Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Samenvatting

We hebben een modulair high-throughput screening ontwikkeld voor het ontdekken van nieuwe verbindingen tegen Mycobacterium tuberculosis, intracellulaire targeting en-bouillon kweken bacteriën en cytotoxiciteit tegen de zoogdiergastheercel.

Samenvatting

Mycobacterium tuberculosis, de veroorzaker van tuberculose (TB), is een leidende oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Met de toegenomen verspreiding van multi-drug resistente TB (MDR-TB) is er een reële urgentie om nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen tegen M. tuberculosis infecties. Traditioneel worden verbindingen geëvalueerd op basis van hun antibacteriële activiteit onder in vitro groeicondities in bouillon; echter, resultaten zijn vaak misleidend voor intracellulaire pathogenen zoals M. tuberculosis omdat de fenotypische screeningcondities in bouillon aanzienlijk verschillen van de werkelijke ziektecondities in het menselijk lichaam. Het screenen van remmers die werken binnen macrofagen is traditioneel moeilijk geweest vanwege de complexiteit, variabiliteit in infectie en langzame replicatiesnelheid van M. tuberculosis. In deze studie rapporteren we een nieuwe aanpak om snel de effectiviteit van verbindingen op de levensvatbaarheid van M. tuberculosis in een macrofaaginfectiemodel te beoordelen. Door een combinatie van een cytotoxiciteitstest en een in-bouillon M. tuberculosis levensvatbaarheidstest te gebruiken, waren we in staat om een screeningssysteem te creëren dat een uitgebreide analyse van verbindingen van belang genereert. Dit systeem is in staat om kwantitatieve gegevens te produceren tegen een lage kostprijs die binnen het bereik van de meeste laboratoria ligt en toch is het zeer schaalbaar om te passen in grote industriële omgevingen.

Inleiding

Mycobacterium tuberculosis, de verwekker van tuberculose (TB), is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Geneesmiddel- gevoelige TB is een behandelbare ziekte die meerdere antibiotica gedurende 6 maanden vereist. Ondanks dat het een behandelbare ziekte, werd TB sterfte geschat op 1,5 miljoen in 2015 ^1. In de afgelopen 10 jaar zijn er zijn toenemende bezorgdheid over de prevalentie van resistente M. tuberculosis. Multiresistente tuberculose (MDR-TB) wordt gedefinieerd als tuberculose die resistent is tegen ten minste isoniazide (INH) en rifampicine (RMP), en de meeste MDR-TB-stammen zijn ook bestand tegen tweedelijns tbc selecteren, dus beperkt behandelingsmogelijkheden . De effecten van geneesmiddelresistentie maken een grotere uitdaging voor de behandeling van patiënten die geïnfecteerd zijn met humaan immunodeficiëntievirus (HIV); 400.000 patiënten wereldwijd overleden aan HIV-geassocieerde TB in 2015 ^1. Teleurstellend, de Amerikaanse Food and Drug Administrantsoen heeft goedgekeurd slechts één nieuwe TB-geneesmiddelen tegen MDR-TB, Bedaquiline, in de afgelopen 40 jaar ^2. Vooruitgang in het vinden van betere en kortere TB therapieën zijn dringend nodig om voorop te blijven in de strijd tegen tbc en MDR-TB.

Traditioneel worden TB drug screens uitgevoerd onder in vitro kweekomstandigheden in groeimedium, waarbij verbindingen worden toegevoegd aan een groeiende kweek en hun doeltreffendheid bij het uitroeien van de micro-organismen wordt bepaald door het tellen van kolonievormende eenheden (CFU) op vast medium. Zoals CFU tellingen zijn arbeidsintensief, tijdrovend en kostbaar zijn verschillende indirecte methoden ontwikkeld om dit probleem te verlichten. Dergelijke werkwijzen omvatten de Alamar Blue assay levensvatbaarheid ^3, de bepaling van fluorescentie ⁴ van groen fluorescent eiwit (GFP) of luminescentie ⁵ van luciferase-expressie bacteriën, en de schatting van de totale adenosine trifosfaat (ATP) ^{6, 7.}

