Methodenartikel

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

DOI:

10.3791/55268

⸱

16 maart 2017

 , 
1Department of Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om efficiënt humane trofoblastische cellen te genereren uit humane pluripotente stamcellen met behulp van botmorfogenetisch eiwit 4 en remmers van de Activin/Nodal-routes. Deze methode is geschikt voor de efficiënte differentiatie van humane pluripotente stamcellen en kan grote hoeveelheden cellen genereren voor genetische manipulatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De placenta is het eerste orgaan optreden tijdens embryogenese en is nodig voor de overleving van het ontwikkelende embryo. De placenta bestaat uit verschillende trofoblastcellen dat onderscheiden van de extra-embryonale trophectoderm cellen van de inplanting blastocyst. Als zodanig is ons begrip van de vroege differentiatie gebeurtenissen van de menselijke placenta beperkt omwille van ethische en juridische beperkingen op de isolatie en manipulatie van de menselijke embryogenese. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) is een robuust modelsysteem voor het onderzoeken van menselijke ontwikkeling en kan ook in vitro worden gedifferentieerd tot cellen die markers trofoblastische van de trofoblast verschillende celtypen tot expressie. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor differentiatie hPSCs in trofoblastcellen behulp botmorfogeen eiwit 4 en remmers van de activine / Nodal signaalroutes. Dit protocol genereert verschillende trofoblast celtypes die kunnen worden getransfecteerd met siRNAvoor het onderzoeken van het verlies-van-functie fenotypes of kunnen worden besmet met ziektekiemen. Bovendien kan hPSCs genetisch worden gemodificeerd en vervolgens onderverdeeld in trofoblast progenitors voor gain-of-function analyses. Deze in vitro differentiatie werkwijze voor het genereren van menselijke trophoblasts vanaf hPSCs overwint de ethische en wettelijke beperkingen van het werken met vroege menselijke embryo's, en het systeem kan worden gebruikt voor diverse toepassingen, zoals geneesmiddelen en stamcelonderzoek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De placenta is nodig voor de groei en overleving van de foetus tijdens de zwangerschap en vergemakkelijkt de uitwisseling van gassen, voedingsstoffen, afvalstoffen, hormonen en tussen maternale en foetale bloedsomloop. Het eerste orgaan gevormd tijdens embryogenese zoogdieren is de placenta, die begint ontwikkelen 6-7 dagen na de bevruchting bij de mens en bij muizen 3,5-4,5 dagen 1, 2, 3, 4. Trofoblastcellen zijn de belangrijkste cellen van de placenta, en deze cellen vertegenwoordigen één van de eerste lijn differentiatie gebeurtenissen bij zoogdieren embryo. Ze ontstaan ​​uit de buitenste extra-embryonale trophectoderm cellen van de pre-implantatie blastocyst. Onze kennis van de vroege stadia van ontwikkeling van de placenta wordt beperkt door ethische en logistieke beperkingen modelleren vroege menselijke ontwikkeling.

Tijdens de embryonale implantatie, trofoblastenbinnenvallen de moederlijke epitheel en differentiëren in gespecialiseerde stamcellen 5. Cytotrofoblasten (CTBS) worden mononucleaire, ongedifferentieerde voorlopers die fuseren en differentiëren in syncytiotrofoblasten (SYN) en extravilleuze invasieve trofoblasten (EVTS), dat anker de placenta naar de baarmoeder. SYN zijn meerkernige, terminaal gedifferentieerde cellen die hormonen noodzakelijk voor het behoud van de zwangerschap synthetiseren. De vroege differentiatie gebeurtenissen die EVTS en SYN genereren zijn essentieel voor de vorming van de placenta, zoals stoornissen in trophoblastic cellen resulteren in een miskraam, pre-eclampsie, en Dysmaturiteit 1. De typen humane trofoblast cellijnen die zijn ontwikkeld onder onsterfelijk CTBS en choriocarcinomas, die placenta hormonen en weergave invasieve eigenschappen 6 produceren. Primaire trophoblastic cellen van het eerste trimester placenta mens kan worden geïsoleerd, maar de cellen snel differentiate en stoppen prolifererende in vitro. Belangrijk is getransformeerd en primaire cellijnen hebben verschillende genexpressie profielen, wat aangeeft dat tumorigene en onsterfelijk trofoblast cellijnen primaire trophoblasts 7 niet nauwkeurig kan vertegenwoordigen. Bovendien, deze lijnen is het onwaarschijnlijk dat de placenta trofoblast stamcellen voorlopers lijken, omdat ze voor het eerst zijn afgeleid van later stadium via derde trimester.

