfuge buis. Gooi de lege 0,6 ml microfuge buis weg. Voeg 700 μL elutiebuffer toe aan de gesnipperde gelschijf in de 2 ml microfuge buis en incubeer gedurende een nacht met constante rotatie gedurende 4 ° C om diffusie van de monsters in de buffer toe te laten.
  7. Breng de gelschijfjes en de elueringsbuffer over op een centrifugebuisfilter en centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 2 minuten. De gel plakjes worden vastgelegd in het bovenste compartiment van het filter. Gooi de gel plakjes en het bovenste compartiment weg.
  8. Voeg 1 μl glycogeen en 7 toe00 μl 100% isopropanol aan het filtraat in de microfuge buis en precipiteer het RNA gedurende ten minste 1 uur of gedurende de nacht bij -20 ° C.
    Pauzepunt: RNA kan voor onbepaalde tijd bij -20 ° C in isopropanol worden neergeslagen.
  9. Centrifugeer het neergeslagen RNA bij 20.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C om het RNA te herstellen. Verwijder de supernatant en voeg 1 ml 70% koude ethanol toe om de RNA-pellet te wassen. Centrifugeer de gewassen pellet bij 20.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
  10. Verwijder de wasbuffer en voeg 20 μL nucleasevrij water toe om het RNA te resuspenderen. Kwantificeer de concentratie van RNA met behulp van een UV-spectrometer.
    Pauzepunt: RNA kan bij -80 ° C worden opgeslagen nadat de flitser in vloeibare stikstof bevriest.

4. Verrijking van RNA-crosslinkende regio's

  1. Vortex streptavidine gecoate magnetische kralen krachtig om de kralen homogeen in de buis te resuspenderen. Breng 100 μl kralen over op een 1,5 ml microfuge buis en plaats deze op een magneetIc staan ​​1 minuut om de kralen aan de magnetische kant van de buis vast te houden. Verwijder de opslagbuffer zorgvuldig uit de kralen en verwijder de buis uit de magneetstandaard.
  2. Voeg 1 ml Lysis Buffer toe aan de kralen in de microfuge buis en pipet omhoog en omlaag. Plaats de microfluor die kralen bevat op de magnetische stand gedurende 1 minuut om de kralen uit de wasbuffer te scheiden. Herhaal dit voor in totaal 3 wasjes.
  3. Verwijder de wasbuffer uit de kralen door de microgolfbevattende kralen op de magnetische stand gedurende 1 minuut te plaatsen. Voeg RNase-remmer (1: 200) toe aan de lysisbuffer en voeg 100 μl lysisbuffer toe aan de gewassen kralen in de microfuge buis.
  4. Voeg 2 ml vers bereide Hybridization Buffer, 1 ml aangevulde lysisbuffer, 1,5 μg groot gefractioneerde RNA en 100 μl geresuspendeerde kralen toe aan een 15 ml conische centrifugebuis. Vortex de buis voorzichtig.
  5. Incubeer de 15 ml conische centrifugebuis bij 37 ° C gedurende 30 min met rotatie van het einde tot het einde.Verwarm de wasbuffer bij 37 ° C.
  6. Plaats de 15 ml conische centrifugebuizen op een magnetische stand voor 15 ml buizen gedurende 2 minuten om de kralen uit de buffer te scheiden. Pipet de buffer zorgvuldig uit de buis en gooi het weg.
  7. Voeg 1 ml voorverwarmde wasbuffer toe aan de kralen, pipette omhoog en omlaag en de kralen over te brengen naar een 1,5 ml microfuge buis. Incubeer bij de kralen bij 37 ° C gedurende 5 minuten, met eindrotatie.
  8. Centrifugeer kortom de inhoud van de microfuge buis. Plaats de 1,5 ml gewassen kralen in microgolfbuizen op een magnetische stand voor 2 ml buizen gedurende 1 min, om de kralen uit de wasbuffer te scheiden. Verwijder de buffer uit de kralen door de buffer uit de microfuge buis voorzichtig te pipetteren.
  9. Voeg 1 ml voorverwarmde wasbuffer toe aan de kralen en pipet omhoog en omlaag om de was te herhalen. Voer in totaal 5 wasjes uit. Verwijder de wasbuffer aan het einde van de 5e was door de microbolletjes die op de magneet staan ​​te plaatsen1 minuut.

