Een Aanpasbare Kamer voor het meten van de Cel Migratie

Summary

Dit protocol Gegevens een aanpasbare werkwijze celmigratie als reactie op chemoattractanten die ook kunnen worden gebruikt om de diffusiesnelheid van een geneesmiddel te bepalen uit een polymeermatrix meten.

Abstract

Cel migratie is een essentieel onderdeel van het immuunsysteem, groei en wondgenezing. Celmigratie is een complex proces dat interacties tussen cellen, de extracellulaire matrix en oplosbare en niet oplosbare chemische factoren (bv chemoattractanten) omvat. Standaardwerkwijzen voor het meten van de migratie van cellen, zoals de Boyden kamer assay, werken door het tellen van cellen aan weerszijden van een scheidingswand. Deze technieken zijn gemakkelijk te gebruiken; echter, bieden ze weinig geometrische aanpassing voor verschillende toepassingen. Daarentegen kan microfluïdische inrichtingen worden gebruikt om celmigratie met aanpasbare concentratiegradiënten van oplosbare factoren ^{1, 2} nemen. Echter, methoden voor het maken van microfluidics gebaseerde testen moeilijk om te leren.

We beschrijven hier een eenvoudige methode om celkweek kamers om celmigratie te meten in respons op chemische concentratiegradiënten. Onze cel migratie kamermethode kunnen verschillende lineaire concentratiegradiënt te creëren om celmigratie te bestuderen voor verschillende toepassingen. Deze methode is relatief eenvoudig te gebruiken en wordt typisch uitgevoerd door studenten.

Het microkanaal kamer werd gecreëerd door het plaatsen van een acryl inzetstuk in de vorm van de uiteindelijke microkanaal kamer tot in een petrischaal. Hierna werd poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) bovenop het inzetstuk gegoten. De PDMS werd uitharden en vervolgens werd het inzetstuk verwijderd. Dit liet de creatie van putjes in elke gewenste vorm of grootte. De cellen kunnen vervolgens worden toegevoegd aan de microkanaal kamer en oplosbare middelen kan op een van de putjes toegevoegd door weken een agarose blok in de gewenste stof. De agarose blok wordt toegevoegd aan één van de putjes, en time-lapse beelden kunnen houden met het microkanaal kamer om celmigratie te kwantificeren. Variaties van deze methode kan worden gemaakt voor een bepaalde toepassing, waardoor deze methode higHLY aanpasbaar.

Introduction

Om essentiële processen zoals wondgenezing, immuunreacties en embryonale ontwikkeling te laten plaatsvinden, moet celmigratie plaatsvinden. Celmigratie omvat de interactie tussen cellen en aangrenzende cellen, de extracellulaire matrix en oplosbare chemische signalen (aantrekkingskracht of afstoting). Als voorbeeld spelen fibroblasten bij het genezingsproces van wonden een integrale rol in fibrogenese en wondcontractie, waarbij de cellen worden aangetrokken naar de plaats van verwonding om collageen te synthetiseren om de extracellulaire matrix te vormen³. Er zijn talrijke mechanismen bestudeerd die ten grondslag liggen aan de migratie van fibroblasten naar een wondplaats, en ze omvatten verschillende mechanische, fysische, elektrische en chemotactische factoren⁴. Fibroblasten reageren vooral goed op verschillende concentratiegradiënten van groeifactoren. Deze verschillende groeifactoren werken samen om weefselregeneratie te optimaliseren⁵. Door de chemotactische reactie van fibroblasten op groeifactorconcentraties te observeren, kan men het patroon van directionele migratie van fibroblasten bestuderen en hoe ze zich oriënteren rond fysieke obstakels om hun bestemming te bereiken. Daarom waren de doelen van dit onderzoek om eerst een systeem te ontwikkelen waarin fibroblastengroei onder leiding van fysieke barrières kon worden bijgehouden en ten tweede om de groei van fibroblasten te modelleren terwijl ze door het systeem navigeren.

Momenteel is de Boyden-kamermethode het meest gebruikte systeem om de migratie van cellen te meten⁶. De Boyden-kamer bestaat uit een meervoudige plaat met twee kamers waarbij elke put medium met of zonder chemo-attractanten kan bevatten⁷. Een filtermembraan biedt een poreuze interface tussen de twee kamers in elke put; dit creëert een barrière zodat cellen niet kunnen passeren, tenzij het door actieve migratie is. Typisch wordt voor de Boyden-kamer een chemo-attractant toegevoegd aan de onderste kamer, en het systeem wordt toegestaan om in evenwicht te komen om een gradiënt tussen de bovenste en onderste putten te vormen⁴. Een probleem met de Boyden-kamermethode is dat steile gradiënten langs een enkele as loodrecht op het oppervlak van het membraan worden gevormd. Dit zorgt ervoor dat het verschil in chemo-attractantconcentratie tussen de bovenste en onderste putten lager is dan oorspronkelijk werd verwacht. Vanwege deze beperking maakt de Boyden-kamermethode het moeilijk om specifieke celreacties te correleren met specifieke gradiëntkenmerken, zoals de helling en het concentratieverschil. Zonder deze metingen is het moeilijk om multi-gradiënt signaalintegratie te bestuderen.