Er is behoefte aan een krachtige in vitro kweeksysteem van beginnende menselijke trophoblasts om de vroege gebeurtenissen van placenta vorming en functie te bestuderen. Humane embryonale stamcellen (hESCs), welke eigenschappen de binnenste celmassa van pre-implantatie embryo delen worden vaak gebruikt om vroege menselijke Ontwikkelmodel, waaronder de vorming van de vroege placenta. Zowel menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) en hESCs kunnen worden onderscheiden in trophoblasts in vitro met behulp van Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Deze omzetting van pluripotente cellen trofoblastcellen behulp BMP4 specifiek is voor humane cellen en wordt veel gebruikt om de ontwikkeling van de vroege menselijke placenta te bestuderen omdat het geen toegang heeft tot vroege menselijke embryo 9, 16 noodzakelijk. Recent werd ontdekt dat het toevoegen van de remmers A83-01 (A) en PD173074 (P), die de SMAD2 / 3 en MEK1 / 2 signaleringsroutes te blokkeren, verhoogt de efficiëntie van differentiatie in HPSC trophectoderm-achtige stamcellen voornamelijk SYN en EVTS zonder uitgebreide vorming van mesoderm, endoderm of ectoderm cellen 9, 17 . Met deze mediumomstandigheden, hESCs gedifferentieerd gedurende 12 dagen vergelijkbare genexpressie profielen trophectoderm cellen geïsoleerd uit menselijke blastocyst-stadium embryo en scheiden verschillende placenta-specifieke groeihormonen, ondersteunt de validiteit van deze in vitro modelsysteem 9, 11. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de in vitro differentiatie van hPSCs in humane trofoblast voorlopers gebruikt BMP4 / A / P cultuurmedium. Deze omstandigheden produceren overvloedige aantallen cellen voor een groot aantal toepassingen, waaronder RNA sequentie, gendisruptie behulp siRNA, pathogeen infecties en genetische modificatie onder toepassing van lipofectie-gemedieerde transfectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LET OP: Voor de differentiatie van beide hESCs of hiPSCs in trofoblast voorlopers, hPSCs geteeld op muis embryonale fibroblasten (MEF) worden overgebracht naar feeder-vrije omstandigheden gedurende twee passages voor het begin van differentiatie met BMP4 / A / P. Dit proces elimineert de MEF besmetting van gedifferentieerde cellen. Hier presenteren we een protocol voor differentiatie hESC en hetzelfde protocol kan worden toegepast hiPSCs.