5. Proximity Ligation

  1. Voeg 1 ml koude T4 polynucleotide kinase (PNK) buffer aan de gewassen kralen toe en incubeer de kralen gedurende 5 min bij 4 ° C, met rotatie van eind tot einde. Plaats de microfuge buis die de kralen op de magnetische strip bevat gedurende 1 minuut en verwijder de T4 PNK buffer voorzichtig. Herhaal deze stap voor in totaal 2 wasjes en verwijder de T4 PNK buffer na de laatste was.
  2. Voeg buffers toe aan de kralen, volgens tabel 1 . Om de 3'-uiteinden van het RNA-fragment in staat te stellen geligeerd te worden aan 3'-adapters hieronder, incubeer de kralen in de buffer bij 37 ° C gedurende 4 uur met constante roering om de 3'-cyclische fosfaatgroep aan het einde van het RNA om te zetten naar 3 'OH.
  3. Voeg buffers toe aan de vorige reactie, volgens tabel 2 . Om het 5'-uiteinde van de RNA-fragmenten mogelijk te maken om bevochtiging te hebben, incubeer de reactie gedurende 1 uur bij 37 ° C met constante roering in aanwezigheid van ATP, Om 5 'OH op het RNA om te zetten in 5' fosfaat.
  4. Voeg buffer toe aan de vorige reactie om nabijheidsligatie uit te voeren, volgens tabel 3 . Incubeer de reactie bij 16 ° C gedurende 16 uur, met constante roering,
  5. Plaats de microfuge die het geligeerde RNA bevat op een magneetstand gedurende 1 minuut. Verwijder het supernatant zorgvuldig en voeg 1 ml kamertemperatuurwasbuffer toe aan de kralen. Resuspendeer door pipettering omhoog en omlaag.
  6. Plaats de microfuge buis op de magneetstand gedurende 1 minuut en verwijder de wasbuffer zorgvuldig. Voer in totaal 2 wasjes uit, en verwijder de wasbuffer van de kralen aan het einde van de tweede was.
  7. Voeg 100 μL RNA PK Buffer toe aan de kralen en resuspendeer door pipettering omhoog en omlaag. Verhit de monsters bij 95 ° C gedurende 10 minuten op een hitteblok.
  8. Chill het monster gedurende 1 minuut op ijs en voeg 500 μL guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform toe aan het monster. Meng door vortexing krachtig gedurende 10 s. Incubeer de mengselsHoud bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    Pauzepunt: RNA kan gedurende enkele maanden in guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform bij -80 ° C worden opgeslagen.
  9. Voeg 100 μl chloroform toe aan de geëxtraheerde monsters guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform. Vortex krachtig gedurende 10 s. Centrifugeer de monsters bij 20.000 xg gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
  10. Breng 400 μl van de waterlaag naar een nieuwe 1,5 ml microfuge buis. Voeg 800 μL (2 volumes) 100% ethanol toe en meng door pipettering omhoog en omlaag.
  11. Breng de RNA-oplossing over naar RNA-opruimingskolommen en herstel de RNA volgens de instructies van de fabrikant, zodat zelfs kleine RNA's worden behouden. Verwijder het RNA in 100 μl nuclease-vrij water.
    Pauzepunt: RNA kan bij -80 ° C worden opgeslagen nadat de flitser in vloeibare stikstof bevriest.