Om enkele van de beperkingen van de traditionele Boyden-kamermethode aan te pakken, zijn microfluïdische methoden ontwikkeld om aanpasbare concentratiegradiënten te vormen¹. Standaardmethoden voor het creëren van microfluïdische systemen vereisen schone ruimtes voor lithographische technieken. Deze technieken kunnen moeilijk te leren zijn, vooral in een standaard klasomgeving. Daarom hebben we een kamersysteem ontworpen voor het meten van celmigratie dat kan worden gemaakt zonder gebruik te maken van een schone ruimte. Met ons systeem kunnen de putten van de assay worden aangepast aan een gewenste grootte, en een lineair concentratiegradiënt van aangepaste helling kan worden geproduceerd. Dit maakt nauwkeurige meting van chemotaxis mogelijk van willekeurige beweging. Het ontwerp is een goedkoop en eenvoudig te gebruiken systeem om celgroei te modelleren als reactie op verschillende chemische stimuli.

Protocol

1. Het produceren van een Microchannel Kamer tot een concentratie Gradient Maak

1. Cutting een acryl mal stuk
   1. Zorg voor een stukje van acryl van de gewenste breedte. Typisch gebruiken 16/01-inch dikke acrylplaten. Dikkere platen zijn moeilijk goed en zeer dunne platen gesneden niet de vereiste mechanische sterkte, waardoor ze kunnen barsten of kromtrekken tijdens het proces.
   2. Maak een CAD-bestand met de gewenste vorm van de acrylstuk om een ​​holte in het polydimethylsiloxaan (PDMS) te produceren. Pas de breedte en lengte kanaal naar de gewenste gradiënt afzonderlijke experimentele protocollen relevant bereiken.
      1. Hier, gebruik een acrylstuk van de volgende afmetingen: twee velden (0,254 cm x 0,254 cm) die door een 0,127 cm breed kanaal (0,254 cm) (figuur 1).
   3. Importeer het CAD-bestand in het lasersnijden apparatuur en plaats de acryl stuk in een laser cutter volgens de manubrikant's protocol.
      OPMERKING: U 3D-print het stuk uit de CAD-ontwerp. Het voordeel van deze methode is dat alternatieve materialen kunnen worden gebruikt voor de matrijs; echter, kan de resolutie en reproduceerbaarheid worden verminderd met 3D-printen in vergelijking met lasersnijden.

Figuur 1: Computer-Aided Design (CAD) Vertegenwoordiging van Microchannel Kamer. Dit beeld schildert de CAD-tekening van de acryl liner nodig is om de microkanaal kamer te creëren. 1 A) Bovenaanzicht van CAD-tekening, 1B) Zijaanzicht van de CAD-tekening met afmetingen in inches, 1C) Bovenaanzicht van CAD-tekening met afmetingen in inches Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Het gieten van de polydimethylsiloxaan (PDMS)
   1. In een gewichtboot, meng 10 gewichtsdelen commercieel Elastomer Base (bv Sylgard 184) met 1 gewichtsdeel commercieel elastomeer verharder (bijvoorbeeld Sylgard 194). Kenmerkend Meng 10 g elastomeer Base 1 g elastomeer verharder.
   2. Roer de basis en verharder combineren met een micropipet voor 5 min.
   3. Het opzetten van een vacuüm bel en leg de wegen boot met PDMS in het vacuüm gedurende 30 minuten om ingesloten luchtbellen te verwijderen.
   4. Schakel het vacuüm en verwijder de wegen boot. Giet de PDMS op de top van de acryl cut-out in een kleine petrischaal. Zorg ervoor dat het PDMS volledig bedekt de insert.
   5. Laat de PDMS een nacht uitharden (minimaal 18 uur) bij kamertemperatuur.
3. Het verwijderen van het inzetstuk van PDMS
   1. Na het uitharden van de PDMS, verwijder het inzetstuk door het zorgvuldig snijden van de PDMS rond de acrylstuk met een scalpel.

