Cell Lineage Analyses en Gene Function studies met Twin-spot MARCM

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor een mozaïek labeling techniek die de visualisatie van neuronen afgeleid van een gemeenschappelijke voorlopercel in twee verschillende kleuren mogelijk maakt. Dit vergemakkelijkt neurale stam analyse met de mogelijkheid van geboorte uit individuele neuronen en studeren genfunctie in dezelfde neuronen verschillende individuen.

Samenvatting

M osaic bestudeert de analyse met een r epressible c ell m Arker (MARCM) is een positief mozaïek etikettering systeem dat op grote schaal in Drosophila neurobiologische studies heeft toegepast op ingewikkelde morfologie verbeelden en om de functie van genen in subsets van neuronen in anderszins ongemarkeerde en onverstoorbaar te manipuleren organismen. Genetische mozaïeken gegenereerd in het systeem MARCM uitgeoefend via plaatsspecifieke recombinatie tussen homologe chromosomen in delende voorlopercellen zowel gemerkt (MARCM klonen) en ongemarkeerde dochter cellen tijdens mitose. Een uitbreiding van de MARCM methode, genaamd tweeling ter plaatse MARCM (tsMARCM), label beide twee cellen afkomstig van een gemeenschappelijke voorouder met twee verschillende kleuren. Deze techniek werd ontwikkeld voor het opvragen van nuttige informatie van beide hemi-lineages inschakelen. Door uitvoerig analyseren van verschillende paren tsMARCM klonen, het tsMARCM systeem maakt hoge-resolutie neurale afkomst mapping om de exacte geboorte-orde van de gelabelde neuronen geproduceerd uit gemeenschappelijke voorlopercellen te onthullen. Bovendien is het systeem tsMARCM zich ook genfunctie studies door toe de fenotypische analyse van identieke neuronen van verschillende dieren. Hier beschrijven we hoe u de tsMARCM systeem om studies van de ontwikkeling van het zenuwstelsel in Drosophila bevorderen toe te passen.

Inleiding

De hersenen, bestaande uit een groot aantal en verschillende soorten neuronen, begiftigt dieren de mogelijkheid om waar te nemen, te verwerken en te reageren op de uitdagingen van de buitenwereld. Neuronen van de volwassen Drosophila centrale hersenen zijn afgeleid van een beperkt aantal neurale stamcellen, genaamd neuroblasts (AI), tijdens de ontwikkeling ^{1, 2.} Het grootste deel van de AI's die deelnemen aan de hersenen neurogenese in Drosophila ondergaan asymmetrische divisie zelf-vernieuwing NBs en ganglion moeder cellen (GMC's) te genereren, en de GMC ga dan via een andere ronde van de divisie twee dochter cellen die differentiëren tot neuronen ³ te produceren (Figuur 1A ). Vanwege de complexiteit van neuronale morfologie en de uitdagingen in verband met het identificeren van specifieke neuronen, een positieve mozaïek labeling technologie, mozaïek analyse met een onderdrukbare cel marker (MARCM), werd uitgevonden om het mogelijk te maken visualization van een enkel neuron of een klein deel van neuronen uit van de bevolking van de omgeving, niet-gemerkte neuronen ^4.

MARCM gebruikt de flippase (FLP) / FLP beeldherkenning (FRT) systeem plaatsspecifieke recombinatie tussen homologe chromosomen bemiddelen bij een scheidslijn voorlopercel die een heterozygote allel van een repressor gen, waarvan de expressie normaal remt de expressie van een reportergen ^4. Na de mitotische deling, worden de recombinante chromosomen gescheiden in twee cellen, zodanig dat één cel homozygote allelen van het repressor-gen en de andere cel geen repressor gen de expressie van het in die cel (en de nakomelingen) niet langer ⁴ geblokkeerd. Drie klonen patronen zijn meestal te vinden in een MARCM experiment wanneer FLP stochastisch wordt geïnduceerd in NBs of GMC's: single-cell en twee-cell-GMC-klonen, die neuronale morfologie bij single-cell resolutio verbeeldenn en meercellige NB-klonen, die volledige morfologische patronen van neuronen afgeleid van een gemeenschappelijke NB (Figuur 1B) tonen. De MARCM techniek is op grote schaal toegepast in Drosophila neurobiologische studies, waaronder in neuronale typeaanduiding voor het reconstrueren van brain-breed bedrading netwerken, neurale afkomst analyses voor de openbaarmaking van de ontwikkelingsgeschiedenis van neuronen, fenotypische karakterisatie van genfuncties betrokken bij het lot van de cel specificatie en neuronale morfogenese en differentiatie studies ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Omdat conventionele MARCM alleen etiketten één van de twee dochtercellen (en lijnen) na de geïnduceerde mitotische recombinatie evenement wordt mogelijk nuttige informatie uit de vrijstaande kant verloren. Deze beperking verzet tegen de toepassing van de fundamentele MARCM systeem om hoge-resolutie analyse van de vele neurale geslachten die cel lot te schakelen in snel tempo of precisie analyses van gen functies in dezelfde neuronen van verschillende dieren ^{11, 12.}