Typische TB wordt gekenmerkt door een M. tuberculosis-infectie van de longen, waar de bacteriën bevinden en repliceren in de phagosomes van alveolaire macrofagen ^8. De eenvoudige bouillon fenotypische scherm kan extracellulaire pathogenen te passen; Echter, in het historisch perspectief, sloeg verbindingen tegen M. tuberculosis geïdentificeerd met behulp van deze methode vaak niet om te voldoen aan de verwachtingen tijdens downstream validatie stappen in modellen van infectie. Wij stellen voor dat TB drug wordt het best uitgevoerd in een intracellulaire gastheercel infectie model. Toch intracellulaire modellen beschikken over een groot aantal technologische en biologische barrières voor high-throughput screening (HTS) ontwikkeling. Een grote hindernis is de complexiteit van het infectieproces, geïllustreerd door tal van stappen en de uitgebreide verwijdering van extracellulaire bacteriën door middel van in-tussen wassen. Een tweede belangrijke horde is de lange tijd aan het opnieuwquirements, de groei detectie Gewoonlijk wordt hierbij CFU rekenen op kweekplaten, is een proces dat meer dan 3 weken in beslag neemt. Een oplossing voor CFU tellingen vervangen is door geautomatiseerde fluorescentie microscopie in combinatie met fluorescerende bacteriën. Echter, deze oplossing vereist een initiële investering in apparatuur die buiten het bereik van vele onderzoekslaboratoria. Een eenvoudige, goedkope en ziekte-relevante HTS methode zou sterk verbeteren het geneesmiddel ontdekkingsproces.

In deze studie rapporteren we een nieuwe, modulaire HTS systeem dat is gericht op een snelle en zeer schaalbaar, zuinige, assay voor de bepaling van de activiteit van verbindingen tegen intracellulaire M. tuberculosis. Dit systeem bestaat uit drie modules: (i) intracellulair, (ii) cytotoxiciteit en (iii) in bouillon assays. De gecombineerde eindresultaat geeft een uitgebreide beschrijving van de verbinding eigenschappen, aanvullende informatie over de mogelijke werkingsmechanismen. dit screening systeem is gebruikt in verscheidene projecten verschillende samengestelde bibliotheken die werkingsmechanisme targeten, waaronder de analyse van geneesmiddel synergie ^9, de stimulering van autofagie ^10, en de remming van M. tuberculosis -secreted virulentiefactor (ongepubliceerd). Verbindingen van onbekende werkingsmechanisme hebben ook onderzocht ^11. Een aangepaste versie van deze methode werd ook door onze industriële partner aangenomen als de primaire screening methode om nieuwe verbindingen te identificeren tegen intracellulaire M. tuberculosis ^11.

Protocol

1. bacteriestam en groeimedium

1. Voeg albumine dextrose en zout voorraadoplossing (ADS) door het oplossen van 25 g runderserumalbumine, 10,0 g dextrose en 4,05 g natriumchloride in 460 ml gedeioniseerd water. Filter-steriliseer de ADS en bewaar bij 4 ° C.
2. Voeg 7H9 bouillon door toevoeging van 4,7 g 7H9 poeder en 2 ml glycerol en 900 ml gezuiverd water. Autoclaaf de 7H9 bouillon bij 121 ° C gedurende 10 minuten en laat het afkoelen tot kamertemperatuur alvorens. Maak 7H9ADST door toevoeging van 100 ml van ADS en 0,5 ml Tween80 tot 900 ml van 7H9 bouillon. Bewaren bij 4 ° C.
3. Weeg 50 mg kanamycine sulfaat en los op in 1 ml gedeïoniseerd water; de uiteindelijke concentratie 50 mg / ml. Filter-steriliseer en bewaar bij -20 ° C. Voeg 0,5 ml kanamycine voorraadoplossing per 1 liter 7H9ADST.
   Let op: dit medium moet vers worden gemaakt, zodat de schaal van de volumes op de juiste wijze in overeenstemming met de cultuur grootte.
4. Groeien M. tuberculosis in 7H9ADST aangevuld met kanamycine in staande cultuur. Schud de cultuur dagelijks en verdunnen voordat de OD600 bereikt 1,0 tot klonteren te voorkomen.
   LET OP: Het M. tuberculosis stam die is gebruikt voor de ontwikkeling van deze methode werd H37Rv getransformeerd met pJAK2.A plasmide ^12. pJAK2.A is een integratief plasmide gebaseerd op de pMV361 vector, die een hoog-niveau expressie van de vuurvlieg luciferasegen van de hsp60 promotor mogelijk maakt en kan worden geselecteerd met kanamycine.