1. Cultuur en herstel van hESCs op bestraalde muis embryonale fibroblasten (MEF) (Voorbereidingen)

  1. Gamma-bestraling van MEF
    1. Voeg 500 ml van medium voor het kweken van de MEF: DMEM met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1 x penicilline / streptomycine (Pen / Strep) en 0,1 mM niet- essentiële aminozuren (NEAA).
    2. Dooi een flacon van de primaire MEF en gebruik MEF medium voor het kweken van de cellen. Vouw de primaire MEF tot 30 platen met behulp van MEF kweekmedium.
      OPMERKING: Zuurstofconcentraties niet kritisch voor deze stap, zodathetzij fysiologische (4%) of omgeving (20%) omstandigheden in de incubator kan worden gebruikt.
    3. Oogst de MEF. Gebruik 0,25% trypsine aan de MEF uit de platen en de cellen overbrengen naar een conische buis. Plaats de MEF tot een bestraling instrument en bloot de cellen tot 3.500 grijstinten.
      OPMERKING: De hoeveelheid zal afhangen van de activiteit van de bron in de bestraler apparaat.
    4. Resuspendeer de bestraalde MEF met MEF kweekmedium en tel het aantal cellen met een hemocytometer.
    5. Pellet de MEF met behulp van een centrifuge en voeg 50% MEF kweekmedium en 50% cel bevriezing medium (80% FBS en 20% MEF kweekmedium). Aliquot 1 x 10 6 cellen per flesje.
    6. Plaats de bestraalde MEF flacons in een -80 ° C vriezer gedurende de nacht, en vervolgens overbrengen naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
  2. Ontdooien van bevroren MEF en hESCs voor cultuur
    1. Maak 500 ml van hESC medium: DMEM / F-12 met 20% Serum Replacement, 0,1 mM NEAA, 2 mM L-glutamine, 10 ng / ml bFGF, 0,1 mM ß-mercaptoethanol en 1x Pen / Strep.
    2. Dooi een flacon van MEF één dag voor het ontdooien van de hESCs. Coat een 6-wells plaat met 0,1% gelatine, 1 ml gebruikt voor elke wel. Incubeer gedurende minstens 20 minuten bij kamertemperatuur, en verwijder vervolgens de gelatine.
    3. Verwijder een flacon MEFs van opslag in vloeibare stikstof en dompel de flacon in een 37 ° C waterbad. Kijk naar de flacon met tussenpozen tot slechts kleine ijskristallen blijven. Vlug de inhoud van het flesje over te dragen aan 9 ml MEF medium in een 15 ml conische buis.
    4. Pellet de cellen door centrifugeren bij 200 g gedurende 5 min. Zuig het supernatant en resuspendeer de cel pellet in MEF medium. Aliquot de MEFs gelijkmatig op een 6-wells plaat. Plaats de plaat in een 37 ° C zuurstofarme (4%) incubator nacht.
  3. Routine cultuur van hESC 's op MEF
    1. Verwijder een hESC flesje uit vloeibare stikstof en ontdooien snel het flesje met een 37 ° C waterbad. Voorzichtig pipet de hESCs in een 15 ml conische buis met 9 ml van hESC medium en spin neer op 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het medium en resuspendeer de cellen met 1 ml van hESC medium.
    2. Zuig het MEF medium van de plaat bereid in stap 1.2.4 en voeg 1 ml van hESC medium. Voeg Rock remmer Y-27632 (10 uM) aan de hESC medium. Breng de hESC 's op MEF.
    3. Plaats de cellen in een 37 ° C zuurstofarme (4%) incubator nacht. Vervang de hESC medium dagelijks. Schraap gedifferentieerde cellen met een Pasteur pipet, gevisualiseerd onder een microscoop rechtop op 4X.
    4. Passage de hESCs om de 4-6 dagen, afhankelijk van de cel confluentie en de grootte van de hESC kolonies. Bereid een plaat van MEF de dag voor passage. Wanneer de cellen klaar om doorgang, verwijderen hESC medium en was de put met 1 ml PBS.
    5. Voeg 1 mg / ml collagenase (voorverwarmd tot 37 ° C), incuberen bij 37 ° C gedurende 5 min, en verwijder de collagenase. was van de cellen met PBS, voeg 1 ml van hESC medium per well, en de cellen handmatig schrapen in kleine groepjes met behulp van de punt van een 5 ml pipet. Breng de geschorste cel klonten in een nieuwe MEF-gecoate put (s).

