Methoden voor de Self-integratie van Megamolecular Biopolymeren op de drooglucht-LC Interface

Samenvatting

Een werkwijze voor het drogen geïnduceerde zelfintegratie van megamolecular biopolymeren op de lucht-vloeistof grensvlak kristallijn is hier voorzien. Deze methodologie zal niet alleen nuttig zijn voor het begrijpen van de macroscopische mogelijkheden van biopolymeren, maar ook als een evaluatiemethode voor de zachte materialen in biomedische en milieugebied.

Samenvatting

Levende organismen die water gebruiken, zijn altijd gevoelig voor drogen in de omgeving. Hun activiteiten worden gedreven door-biopolymeer gebaseerde micro- en macro-structuren, zoals te zien is in het geval van het bewegen van water in vaatbundels en hydraterende water in de huidlagen. In deze studie hebben we een methode om het effect van water vloeibaar kristallijne (LC) oplossingen bestaande uit biopolymeren bij drogen. LC biopolymeren hebben megamolecular gewicht, kozen we polysacchariden, cytoskelet eiwitten en DNA bestuderen. De waarneming van biopolymeeroplossingen tijdens drogen onder gepolariseerd licht toont milliscale zelfintegratie vanaf de onstabiele lucht-LC interface. De dynamiek van de waterige LC biopolymeeroplossingen kan worden gevolgd door verdampen van water uit een aan één zijde open cellen. Door het analyseren van de beelden die met behulp van cross-gepolariseerd licht, is het mogelijk de ruimtelijke en temporele veranderingen in de oriëntatie ordeparameter herkennen. Dezemethode kan nuttig zijn voor de karakterisering van niet alleen kunstmatige materialen op verschillende terreinen, maar ook natuurlijke levende weefsels. Wij zijn van mening dat het een evaluatiemethode zal zorgen voor zachte materialen in de biomedische en milieugebied.

Inleiding

Door zich op de stijve, staafvormige structuren van biopolymeren zijn dynamische zachte materialen gebruikt voor diverse toepassingen, waaronder polysaccharide biofilm matrices ^1, "GELS" bestaande uit cytoskeleteiwitten ² en "DNA origami" van gewenste vormen ^3. De structurele eigenschappen te verduidelijken, zijn vele strategieën onderzocht, zoals transmissie-elektronenmicroscopie, scanning elektronenmicroscopie, atomic force microscopie en confocale fluorescentiemicroscopie. Echter, omdat deze methoden meestal worden uitgevoerd in een droge of statische toestand, is het moeilijk om het dynamische gedrag in macroscopische schaal te leggen, zoals te zien is in de werkelijke levende systemen. Onlangs hebben we met succes gezien het dynamische gedrag van biopolymeren op het water air-LC-interface door middel van gepolariseerd licht ^4. Bij de toelichting van de georiënteerde structuur tijdens het drogen het biopolymeeroplossing, de tijdelijke veranderingen aangegeven zelfintegratie van biopolymeren op onstabiele air-LC interface.

We beschrijven hier een protocol voor het drogen van LC biopolymeeroplossingen aan de lucht-interface met behulp van LC gepolariseerd instrumenten. In tegenstelling tot andere analyses van de LC fase die geen rekening drogen ^{5, 6,} werden de LC dynamiek tijdens het droogproces hier onderzocht door het evalueren van de oriëntatie ordeparameter in het zijaanzicht van de vloeibare fase in een aan één zijde open cellen . De combinatie van de cel verdamping en het gebruik van gepolariseerde instrumenten toegestaan ​​macroscopische toezicht gehouden gecontroleerde opdamprichting. Bovendien was het mogelijk om het drogen records zijn gevalideerd door zich op de kristalstructuren van de geadsorbeerde microdomeinen, die werden beïnvloed door het molecuulgewicht, concentratie, etc. Om de effectiviteit van de werkwijze te tonen, het drogen prosen basische biopolymeren met stijve stang vormen, zoals polysacchariden, microtubuli (MT), en DNA, onderzocht. We kozen voor deze biopolymeren, omdat ze zijn typische voorbeelden van hiërarchische macromoleculen met megamolecular gewichten, en hun intermoleculaire interacties hen in staat stellen LC staten te vormen.

Protocol

1. Instrumenten

1. polarisatie-inrichting
   1. Een polarisatie-inrichting te construeren, te lichtbron een halogeenlamp, een lichtgeleider, polarisatoren, een monstertafel een optisch spoor, staaf bevindt en een digitale spiegelreflexcamera (zie Figuur 1 C and Materials List voor de polarisatie apparaatonderdelen).