6. Reverse crosslinking van biotinylated psoralen

  1. Breng de 100 μl van de geëlueerde monsters over in een put van een 24 putjesplaten. Verwijder het deksel en bestral het monster onder UV 254 nm, gedurende 5 minuten op ijs.
  2. Breng het omgekeerde verknoopt monster over op een schone microfuge buis. Voeg 10 μl natriumacetaat, 1 μL glycogeen en 300 μl 100% ethanol toe en precipiteer het RNA gedurende ten minste 1 uur of gedurende de nacht bij -20 ° C.
    Pauzepunt: RNA kan voor onbepaalde tijd bij -20 ° C neerslaan.
  3. Centrifugeer het neergeslagen RNA bij 20.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C om het RNA te herstellen. Verwijder de supernatant en voeg 1 ml 70% koude ethanol toe om de RNA-pellet te wassen.
  4. Centrifugeer de gewassen pellet bij 20.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder de wasbuffer en voeg 4,25 μL nucleasevrij water toe om het RNA te resuspenderen. Breng het RNA over naar een 0,2 ml PCR buis.
    Pauzepunt: RNA kan bij -80 ° C worden opgeslagen nadat de flitser in vloeibare stikstof bevriest.

7. Reverse transcriptie en cDNA circularisatie

  1. Voeg 0,75 μL toeVan RNA linker (0,5 μg / μl) aan het geresuspendeerde monster in PCR buis en verwarmt bij 90 ° C bij 80 ° C. Plaats het monster gedurende 2 minuten op ijs.
  2. Voeg de buffers toe aan het gedenatureerde monster voor 3 'adapterligatie, volgens tabel 4 . Incubeer de reactie bij 25 ° C gedurende 2,5 uur.
  3. Breng de reactie over op een 1,5 ml microfuge buis. Voeg 90 μl nucleasevrij water toe aan de reactie, gevolgd door 10 μl natriumacetaat, 1 μl glycogeen en 300 μl 100% ethanol. Neerslaan het RNA gedurende ten minste 1 uur of gedurende de nacht bij -20 ° C.
    Pauzepunt: RNA kan voor onbepaalde tijd bij -20 ° C neerslaan.
  4. Centrifugeer het neergeslagen RNA bij 20.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C om het RNA te herstellen. Verwijder de supernatant en voeg 1 ml 70% koude ethanol toe om de RNA-pellet te wassen.
  5. Centrifugeer de gewassen pellet bij 20.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder de wasbuffer resuspendeer de pellet in 5 μL nuclease free water.
  6. Voeg 5 μL RNA laadkleursel toe aan het herstelde RNA in de microfuge buis. Verhit het RNA met de RNA laadverf bij 95 ° C gedurende 3 minuten en plaats het op 2 minuten voor ijs.
  7. Voeg 3 μL RNA laadkleefstof toe aan 0,25 μL 10 nt DNA ladder in een microfuge buis. Verhit de ladder bij 95 ° C gedurende 3 minuten en leg het op 2 minuten op ijs.
  8. Doe de grootte fractionering met behulp van 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE urea gel zoals in stappen 3.3 en 3.4.
  9. Visualiseer de gel gekleurd met nucleïnezuur vlek met behulp van de transilluminator en snijd een gel plakje die overeenkomt met 110-140 nt op de ladder. Breng de gelschijf in de gebroken 0,6 ml microfuge buis in de 2 mL microfuge buis en volg het protocol uit stappen 3.6 - 3.9.