2. Overgang van hESC 's van MEF feeder-vrije omstandigheden op extracellulaire matrix-gecoate platen

  1. Bereid MEF geconditioneerd medium (CM)
    1. Plate de bestraalde MEFs in een T75 kolf bij 90-100% samenvloeiing; Het is belangrijk dat de MEFs dicht worden uitgeplaat. Observeer de cellen met behulp van een microscoop om te bepalen of ze naar de bodem van de kolf zijn gehecht (MEFs hechten ongeveer 6 uur na plateren of de volgende dag).
      OPMERKING: Losse cellen drijven in het medium wanneer waargenomen met behulp van een microscoop. De volgende dag, verwijder MEF medium en voeg 25 ml van hESC medium zonder B-FGF.
    2. Verzamel het geconditioneerde medium na 24 uur incubatie. Vervangen door vers medium per dag gedurende maximaal 12 dagen.
    3. Filter de verzamelde CM behulp van een 0,22 pm filter. Voorafgaand aan het gebruik, voeg verse B-FGF aan de CM.
      OPMERKING: CM kan worden ingevroren bij -80 ° C bewaard tot 1 jaar. Alternatief bewaar het GH bij 4 ° C gedurende 2 weken.
  2. De overgang van de hESCs van cultuur op de MEF feeder-vrije extracellulaire matrix gecoate platen.
    1. Bereiding van extracellulaire matrix voor het bekleden weefselkweekplaten
      1. Dooi een hoeveelheid extracellulaire matrix op ijs (ongeveer 3-4 uur). Gebruik ijskoude tips, een koude, 50 ml conische buis en DMEM / F12 medium, overdracht 2 mg van extracellulaire matrix in 24 ml ijskoude DMEM / F-12 (verdunning hangt af van de extracellulaire matrix concentratie van de leverancier ).
      2. Onmiddellijk over de 50 ml conische buis op ijs en het op 4 ° C. Voor coating weefselkweekplaten, voeg de juiste hoeveelheid verdund extracellulaire matrix naar de bron (bijvoorbeeld 1 ml per putje in een 6-wells plaat). Zwenk het bekleden van de plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur.
    2. HESCs passage van MEF (zoals in stap 1,3) via CM bevattende B-FGF (10 ng / ml).
      1. Zuig aan de extracellulaire matrix van de nieuwe plaat te verwijderen en voeg CM bevatten B-FGF. Breng de geschraapt cellulaire klonten van het MEF plaat met behulp van een pipet en aliquot het in de extracellulaire matrix gecoate plaat. Incubeer in het 37 ° C zuurstofarme incubator 's nachts.
      2. Vervang de CM met B-FGF medium dagelijks; de hoeveelheid medium zal afhangen van de grootte van de kweekfles. Gebruik 2 ml medium voor een 6-well well. Schraap gedifferentieerde cellen met een Pasteur pipet.
      3. Passage hESCs elke 6-7 dagen, toen kolonies zijn helder wanneer bekeken onder de microscoop.
        LET OP: hESC kolonies gegroeid op extracellulaire matrix gecoate platen groeien groter dan MEF-gekweekte cellen.
      4. Wanneer de feeder-vrije cellen zijn klaar om passage, verwijder het medium, wassen door adding 1 ml PBS met een pipet, zuig de PBS te verwijderen, 0,5 mg / ml dispase (voorverwarmd tot 37 ° C) met een pipet, en incuberen bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
      5. Was de cellen met PBS door toevoeging van 2 ml PBS per putje en daarna afzuigen. Voeg 1 ml per putje CM handmatig schrapen van de cellen in kleine klompjes met de punt van een 5 ml pipet.
      6. Plate de geschorste cel klonten in nieuwe extracellulaire matrix beklede platen; de cellen moeten zich houden na 24 uur.

3. Differentiatie van hESCs behulp BMP4 / A / P

  1. Bereid de differentiatie medium. Gebruik CM (gebrek B-FGF) en voeg (vers) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 uM) en PD173074 (0,1 uM). Voeg deze remmers van het GH voor gebruik.
  2. Gebruik feeder-free hESCs groeien op extracellulaire matrix gecoate platen voor 1 passage, gekweekt in een incubator ingesteld op 4% zuurstof. Na de eerste passage op extracellulaire matrix gecoate platen,laat de cellen hechten gedurende 24 uur. De volgende dag initiëren differentiatie. Verwijder de CM (met B-FGF) en vervangen door CM bevattende BMP4 / A / P (2 ml per putje in een 6-wells plaat). Verder kweken van de cellen onder toepassing van 4% zuurstof.
  3. Vervang het GH bevattende BMP4 / A / P (2 ml / putje van een 6-wells plaat) elke 2 dagen. Zuig de oude medium verwijderen en voeg nieuwe CM met een pipet. Op de tweede dag na het toevoegen en verwijderen BMP4 B-FGF (beschouwd differentiatie dag 2), zal de celmorfologie wijzigt, verschijnen groter bij waarneming met een microscoop.
    OPMERKING: ongedifferentieerde cellen zijn licht afgeronde hoeken vertonen, niet aanwezig zal zijn.
  4. Verzamel cellen op de gewenste tijdstippen. Gedifferentieerde cellen zal stoppen met delen na ongeveer 2 weken. Transfecteren cellen tijdens deze periode (zie de volgende paragraaf).