2. Voorbereiding van het biopolymeer Solution

1. polysaccharide oplossingen
   1. Ontbinden sacran ⁷ (0,5 g) in zuiver water (100 ml) werd geroerd bij -80 ° C gedurende meer dan 12 uur. Tijdens het oplossen, bedek de container met plastic folie om verdamping te voorkomen. Bereid een waterige oplossing van xanthaangom op dezelfde wijze.
   2. Koel de oplossing bij -25 ° C tot 0,5 gew% waterige oplossing te verkrijgen.
   3. Centrifugeer de oplossing sacran onzuiverheden (48.400 x g, 4 ° C, 1 uur, 3 tim verwijderenes).
2. MT oplossing
   1. Bereid een 0,5 gew% tubuline-oplossing (1 ml) in een Britton-Robinson-buffer (80 mM piperazine-N, N'-bis (2-ethaansulfonzuur) (PIPES), 1 mM ethyleenglycol-bis (β-aminoethyl ether) - N, N, N ', N'-tetraazijnzuur (EGTA) en 5 mM _MgCl2, pH 6,8) op ijs ^8.
   2. Met 0,5 gew% tubuline-oplossing (50 pl) en guanosine-5' - [(α, β) -methyleno] trifosfaat (GpCpp) (5 pl) van een GpCpp-tubuline bevattende oplossing (50 pl) werd bereid. Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 h teneinde een stabiele MT kern te verkrijgen.
      LET OP: De rol van GpCpp is om MT vorming te ondersteunen en de depolymerisatie van MT volledig te onderdrukken aan tubuline.
   3. Meng 0,5 gew% tubuline-oplossing (950 pi) en de GpCpp-tubuline bevattende oplossing (50 pl) bij -25 ° C gedurende 1 dag om een ​​stabiele 0,5 gew% MT oplossing.
3. DNA-oplossing
   1. Bereid een 0,5 gew% DNA-oplossing (1 mL) in Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris, pH 8,0, met 1 mM EDTA).
4. Houd de 0,5 gew% biopolymeer monsteroplossingen bij 25 ° C voor het drogen experiment.

3. Drogen experimenten en observatie onder Cross-gepolariseerd licht

1. Oplossingen in een aan één zijde open cellen (Figuur 1A)
   1. Snijd een siliciumplaat (zie Materialen List) in een geschikte vorm met een dikte van 1 mm (binnenmaat van 5-15 mm, 1 mm en -20 mm; Figuur 1A).
      1. Monteer een aan één zijde open cellen bestaat uit een silicium afstandhouder met een binnenafmeting van 5-15 mm, 1 mm en -20 mm en twee niet-gemodificeerde glasplaatjes (76 mm x 1 mm x 26 mm). Fix beide zijden van de cel met dubbele klemmen vooraf aan de monsteroplossing weglekt houden.
   2. Voeg langzaam elk 0,5 gew% biopolymeer oplossing (100-300 uL) met een ~ 1 mm poriegrootte pipette tip om elke cel bij -25 ° C. Verwijder luchtbellen uit de cellen met behulp van een injectienaald.
   3. Plaats de cellen in een oven met een lucht circulator bij 60 ° C onder atmosferische druk te verdampen; verdamping richting tegengesteld aan die van de zwaartekracht.
2. Waarnemingen onder dwars-gepolariseerd licht (Figuur 1B-1C)
   1. Verschaffen rechte zichtbaar licht via een 100 W halogeenlamp met een platte oppervlaktelichtbron een groot contactoppervlak (80 mm x 80 mm). Pas de polarisatoren 45 ° en 135 ° met de houders (figuur 1C).
   2. Bevestig de positie van de lichtbron, polarisatoren, monsterplateau en de camera met een optische spoor en stang staat (figuur 1C). Plaats de monstertafel tussen de beide polarisatoren (de afstand tussen de polarisatoren moet -5 cm). Zet de camera ~ 20 cm van het monster podium te laten scherpstellen.
   3. Op bepaalde tijdstippen, plaatst de monsters uit stap 3.1.3 tussen de polarizers op het podium evenwijdig aan het XZ-vlak en bedekken de inrichting met een zwart gordijn; het betreffende toestel wordt getoond in Figuur 1C.
   4. Fotografeer de monsters door middel van lineaire gekruiste polarisatoren met een digitale spiegelreflexcamera met een standaard zoomlens (zie Materials List). Controle over de camera-instellingen, zoals de brandpuntsafstand, met behulp van computer software (zie Materials List).
3. Spatio-temporale analyse van de doorgestraalde lichtintensiteit (figuur 1C)
   1. De verandering van de oriëntatie ordeparameter het droogproces te evalueren, verzamelen foto uur gedurende 24 uur.
   2. Meet de doorgestraalde lichtintensiteit langs de hartlijn in de Z-richting als grijswaarde via een beeldbewerkingsprogramma (bijvoorbeeld ImageJ).
   3. Maak een grafiek van de grijswaarde als functie van de afstand vanaf de bovenkant open zijde.
4. Microscopische waarneming onder gepolariseerd light (Figuur 1D)
   1. De werkwijzen te verifiëren, microscopische waarneming met een polarisatiemicroscoop uitgerust met een CCD camera ^9. Houd een eerste-orde vertragingsplaat in het lichtpad. Controle van de voorwaarden voor de foto's met behulp van een pc-software.