  10. Voeg 5 μL nucleasevrij water toe om de RNA-pellet te resuspenderen. Breng het RNA over naar een 0,2 ml PCR buis.
    Pauzepunt: RNA kan bij -80 ° C worden opgeslagen nadat de flitser in vloeibare stikstof bevriest.
  11. Voeg 1 μL RT primer bij 1,25 toe81; M naar het RNA in PCR-buis en verwarmt bij 80 ° C gedurende 2 minuten. Plaats het monster gedurende 2 minuten op ijs.
  12. Voeg de buffers voor reverse transcriptie toe volgens tabel 5 . Incubeer de reactie gedurende 30 minuten bij 50 ° C.
  13. Voeg 1,1 μl 1 N NaOH toe aan de reactie en verhit bij 98 ° C gedurende 20 minuten. Plaats de reactie op ijs.
  14. Breng de reactie over op een 1,5 ml microfuge buis. Voeg 90 μl nucleasevrij water toe aan de reactie, gevolgd door 10 μl natriumacetaat, 1 μl glycogeen en 300 μl 100% ethanol. Precipitereer het DNA bij -20 ° C gedurende ten minste 1 uur of 's nachts.
    Pauzepunt: DNA kan onbepaald bij -20 ° C in ethanol worden neergeslagen.
  15. Centrifugeer het neergeslagen DNA bij 20.000 g gedurende 30 min bij 4 ° C om het DNA te herstellen. Verwijder de supernatant en voeg 1 ml 70% koude ethanol toe om de DNA-pellet te wassen. Centrifugeer de gewassen pellet bij 20.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder de wasbuffer om de pel te resuspenderenLaat 5 μL nucleasevrij water in.
  16. Doe de grootte fractionering met behulp van 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE urea gel zoals in stappen 3.3 en 3.4.
  17. Visualiseer de post-stained gel met behulp van de transilluminator en snijd een gel plakje die overeenkomt met 200-240 nt op de ladder. Het omgekeerde getranscribeerde cDNA is nu 96 basen langer dan het RNA fragment door de toevoeging van de 96 basis RT primer. Breng de gelskijf over in de gebroken 0,6 ml microfuge buis in de 2 ml microfuge buis.
  18. Centrifugeer de gel plakjes bij 12.000 xg bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten om de gelskijf te versnipperen en te verzamelen in de 2 mL microfuge buis. Gooi de lege 0,6 ml microfuge buis weg.
  19. Voeg 700 μL elutiebuffer toe aan de gesnipperde gelskijf in de 2 ml microfuge buis en incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur met constante rotatie. Volg het protocol zoals beschreven in stappen 3.7- 3.8.
  20. Voeg 6 μL nucleasevrij water toe om de DNA-pellet te resuspenderen. Breng het DNA over naar een 0,2 ml PCR buis.
    Pauzepunt: DNA kan opgeslagen worden bij -80 ° C nadat de flitser in vloeibare stikstof bevriest.
  21. Voeg de buffers toe aan de reactie voor cDNA circularisatie, volgens tabel 6 . Incubeer de reactie bij 60 ° C gedurende 1 uur en verhit bij 10 ° C bij 80 ° C om de reactie te inactiveren.
  22. Breng de reactie over op een 1,5 ml microfuge buis. Zuiver het circularized cDNA met behulp van een DNA opruimkolom volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 20 μL nucleasevrij water toe aan de kolom om het gezuiverde cDNA te elueren.
    Pauzepunt: DNA kan gedurende een paar maanden bij -20 ° C worden opgeslagen.