4. Transfectie van trofoblastcellen met siRNA of Plasmide DNA

  1. Bereid trofoblastcellen voor transfectie
    1. Cultuur hESCs voor twee passages over de extracellulaire matrix na hen overbrengen van de MEF (zie stap 2.2). Gebruik hESC medium dat B-FGF.
    2. Splits de hESC 's op een nieuwe extracellulaire matrix plaat één dag voor differentiatie. Hoge cellulaire confluentie belangrijk, zodat de cellen gesplitst 1: 1 op een nieuwe plaat / putje, die de volgende dag garandeert minimaal 50% confluentie. Incubeer de cellen 's nachts in de zuurstofarme incubator.
      LET OP: hESCs hoeft niet tijdens deze stap te tellen.
    3. De volgende dag vervangen door het product met de differentiatie medium (CM bevattende BMP4 / A / P en weinig B-FGF toepassing van 2 ml / putje van een 6-wells plaat). Verwijder het oude medium door afzuigen en breng het nieuwe medium (2 ml) met een pipet. Plaats de cellen in een zuurstofarme incubator (4% zuurstof) gedurende de nacht.
  2. Transfecties gebruikt voor siRNAs genverstoring of middels plasmide-DNA
    1. Differentiëren de cellen tot de gewenste tijd-punt (tussen dag 1 en 14). De dag voor transfectie, trypsinize de cellen met behulp van 0,05% trypsine gedurende 5 min. Plaat ze de gewenste confluentie (afhankelijk van het transfectiereagens protocol) op een met gelatine beklede platen (voeg 0,1% gelatine een weefselkweekplaat gedurende 20 min en zuig te verwijderen). CM bevatten BMP4 / A / P (gebrek aan B-FGF) toe te voegen en incubeer overnacht.
    2. De volgende dag, toevoegen van vers medium tot differentiatie van de cellen. Transfecteren siRNAs met een siRNA transfectiereagens. Voor plasmide-DNA, gebruik van een geschikt lipofectamine reagens.
    3. Volg de product-protocol zoals beschreven voor elke transfectiereagens. Breng de siRNA-lipofectamine complexen aan elk putje / plaat van cellen, meng voorzichtig, en de cultuur van de cellen 's nachts in een zuurstofarme incubator.
      OPMERKING: Sommige transfectiereagentia worden geremd door antibiotica, die nodig CM ontbreekt Pen / Strep.
    4. De volgende dag, te vervangen door verse differentiatie media.
    5. Oogst de cellen op het verlangend tijdstippen (bijvoorbeeld, 24 uur, 48 uur en 72 uur) aan de gendisruptie efficiëntie wordt gecontroleerd met behulp van kwantitatieve RT-PCR. Oogst cellen Gebruik 0,05% trypsine, toevoegen van 1 ml per putje en incubatie gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Voeg 5 ml van MEF medium per goed aan de trypsine te neutraliseren. Spin down de cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten en gebruik de celpellet voor RNA-isolatie.

5. Pathogeen Infectie van trofoblastcellen: Sendai virale infectie

  1. Bereid hESCs voor differentiatie
    1. Cultuur hESCs voor twee passages over de extracellulaire matrix na de overdracht van het MEF (zie stap 2.2). Gebruik hESC medium dat B-FGF.
    2. Splits de hESC 's op een nieuwe extracellulaire matrix plaat één dag voor differentiatie. Hoge cellulaire confluentie belangrijk, zodat split cellen 1: 1 op een nieuwe plaat / putje, die de volgende dag garandeert minimaal 50% confluentie. Incubeer de cellen 's nachts in een zuurstofarme incubator (4% zuurstof).
      NB: hESCs hoeft niet tijdens deze stap te tellen.
    3. De volgende dag, vervang het medium met de differentiatie medium (CM bevatten BMP4 / A / P en ontbreekt B-FGF) en cultuur 's nachts in een zuurstofarme incubator (4% zuurstof).
  2. Sendai virale infectie van trofoblastcellen
    1. Een dag voor de gewenste differentiatie dag, trypsinize de differentiërende cellen (tot enkele cellen) met behulp van 0,05% trypsine gedurende 5 minuten en overbrengen naar een gelatine-gecoate plaat. Voeg differentiatie medium en incubeer overnacht in een zuurstofarme incubator.
    2. De volgende dag, voeg medium geïnfecteerd (dit hangt af van het virus). Gebruik CM ontbreekt Pen / Strep met BMP4 / A / P, met behulp van 0,5 ml voor één putje van een 6-wells plaat. Voeg Sendai virus voor MOI = 1. Incubate voor 8 uur in een zuurstofarme incubator.
    3. Als extra tijd-punten nodig zijn, verwijder het virus bevattend medium na 4 uur en vervang deze door BMP4 / A / P CM. Verzamel cellenvoor RNA-isolatie met een cel schraper.
    4. Bepaal de efficiëntie van virale infectie door het uitvoeren qRT-PCR voor genen betrokken bij de virale respons 18.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Overzicht van In Vitro Differentiatie van hPSCs