2. THP-1 Medium en onderhoud

1. Voeg 50 ml met warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 5 ml 200 mM L-glutamine en 500 ml RPMI 1640 met RPMI maken onvolledig medium (circa 10% FBS en 2 mM glutamine).
2. Onderhouden van een THP-1 celkweken volgens standaardprotocol ^13. In het kort, groei THP-1-cellen in RPMI medium onvolledige terwijl een celdichtheid van 0,2-1.000.000 per ml medium tussen paswijzen.

3. High-throughput Intracellulaire Screening Met behulp van Luciferase uiten M. tuberculosis H37Rv

1. Meet de extinctie van een actief groeiende bacteriesuspensie in een spectrofotometer bij een golflengte van 600 nm. Bereken de bacteriedichtheid met de conversiefactor van 0,1 OD ₆₀₀ = 3 x 10 ⁷ bacteriën per ml.
2. Pipet niet voldoende bacteriën een multipliciteit van infectie (MOI) van 10: 1 in een nieuwe centrifugebuis. Pellet bij 3000 xg gedurende 10 min en zuig de vloeistof. Voeg 50 ul humaan serum tot 450 gl RPMI1640. Schaal het volume op waarden die geschikt zijn voor het experiment.
3. De bacteriën opsoniseren, resuspendeer de pellet in een dichtheid van 1 x 10 ⁸ bacteriën per 500 pl RPMI 1640 dat 10% humaan serum. Laat het mengsel incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Bepaal de THP-1 celkweken dichtheid door tellen met een hemocytometer en een omgekeerde Micrpe.
4. Pellet de cellen in steriele centrifugebuizen bij 100 xg en 37 ° C gedurende 10 minuten. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in RPMI incomplete bij een dichtheid van 1 miljoen cellen per ml. Add forbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA) tot 40 ng / ml eindconcentratie.
   OPMERKING: Dit zal de differentiatie mix worden aangeduid.
5. Combineer geopsoniseerd M. tuberculosis met THP-1 differentiatie mengsel bij een MOI van 10: 1 en het laatste aliquot mix in 100 ul per putje in een 96 putjes vlakke bodem witte plaat. Regelmatig roer het mengsel tot uniformiteit. Laat de differentiatie en infectie overnacht bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% _CO2.
6. Was de putjes tweemaal met 100 pl RPMI elk. verbindingen verdund tot de gewenste concentraties in RPMI onvolledige toe en incubeer gedurende 3 dagen.
7. Zuig het medium van de putten. Voeg 50 pl luciferase testreagens aan elk putje. Dicht de platen met transparent kleefplaat sealers. Toestaan ​​5 min incubatie bij 22 ° C en vervolgens een uitlezing in een luminometer verkrijgen 1 s per putje.

4. Cytotoxiciteit analyse met behulp van een 3- (4,5- dimethylthiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) assay ¹⁴