2. Plating de cellen in een Microchannel Kamer

1. Steriliseren van de kamer voor plating cellen.
   OPMERKING: Terwijl PDMS kunnen worden gesteriliseerd met ethyleenoxide of andere technieken, een snelle UV-behandeling is snel, goedkoop en voldoende celcultuuronderzoeken. De duur korte UV-behandeling geen afbreuk doen aan de structuur of de mechanische integriteit van het PDMS stuk.
   1. In een standaard celkweek kast, volledig bedekken de kamer met 70% ethanol.
   2. Zet de petrischaal in laminaire stroming kap met de deksels af.
   3. Sluit de kap en zet de UV-licht. Blootstellen aan UV-licht voor 1-2 uur.
   4. Open de laminaire stroming kap en wacht 15 minuten om de stroom te herstellen.
   5. Verwijder de 70% ethanol.
   6. Was de kamers tweemaal met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Gebruik 1 ml PBS voor elke wasbeurt. Verwijder PBS en laat de kamers een nacht drogen met de deksels af.
      NB: In plaatsvan het gebruik van een laminaire stroming kap, gebruik maken van een UV-kamer box voor sterilisatie als die beschikbaar is. Wordt UV box door een UV-lichtbron in de rug van een kartonnen doos bekleed met aluminiumfolie. De aluminiumfolie reflecteert het licht zodat zelfs verlichting van het monster.
2. Plating Cellen in Kamer
   1. Tellen cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer.
      1. Voeg 100 ul van de celsuspensie 400 pi van 0,4% trypan blauw en meng voorzichtig. Breng 100 pi van deze oplossing aan de hemocytometer door beide kamers voorzichtig vullen onder het dekglaasje.
      2. Gebruik een microscoop met een 10X objectief te richten op het raster op de hemocytometer. Gebruik een hand telapparaat om de live ongekleurde cellen te tellen binnen een set van 16 vierkantjes op de hemocytometer.
      3. Aantal cellen in alle 4 sets van 16 vakjes. Neem het gemiddelde celgetal van de 4 sets van 16 pleinen en vermenigvuldig dat met 5x10 ^4. Dit laatste nummer is de numbeR cellen / ml in de celsuspensie.
   2. Voeg 2500 cellen aan één putje in elke kamer. Dit vertaalt zich naar een bijna-confluente celdichtheid van ~ 30.000 / ^cm2.
   3. Een cel in staat om in de kamer zitten 60 minuten voor het toevoegen van medium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium, 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine).

3. Dextran Soaked Agarose Blocks

1. Het creëren van een agarose blok
   1. Pour 3% agarose bij 3D geprint matrijs (2 mm x 2 mm x 2 mm).
   2. Laat de agarose te stollen in een vacuümkamer gedurende 30 minuten om eventuele luchtbellen te verwijderen.
   3. Verwijder de agarose blok van de mal.
      OPMERKING: U pour 3% agarose in kleine petrischaal bij een dikte van 2 mm. Snijd een 2 mm x 2 mm x 2 mm blok met behulp van een scalpel of een ander snijgereedschap. Dit is niet zo nauwkeurig als de mal systeem, maar het kan een beetje makkelijker om te doen.
2. volledig submerge de agarose blok in een oplossing van de gewenste concentratie van de chemotactische factor. Om het verloop formatie concentratie te beoordelen, spoel de kamer eerst met fluorescerende dextran. De concentratie en het molecuulgewicht dextran moet overeenkomen met die van een oplosbare factor of geneesmiddel plaats.
3. Week de agarose blok 's nachts.

4. Time-lapse van de dextran Diffusion de Oplosbare Factor concentratiegradiënt Assess

1. Plaats de dextran gedrenkt agarose blok in een klein plein putje van de microkanaal kamer.
2. Plaats de microkanaal kamer in een cell imaging-systeem of gebruik een andere fluorescentiemicroscoop met een time-lapse vermogen. Begin de time-lapse volgens de instructies van de fabrikant.
   LET OP: De getoonde resultaten zijn genomen met GFP filter, 50% licht, 4/10 pH en 4X vergroting.