Dit in vitro differentiatie protocol begint met ongedifferentieerde hESC 's geteeld op MEF die worden overgebracht naar feeder-vrije omstandigheden gedurende één doorgang (Figuur 1A). Terwijl we de differentiatie van hESC 's beschreven in dit protocol, gebruikten we dit protocol om hiPSCs succesvol differentiëren in trofoblastische cellen. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteerden de basisstappen voor de differentiatie hESCs in trophoblast voorlopers. Dit protocol is onlangs geoptimaliseerd om hESCs snel onderscheid met de toevoeging van activine / Nodal signalering remmers, waardoor de differentiatie trofoblastcellen en het vermijden van de vorming van mesoderm voorlopers, die typisch waargenomen BMP4 behandeling alleen. Het BMP4 model systeem maakt het mogelijk voor het onderzoek van de vroegste stadia van de menselijke afstamming trophoblast specificatie en expansie. Daarnaast...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een Pennsylvania Health Research Formula Fund.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEM/F12Invitrogen11330-057
Knock Out Serum ReplacementInvitrogen10828-028Dit wordt in dit protocol aangeduid als "serum vervanging".
NEAAInvitrogen11140-050
FBSInvitrogen16000-044
L-GlutamineInvitrogen10828-028
Penicilline/StreptomycineInvitrogen15140-155
2-MercaptoethanolSigmaM-7522
B-FGFMilliporeGF-003
DMEMInvitrogen11965-118
DispaseInvitrogen17105-041
Collagenase Type IVInvitrogen17104-019
Rock-remmer Y27632Calbiochem688000
Bestraalde CF1 MEFsGlobalStem6001GMEFs kunnen worden gegenereerd uit embryo's op dag 13.5 en bestraald.
0,22 µm spuitfilterMilliporeSLGS033SS
Heracell 150i lage zuurstof incubatorHeracell/VWR89187-192Elke weefselkweekincubator met de mogelijkheid om zuurstofconcentraties te reguleren is voldoende.
BMP4R&D Systems314-BP-01M
A 83-01R&D Systems2939/10
PD173074R&D Systems3044/10
RNAiMaxInvitrogen13778150
TrizolThermoFisher15596026Trizol wordt gebruikt om totaal RNA te isoleren.
X-tremeGENE 9Roche6365779001
MatrigelCorning356231Dit wordt in dit protocol aangeduid als "extracellulaire matrix".

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rugg-Gunn, P. J. Epigenetic features of the mouse trophoblast. Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).
  2. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  3. Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
  4. Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
  5. Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
  6. Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
  7. Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
  8. Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
  9. Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
  10. Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
  11. Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
  12. Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
  13. Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
  14. Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
  15. Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
  16. Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be? Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
  17. Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
  18. Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
  19. Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
  20. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
  21. Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
  22. Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
  23. Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082(2009).
  24. Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
  25. Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
  26. Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
  27. Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
  28. Cole, L. A. Hyperglycosylated hCG, a review. Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).
  29. Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Differentiatie van trofoblastcellenBone Morphogenic Protein 4Activine Nodal signaleringsremmerscoating met extracellulaire matrixfeeder vrije kweekincubatie bij een laag zuurstofgehaltesiRNA transfectiekwantitatieve RT PCRgelatinecoating

Gerelateerde artikelen