Twin-spot MARCM (tsMARCM) is een geavanceerd systeem dat neuronen afkomstig uit een gemeenschappelijke voorouder met twee verschillende kleuren etiketten, waarbij de terugwinning van nuttige informatie uit beide zijden van de twee cellen mogelijk maakt, waardoor de beperking van het oorspronkelijke MARCM systeem ¹¹ (overwinnen Figuur 2A - 2C). In het tsMARCM systeem, twee RNA interferentie (RNAi) gebaseerde dempers liggen op trans-plaatsen van homologe chromosomen in een voorlopercel en de expressie van de suppressors de expressie van hun respectieve reporters (figuur 2B) onafhankelijk remmen. Naar aanleiding van site-specific mitotische recombinatie gemedieerd door de FLP / FRT-systeem, de two RNAi-gebaseerde suppressors worden gescheiden in twee cellen om de expressie van verschillende reporters (figuur 2B) toe. Twee klonale patronen, eencellige geassocieerd met eencellige klonen en twee cel-GMC geassocieerd met meercellige NB-klonen, worden typisch gezien in een tsMARCM experiment (figuur 2C). Informatie afkomstig van de ene kant van de twee cellen kan worden gebruikt als referentie voor de andere zijde, waardoor een hoge-resolutie neurale stam analyses, zoals geboorte uit het gemerkte neuronen en fenotypische analyses van dezelfde neuronen verschillende dieren nauwkeurig onderzoek van neurale genfunctie ^{11, 12.} Hier presenteren we een stap-voor-stap protocol beschrijft hoe een tsMARCM experiment, dat door andere laboratoria kunnen worden gebruikt om hun onderzoek van neurale ontwikkeling verbreden voeren (alsook de ontwikkeling van andere weefsels, indien van toepassing) in Drosophila.

Protocol

1. Build tsMARCM-ready Vliegen met de juiste transgenen ^{11, 13}

1. Genereer de originele versie van tsMARCM-ready vliegt van transgenen die worden gedragen door de individuele vliegen ¹¹ (zie tabel 1). Gedrag standaard fly genetische kruising regelingen, die eerder zijn beschreven, door de invoering van meerdere transgenen in dezelfde fly voorraden ^13.
   1. In één ouderlijn Monteer de transgenen van FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (de eerste reporter, mCD8 :: GFP, expressie van het transgen onder de controle van de stroomopwaartse activeringssequentie promoter, die een membraan-gebonden reporter produceert van muis CD-merker 8-eiwit gefuseerd met groen fluorescent eiwit) en UAS-rCD2RNAi (de suppressor dat de expressie van de tweede reporter afremt, RNAi tegen de expressie van rat cluster of differentiatie 2, rcd2) op de linkerarm van de ^2e chromosoom. Plaats weefsel-specifieke -GAL4 driver op de X of ^3e chromosoom, indien mogelijk.
   2. In de andere ouderlijke lijn, vergadert de transgenen van FRT ^40A, UAS-rCD2 :: RFP (de tweede verslaggever, rCD2 :: RFP, de andere membraan-tethered reporter bestaande uit rCD2 eiwit gefuseerd met rood fluorescerend eiwit), en UAS-GFPRNAi (de suppressor dat de expressie van mCD8 :: GFP afremt, RNAi tegen de expressie van GFP) op de linkerarm van de ^2e chromosoom. Plaats heat-shock (hs) -FLP of weefsel-specificiteit FLP op de X of ^3e chromosoom, indien mogelijk.
2. Genereer de nieuwe versie van tsMARCM-ready vliegt van transgenen die worden gedragen door de individuele vliegen ¹⁴ (zie tabel 1). Gedrag standaard fly genetische kruising regelingen, die zijn beschreven previously, door de invoering van meerdere transgenen in dezelfde fly voorraden ^13.
   1. In één ouderlijke lijn, vergadert de transgenen van een FRT-plaats en UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (een gecombineerde transgene van mCD8 :: GFP en de suppressor dat de expressie van rCD2 :: RFP remt) samen in dezelfde arm van de ^2e of ^3e chromosoom (passend paar van FRT transgenen en UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i zijn weergegeven in tabel 1). Plaats weefselspecifieke-GAL4 driver uitzondering het chromosoom van de gekozen FRT-plaats, indien mogelijk chromosomen.
   2. In de andere ouderlijke lijn, vergadert de transgenen van een FRT-plaats en UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (de andere gecombineerde transgene van rCD2 :: RFP en de suppressor dat de expressie van mCD8 :: GFP remt) in dezelfde arm van de 2 ^e of 3 ^e chromosoom (passende paren van transgenen van FRT en UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi zijn aangegeven in tabel 1). Plaats hs-FLP of weefselspecifieke-FLP uitzondering van het chromosoom van de gekozen FRT-plaats, indien mogelijk chromosomen.