8. PCR Amplification (Small Scale PCR)

  1. Voeg de buffers toe aan de reactie volgens Tabel 7 voor PCR amplificatie om het minimale aantal cycli te testen voor bibliotheek amplificatie.
  2. Stel de PCR cyclische condities op volgens tabel 8 . Pauze de reactie en overdracht 5 μL vanDe PCR-reactie bij 10, 15 en 20 cycli, in afzonderlijke 1,5 ml microfuge buizen.
  3. Voeg 1 μl 6x DNA gel-laadverfstof toe aan elk van de 5 μl PCR-reactie bij de verschillende cycli. Voer gelelektroforese op een 3% agarosegel, bij 120 V, gedurende 1 uur om de PCR-producten te visualiseren.
    1. Gebruik het laagste aantal PCR cycli (Y) dat amplificatie toont op ongeveer 250 basen (In Figuur 3 is er een sterke band bij 15 cycli van amplificatie en een zwakke band bij 10 cycli. 12 cycli van grootschalige PCR amplificatie is waarschijnlijk Genoeg materiaal genereren voor diepe sequencing, aangezien de hoeveelheid cDNA die 10 keer gebruikt is van PCR-amplificatie op kleine schaal).

9. PCR amplificatie (Large Scale PCR) en zuivering

  1. Voeg de buffers toe aan de reactie volgens tabel 9 voor PCR amplificatie voor grootschalige PCR.
  2. Stel de PCR cyclische condities op volgensTabel 10 .
  3. Voeg 5 μL 6x DNA gel-laadverfstof toe aan de 25 μl PCR-reactie en laad in een putje van een 3% agarosegel. Laad 1 kb plus DNA ladder in een aparte put. Voer gelelektroforese bij 100 V, gedurende 1,5 uur.
  4. Visualiseer de voltooide gel met behulp van een UV Transilluminator.
  5. Grootte uittrekken een gelskijf die PCR-producten bevat van 200 tot 300 basen en de gel overbrengen naar een schone 2 ml microfuge buis.
  6. Voeg 1 ml geloplosbaarheidsbuffer, uit een DNA-gel-extractie kit, aan de gelskijf toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, of tot de gel oplost, met constante roering.
  7. Voeg 200 μl isopropanol toe aan de opgeloste gel en meng goed door pipettering. Breng 700 μl van het monster naar een DNA-extractie opruimingskolom en centrifuge bij 13.000 xg gedurende 30 s. Blijf het opgeloste monster overbrengen naar de kolom totdat het monster op de kolom geladen is.
  8. Voeg 500 μL gel oplosbaarheid buffer,Gevolgd door 700 μl kolomwasbuffer, naar de kolom, volgens het protocol van de fabrikant. Voeg 12 μL nuclease-vrij water in het midden van de kolom om het DNA te ontlopen. Pauzepunt: DNA kan opgeslagen worden bij -20 ° C.
  9. Kwantificeer de concentratie van het DNA met behulp van fluorometrische kwantificering. Als meerdere bibliotheken worden geconstrueerd en samengevoegd voor sequentiebepaling, voeg dezelfde hoeveelheid van elk monster toe aan het zwembad, voor high-throughput sequencing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 geeft de schematische weergave van de SPLASH workflow weer. Bij de toevoeging van biotinyleerde psoralen in aanwezigheid van 0,01% digitonine en UV-verknoping wordt het totale RNA uit de cellen geëxtraheerd en wordt een dot blot uitgevoerd om ervoor te zorgen dat verknoping van biotinyleerd aan het RNA efficiënt is gebeurd ( Figuur 2 ). We gebruiken biotinyleerde 20 base oligo's als positieve controles om de hoeveel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we in detail de experimentele en computational workflow voor SPLASH, een methode die ons toelaat om paar-achtige RNA-interacties op een genoombreedte te identificeren. We hebben succesvol gebruik gemaakt van SPLASH in bacteriële, gist en menselijke culturen en anticiperen dat de strategie op grote schaal toegepast kan worden op diverse organismen onder verschillende cellulaire staten. Een van de kritieke stappen in het protocol is om te beginnen met tenminste 20 μg verknoopt RNA om voldoende materiaal t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken leden van het Wan lab en het Nagarajan lab voor informatieve discussies. N.Nagarajan wordt ondersteund door financiering van A * STAR. Y.Wan wordt ondersteund door financiering van A * STAR en Society in Science-Branco Weiss Fellowship.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 kb Plus DNA LadderLife Technologies Holdings Pte Ltd10787026DNA ladder
10 bp DNA ladderLife Technologies Holdings Pte Ltd10821-015DNA ladder
20% SDS solutionFirst BASEBUF-2052-1L  
20x SSCFirst BASEBUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate SolutionFirst BASEBUF-1151-1L-pH5.2  Vereist voor nucleïnezuurprecipitatie
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1Bio-Rad1610145TBE Urea gel component
Ambion Buffer KitLife Technologies Holdings Pte LtdAM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade  PromegaV3131 TBE Urea gel component