5. Time-lapse van de celgroei

1. Plaat cellen in het microkanaal kamer aan één uiteinde van dekamer. Hier, gebruik 3T3 fibroblasten. Voeg 2500 cellen om een ​​goed in de microkanaal kamer. Aantal cellen zoals beschreven in 2.2.1.
   1. Een cel in staat om in de kamer zitten 60 minuten voor het toevoegen van medium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium, 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine). Houd de microkanaal kamer met geplateerde cellen bij 37 ° C in _5% CO2. Celmigratie door het kanaal kunnen worden bekeken met een microscoop.
   2. Voeg een merker of een microscopische defect in de kamer als een marker om te dienen als een startpunt om de afstand kwantificeren cel voorzijde beweegt.
2. Instelling van een gradiënt door het plaatsen van een agarosegel (8 mm ³ blokken) met de geconcentreerde groeifactor, chemo-attractant, drug of andere factor getest (hier, 40% FBS wordt als voorbeeld) aan één uiteinde van het microkanaal kamer.
3. Neem de time-lapse beelden van de bewegende cel front. Hier, de resultaten tonen beelden van de cel weernt die werden elke 12 h en een beeldvormingssysteem genomen.
4. Gebruik foto's van de cel voor naar cel groei te kwantificeren. Bereken de groei door eerst met behulp van de MATLAB polyfit functie (roipoly) om een ​​veelhoekige masker gedefinieerd door de cel front, het kanaal muren, en de referentie-marker te creëren. De afmetingen van dit masker op de migratie afstand van de voorste waaruit gemiddelde celgrootte voor snelheid wordt berekend. Andere studies hebben een soortgelijke methode ⁸ toegepast.
   Opmerking: Vergelijk de rand van de celgroei front op elk frame om de concentratie van de oplosbare factor op dezelfde afstand. De oplosbare factor concentratiegradiënt wordt berekend aan de hand van een 1D diffusie model benadering.
5. Neem fluorescerende beelden van de cellen met behulp Phalloidin en DAPI kleuring.
   1. Fix cellen vóór kleuring met Phalloidin.
      1. Warm 4% paraformaldehyde bij 37 ° C.
      2. Voeg genoeg 4% paraformaldehyde aan cellen dekken. Houd cellen in deparaformaldehyde gedurende 10 min.
      3. Spoel tweemaal met PBS gedurende 15 minuten elke keer. Gebruik voldoende PBS aan de cellen omvatten.
   2. PBS verwijderen van cellen en voeg genoeg permeabilisatie-oplossing (0,1% Triton X-100 in PBS) aan cellen dekken. Laat gedurende 10 min.
   3. Was tweemaal met PBS gedurende 5 min per keer. Gebruik voldoende PBS aan de cellen omvatten.
   4. PBS verwijderen van cellen en voeg blokkeeroplossing (1% runderserumalbumine in PBS) gedurende 20 min.
   5. Verwijderen blokkerende oplossing en was 2x met PBS gedurende 5 min per keer. Gebruik voldoende PBS aan de cellen omvatten.
   6. Vanaf dit punt, cellen beschermen tegen licht met aluminiumfolie wanneer niet in gebruik. PBS verwijderen van cellen en voeg Phalloidin 488 verdund 1:50 in PBS gedurende 1 uur.
   7. Was 2 keer in PBS gedurende 5 min per wasbeurt. Gebruik voldoende PBS aan de cellen omvatten. Verwijder vervolgens PBS uit cellen.
   8. Voeg DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool) verdund 1: 1000 in PBS cellen gedurende 15 min.
   9. Verwijder DAPI enWas de cellen tweemaal met PBS gedurende 5 min per wasbeurt.
   10. Verwijder laatste wasbeurt en voeg genoeg PBS aan cellen te dekken. Cellen kunnen nu worden afgebeeld met een fluorescentiemicroscoop.

Results

Figuur 2 toont de beweging van de voorste cel over het kanaal in reactie op een gradiënt van foetaal runderserum geplaatst aan het andere uiteinde van het kanaal waar de cellen worden uitgeplaat. De cel voorzijde is getoond bij 48 uur (Figuur 2A), 72 h (figuur 2B), 96 h (figuur 2C) en 120 uur (Figuur 2D) na plating. De beweging van de cel voorzijde werd gevolgd met deze time-lapse beelden, en de migratie...

Discussion

Onze microkanaal kamer kan worden gebruikt voor een veelheid aan toepassingen, inclusief het bepalen van de celmigratie als reactie op groeifactoren en chemoattractanten en het meten van de diffusiesnelheid van een geneesmiddel vanuit een polymere matrix. Het is mogelijk om onze microkanaal kamer gebruiken om cellen groeien en plaats een chemoattractant aan een einde van de kamer. De cellen groeien in respons op de chemoattractant en de celmigratie kan worden gekwantificeerd door middel van time-lapse beelden dat om de ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Sigma-Aldrich	761036	poly(dimethylsiloxane) 2-delig pakket inclusief siliconen elastomeer basis en siliconen elastomeer hardingsmiddel
Acrylic Sheets	US Plastic	44200
Disposable Petri Dishes	Falcon	25373-041
Fluorescein isothiocyanate–dextran	Sigma-Aldrich	FD20s-100MG
Agarose, Type I, Low EEO	Sigma-Aldrich	A6013-100G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Fisher Scientific	11965092	Cel media componenten
Fetal Bovine Serium	Fisher Scientific	16000036	Cel media componenten
Penicillin-streptomycin	Fisher Scientific	15140148	Cel media componenten
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP24384
EVOS XL Cell Imaging System	Thermo Fisher Scientific	AME3300	Instrument gebruikt voor het maken van time-lapse beelden
Versa Laser	Universal Laser Systems, Inc.	Modelnummer VLS2.30	Lasersnijder gebruikt voor het snijden van plastic