2. Cross tsMARCM-ready Flies te genereren tsMARCM Clones in hun nageslacht

1. Cross tsMARCM-ready vliegen elkaar (bv, zet 10-15 mannelijke vliegen vanaf stap 1.1.1 of 1.2.1 en 20-30 maagdelijke vrouwelijke vliegt vanaf stap 1.1.2 of 1.2.2 samen) in een fly-food flacon met verse Ambachtelijk gist plakken op de muur van de flacon.
2. Handhaaf de gekruiste tsMARCM ready vliegen bij 25 ° C gedurende 2 dagen om de kans op paring verbeteren voor het verzamelen van bevruchte eieren.
3. Vaak dragen de gekruiste tsMARCM-ready vliegen in vers gegist flesjes om te voorkomen dat verdringing (tik naar beneden de vliegen of gebruik maken van kooldioxide om de vliegen verdoven om de overdracht te vergemakkelijken, houden niet meer dan 80-100 bevruchte eieren in een 10 ml fly-food vial te veel larven te voorkomen).
4. Cultuur tsMARCM dieren (bijvoorbeeld bevruchte eieren, een voorbeeld van het genotype van tsMARCM dieren, zoals in figuur 3, is hs-FLP ^[22], w / w, UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^40A GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A, +, +) die in de serieel overgedragen flesjes gelegd bij 25 ° C totdat zij ontwikkelen om de gewenste fasen (bijvoorbeeld embryo's, larven, of poppen).
5. Plaats de overgedragen flacons die tsMARCM dieren in hetzelfde ontwikkelingsstadium bevatten een 37 ° C waterbad gedurende 10, 20, 30, 40 en 50 min naar het optimale tijdstip van warmte-schok die de expressie van FLP induceert het gegenereerd moet worden tsMARCM klonen van belang. Sla deze stap over als weefsel-specificiteit FLP wordt gebruikt in de tsMARCM experiment (hs-FLP heeft de voorkeur voor neurale lineage analyses; de redenen voor deze voorkeur zijn eerder beschreven ¹⁵).
   OPMERKING: Herhaal stap 2.5 met behulp van de optimale tijd van heat-shock in de toekomst tsMARCM experimenten als meer tsMARCM klonen van belang worden gezocht; over het algemeen is er meer FLP expressie geïnduceerd in hs-FLP ^[22] in vergelijking met hs-FLP ^[1] met dezelfde heat-shock tijd.
6. De cultuur van de warmte geschokt tsMARCM dieren bij 25 ° C totdat ze de juiste ontwikkelingsstadium bereikt, en ga dan naar stap 3.

3. Bereid, Vlek, en Mount Fly Brains bevattende tsMARCM Clones

1. Bereid pincet-bescherming gerechten. Meng deel A (30 g) en deel B (3 g) van het Silicone Elastomer kit met geactiveerde kool (0,25 g). Giet het mengsel in de juiste gerechten.
2. Ontleden larven, popstadium of adulte hersenen van de tsMARCM dieren 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van pincet op een forceps-bescherming schotel gezien door een dissectie microscoop. LET OP: Een protocol voor vlieg hersenen dissectie is desc geweestribed eerder ^16.
3. Bevestig de vlieg hersenen op een glazen plaat plek met 1x PBS met 4% formaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Verwerk de vlieg hersenen in dit glas plek plaat voor de rest van de stappen.
4. Spoel de vlieg hersenen drie maal met 1% PBT (1x PBS bevattende 1% Triton X-100) en was ze drie keer gedurende 30 min elk in 1% PBT (spoelen: verwijder PBT en nieuw PBT snel toevoegen, wassen, verwijderen PBT, voeg nieuwe PBT en incubeer de vlieg hersenen in de nieuwe PBT met behulp van een rondschudapparaat).
5. Incubeer de vlieg hersenen met het mengsel van primaire antilichamen gedurende de nacht bij 4 ° C of 4 uur bij kamertemperatuur geroerd. Een voorbeeld van het mengsel van primaire antilichamen rat anti-CD8 antilichaam (1: 100), konijn anti-DsRed antilichaam (1: 800) en muis anti-Bruchpilot (Brp) antilichaam (1:50) in 1% PBT met 5% normaal geit serum (NGS).
6. Spoel de vlieg hersenen drie keer met 1% PBT, en dan was ze drie keer voor 30 minuten elk met 1% PBT.
7. Incubeer de vlieg hersenen met het mengsel van secundaire antilichamen gedurende de nacht bij 4 ° C of 4 uur bij kamertemperatuur geroerd. Een voorbeeld van het mengsel van secundaire antilichamen geit anti-rat IgG antilichaam geconjugeerd met groene fluorescerende kleurstof (1: 800), geit anti-konijn IgG antilichaam geconjugeerd met geel-fluorescerende kleurstof (1: 800) en geit anti-muis IgG antilichaam geconjugeerd met ver-rood-fluorescerende kleurstof (1: 800) in 1% PBT met 5% NGS.
8. Spoel de vlieg hersenen drie keer met 1% PBT, en dan was ze drie keer voor 30 minuten elk met 1% PBT. Brengen ze op een micro dia met een anti-quenching reagens. Zet een micro dekglas op de micro dia te dekken en de bescherming van de vlieg hersenen. Sluit de randen van de micro dekglas en micro dia met behulp van duidelijke nagellak. Bewaar deze gemonteerd en afgedicht hersenen exemplaren vliegen bij 4 ° C.