BromofenolblauwSigma-AldrichB0126-25G
ChloorformMerck1.02445.1000RNA extractie
Single strand DNA ligaseEpicentreCL9025KCircLigase II ssDNA Ligase
CentrifugebuisfiltersSigma-AldrichCLS8160-96EACostar Spin-X centrifugebuisfilters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINESigma-AldrichD5628-1GVoor celbehandeling
Dark Reader Transilluminator Clare Chemical ResearchDark Reader DR89X TransilluminatorBlauwe lichttransilluminator
DNA Gel Loading Dye (6x)Life Technologies Holdings Pte LtdR0611Vereist voor agarose gel elektroporatie
Dulbecco's Gemodificeerd Arends MediumPan BioTechP04-03500Voor Hela celcultuur
Streptavidine magnetische kralenLife Technologies Holdings Pte Ltd65002Dynabeads MyOne Streptavidin C1 
Magnetische standaard voor 15 mL buizenLife Technologies Holdings Pte Ltd12301DDynaMag-15
Magnetische standaard voor 15 mL buizenLife Technologies Holdings Pte Ltd12321DDynaMag-2
ThermoMixerEppendorf5382 000.015Eppendorf ThermoMixer C
Biotinyleren psoraleenLife Technologies Holdings Pte Ltd29986EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL HitachiF8T5/BL 365 nm UV lamp
Fetaal RundserumLife Technologies Holdings Pte Ltd10270106  Componenten van Hela medium
FormamidePromegaH5052  Component in hybridisatiebuffer
G8T5Sankyo-DenkiG8T5254 nm UV lamp
GlycogenLife Technologies Holdings Pte Ltd10814010Vereist voor nucleïnezuur precipitatie
NanodropLife Technologies Holdings Pte LtdNanodrop 2000Spectrofotometer voor nucleïnezuur kwantificering
Nuclease vrij water First BASEBUF-1180-500ml  
Penicilline Streptomycine  Life Technologies Holdings Pte Ltd15140122  Componenten van Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x)Life Technologies Holdings Pte LtdF531L Phusion High-Fidelity PCR Master Mix met HF Buffer (2x)
Primer Set 1New England BiolabsE7335L PCR primers
DNA Gel Extractie KitQIAgen28106QIAquick Gel Extractie Kit
Fluorometrische Kwantificering kitLife Technologies Holdings Pte LtdQ32854Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA opruimsetQiagen74106RNeasy Mini Kit Silica-membraankolom
Rnase InhibitorLife Technologies Holdings Pte LtdAM2696SUPERase In
Reverse transcriptaseLife Technologies Holdings Pte Ltd18080400SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel StainLife Technologies Holdings Pte LtdS11494SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide KinaseNew England BiolabsM0201LEnd reparatie enzym
T4 RNA Ligase 1New England BiolabsM0204LEnzym voor proximale ligatie
T4 RNA Ligase 2, afgeknotte KQNew England BiolabsM0373LEnzym voor adapterligatie
TemedBio-Rad1610801TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroformLife Technologies Holdings Pte Ltd15596018TRIzol® Reagent voor RNA extractie
UreaFirst BASEBIO-2070-5kg  
UV crosslinkerStratagene400072UV Stratalinker 1800
UV TransilluminatorUVP95-0417-01Voor het visualiseren van bands
Xyleen Cyanool FFSigma-AldrichX4126-10G
DNA cleanup itZymo Research D4004Zymo DNA concentrator-5 
Lijst van vereiste software
FastQC software0.11.4http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software1.0.7https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software0.7.12http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software1.2.1http://www.htslib.org/
PULLSEQ software1.0.2https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software2.5.0chttps://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON scriptPYTHON 2.7.11https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON scriptPYTHON 2.7.11https://github.com/CSB5

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
  2. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
  3. Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
  4. Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
  5. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
  6. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
  7. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
  8. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  9. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  10. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  11. Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
  12. Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
  13. Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
  14. Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
  15. Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

SPLASH methodeUV crosslinkingproximiteitsligatiehigh throughput sequencingRNA extractiegelelektroforesemagnetische beadscomputationele pipeline

Gerelateerde artikelen