1. Differentiëren THP-1-cellen in RPMI onvolledige aangevuld met 40 ng / ml PMA in heldere platen met 96 putjes. Handhaaf een celdichtheid van 1.000.000 per ml monster en 100 ul per putje. Toestaan differentiatie overnacht bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% _CO2.
2. Zuig het medium van de putten en was ze tweemaal met RPMI 1640. verbindingen verdund in RPMI onvolledig aan de putjes toe. Incubeer gedurende 3 dagen.
3. Ontbinding 0,5 g MTT in 100 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) een voorraadoplossing van 5 mg / ml te maken. Steriel filter en bewaar bij -20 ° C, beschermd tegen licht; is het het beste om deze oplossing vers te maken.
4. 2,5 h before het einde van de 3-dagen incubatieperiode, voeg 25 ul MTT-oplossing aan elk putje en voltooi de incubatieperiode.
5. Bereid 50% N, N-dimethylformamide (DMF) door het mengen van 250 ml DMF met 250 ml gedeïoniseerd water.
6. Bereid MTT extractiebuffer als volgt: Weeg 100 g SDS in een 500 ml fles en voeg 300 ml 50% DMF. Breng een laag vuur, zodat de SDS op te lossen. Voeg 10 ml zuiver azijnzuur en 12,5 ml 1 M HCl. Vullen tot 500 mL markering met 50% DMF; de uiteindelijke samenstelling van de extractiebuffer is 50% DMF, 20% SDS, 2,5% azijnzuur en 2,5% 1 M zoutzuur.
7. Na afloop van de behandelingsperiode, voeg 100 pl extractiebuffer aan elk putje (verwarmd tot 45 ° C om alle kristallen op te lossen). Laat het mengsel gedurende een nacht incuberen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% _CO2. Lees de absorptie bij 570 nm.
   OPMERKING: De cytotoxiciteit assay wordt het best uitgevoerd in parallel met een intracelular scherm met behulp van dezelfde batch en leeftijd van THP-1 cellen.

5. bouillon behulp Activity Analysis een Resazurin Assay ³

1. Groeien M. tuberculosis in 7H9ADST de mid-logfase (~ 0,5-0,8 OD _600). Verdun de cultuur met de 7H9ADST tot 0,01 OD _600. Verdun de verbindingen 7H9ADST het testen concentratie en hoeveelheid 100 pl van elk verdund 2x verbinding in elk putje.
2. Breng 100 pi van de verdunde bacteriële suspensie in elk putje. Laat de platen geïncubeerd bij 37 ° C in een bevochtigde incubator gedurende 5 dagen. Los 10 mg resazurine in 100 ml gedeïoniseerd water en steriel filter.
3. Voeg 30 ul van resazurin oplossing en het toezicht op de kleurverandering na 48 uur; bacteriegroei wordt aangegeven door een kleur conversie van blauw naar roze.
   Opmerking: Een kwantitatieve analyse kan worden uitgevoerd door het meten van ofwel de fluorescentie bij 590 nm met excitatie bij 530-560nm en de absorptie bij 570 nm en 600 nm ^15.

Resultaten

High-throughput screening met intracellulaire M. tuberculosis die het luciferasegen

Figuur 2A en Tabel 1 bevat de ruwe gegevens verzameld door de luminometer, uitgedrukt in relatieve luminescentie-eenheden (RLU), die het effect van een toenemende concentratie van tuberculose geneesmiddel rifampicine op M. tuberculosis in THP-1 cellen. Figuur 2A is een spreidings...

Discussie

Het doel van dit onderzoek was om een eenvoudige en kosteneffectieve HTS methode met behulp van een menselijke intracellulaire infectie model voor M. tuberculosis te creëren. Tuberculose is een menselijke ziekte gekenmerkt door de infectie van alveolaire macrofagen van M. tuberculosis. Als gevolg van bioveiligheid kwesties, heeft het onderzoek met biologische modellen van zowel de bacterie en de gastheercellen zijn gebruikt in het verleden. Er is echter aangetoond dat het gebruik van surrogaat bacterië...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R5886
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Fetaal bovien serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	12483020
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson and Company	271210
Tween80	Fisher Scientific	T164
Albumine, bovien pH7	Affymetrix	10857
Dextrose	Fisher Scientific	BP350
Natriumchloride	Fisher Scientific	BP358
kanamycinsulfaat	Fisher Scientific	BP906
PMA	Sigma-Aldrich	P8139
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Fisher Scientific	D131
1 M Hydrochloorzuur (HCl)	Fisher Scientific	351279212
Azijnzuur	Fisher Scientific	351269
SDS	Fisher Scientific	BP166
Resazurin	Alfa Aesar	B21187
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Glycerol	Fisher Scientific	BP229
THP-1	American Type Culture Collection	TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-wells wit plaat met platte bodem	Corning	3917
95-wells doorzichtige plaat met platte bodem	Corning	3595
Transparante plaatsealer	Thermo Fisher Scientific	AB-0580
Spectrofotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate 3
Microplaatspectrofotometer	Biotek	Epoch
luminometer	Applied Biosystems	Tropix TR717