Resultaten

Het toestel als getoond in figuur 1, de zelf-integratie van microdomein tot macrodomain een drooglucht-LC grensvlak werd geëvalueerd (figuur 2A). Aangezien de eerste demonstratie van het drogen experiment twee soorten megamolecular polysacchariden, sacran _(Mw = 1,9 x 10 ⁷ g mol ^-1) en xanthaangom (4,7 x 10 ⁶ g ^mol-1), werden vergeleken. Figuur 2B toont foto's van d...

Discussie

Het was soms moeilijk voor de camera te richten op het monster als gevolg van de uitgezonden lichtintensiteit te laag. In dergelijke gevallen, het plaatsen van een verlengde doorzichtige kunststoffolie op het podium hielp om scherp te regelen. De beperking van de waarneembare resolutie is afhankelijk van de cameralens, ~ 10 pm in dit geval. De waarneembare beperking van de monsterdikte, Ay, afhankelijk was van de maximale lichtintensiteit van de lamp, ~ 10 mm in dit geval.

Het voordeel van d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
sacran	Green Science Materials Inc., Japan		Van Aphanothece sacrum. Mw = 1,9 × 107 g mol-1
xanthaangom	Taiyo Kagaku Co., Japan	Neosoft XC	Van Xanthomonas campestris. Mw = 4,7 × 106 g mol-1
tubuline	Cytoskeleton, Inc., USA	T240	Van varkenshersenen.
GpCpp	Jena Bioscience, Germany	NU405L
piperazine-N,N′-bis(2-ethaansulfonzuur)	Sigma-Aldrichi, Co. LLC.	P6757-500G	PIPES
ethyleenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur	Dojindo Molecular Technologies, Inc.	342-01314	EGTA
MgCl2-6H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	135-15055
KOH	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	162-21813	pellet
DNA	Sigma-Aldrich, Co. LLC.	D1626	Van zalmtestikels. Mw = 1,3 × 106 Da (~2.000 bp)
Tris-EDTA-bufferoplossing	Sigma-Aldrich, Co. LLC.	T9285-100ML	10 mM Tris, pH 8,0, met 1 mM EDTA
glasplaat	Matsunami Glass Ind., Ltd., Japan	S1111
siliciumrubberblad	Asone Co.	6-611-32	Dikt: 1 mm
centrifuge	Beckman-Coulter, Inc., USA	Avanti J-25	uitgerust met een JA-20 rotor
lichtbron	Sumita Optical Glass, Inc., Japan	LS-LHA
lichtgeleider	Sumita Optical Glass, Inc., Japan	GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)	80 mm × 80 mm
halogeenlamp	Ushio Inc., Japan	JCR 15V150WBN
houder	Sigmakoki, Co.,Ltd.	KMH-80
monsterfase	Sigmakoki, Co.,Ltd.	TARW-25503L
monsterhouder	Sigmakoki, Co.,Ltd.	SHA-25RO
stang	Sigmakoki, Co.,Ltd.	ROU-12-40
postshouder	Sigmakoki, Co.,Ltd.	RS-6-40
postshouder	Sigmakoki, Co.,Ltd.	RS-12-60
postshouder	Sigmakoki, Co.,Ltd.	RS-12-80
postshouder	Sigmakoki, Co.,Ltd.	RS-12-130
drager	Sigmakoki, Co.,Ltd.	CAA-25LS
camerahouder	Sigmakoki, Co.,Ltd.	CMH-2
gemiddelde optische rail	Sigmakoki, Co.,Ltd.	OBA-500SH
lensbuis	Tomytech, BORG	lensbuis BK	80φ, L25 mm
lensbuis	Tomytech, BORG	lensbuis BK	80φ, L50 mm
multiband	Tomytech, BORG		80φ
V-plaat	Tomytech, BORG	V-plaat 60S
plaathouder	Viexen, Co.,Ltd.	plaathouder SX
EOS Kiss X7i	Canon Inc., Japan	8594B001	met een standaardzoomlens,  EFP 18-55 mm
fotografische software	Canon Inc., Japan	EOS Utility
PC	Microsoft	Surface
polarisatiemicroscoop	Olympus	BX51
retardatieplaat van de eerste orde	Olympus	U-TP530	λ = 530 nm
CCD-camera	Olympus	DP80
fotografische software	Olympus	cellSens Standard
Java-gebaseerd beeldverwerkingsprogramma	the National Institutes of Health	ImageJ