4. Neem, Process, en analyseren Fluorescent Beelden van tsMARCM Clones

1. Capture fluorescerende beelden van tsMARCM klonen frOM de monsters gemaakt in stap 3.8 met behulp van de confocale microscopie systeem van uw keuze.
2. Project stapels tsMARCM confocale fluorescente afbeeldingen in tweedimensionale afgevlakte beelden gebruiken met confocale microscopie gekozen systeem geleverd beeldverwerkingssoftware (zie figuur 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O en 3Q - 3T voorbeelden van afgeplatte confocale fluorescente beelden).
3. Tel het aantal cellen van meercellige-NB zijden van de tsMARCM klonen met een geschikte beeldverwerking software (bijvoorbeeld de functie "Cell Counter" in ImageJ ^17, zie figuur 3E, 3J, 3O en 3T voorbeelden van de cel organen van neuronen).

Resultaten

Het tsMARCM systeem is gebruikt om neurale lineage analyses en genfunctie studies vergemakkelijkt door het ophalen van belangrijke informatie over neuronen afgeleid van gemeenschappelijke NBs. Het systeem is gebruikt om de meeste (zo niet alle) neurontypen zijn en stelt het aantal cellen per neuronale typen en gaat na geboorte-volgorde van deze neuronen ^{11, 12, 18} (zie de bespreking voor...

Discussie

Kritische stappen in het protocol

Stappen 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 en 3.2 zijn van cruciaal belang voor het verkrijgen van goede tsMARCM resultaten. Weefsel-specifieke -GAL4 drivers die niet GAL4 in neurale voorlopers tot expressie brengen hebben de voorkeur voor de stappen 1.1.1 en 1.2.1. Vermijd overbevolking van de dieren gekweekt in de fly-food flesjes in stap 2.3. Omdat de inductie latentie, het expressieniveau van FLP upon heat-shock en de gemiddelde verdelen tijdstip van neurale v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Koolstofdioxide (CO2)	Lokale leverancier	n.v.t.	Verdoven vliegen
CO2-pad	Lokale leverancier	n.v.t.	Sorteer, kruis en zet vliegen over
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (of andere leveranciers)	PBS001	Dissect, spoel, was en immunokleuring van vliegenhersenen
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fixeer vliegenhersenen
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Spoel, was en immunokleuring van vliegenhersenen
Normaal geit	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunokleuring van vliegenhersenen
serum
Ratten anti-muis CD8-antilichaam	Invitrogen	MCD0800	Immunokleuring van vliegenhersenen
Konijn anti-DsRed-antilichaam	Clonetech	632496	Immunokleuring van vliegenhersenen
Muis anti-Brp-antilichaam	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunokleuring van vliegenhersenen
Geit anti-ratten IgG-antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunokleuring van vliegenhersenen
Geit anti-konijn IgG-antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunokleuring van vliegenhersenen
Geit anti-muis IgG-antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunokleuring van vliegenhersenen
SlowFade gold antifade-reagens	Molecular Probes	S36936	Monteer vliegenhersenen en bescherm tegen fluorescerende quenching
PYREX 9 depressieglas stipjesplaat	Corning	7220-85	Dissect, spoel, was en immunokleuring van vliegenhersenen
Sylgard 184 siliconenelastomeerkit	World Precision Instruments	SYLG184	Maak zwarte Sylgard-schalen om de pincetten tijdens hersendissectie te beschermen
Geactiveerde houtskool	Sigma-Aldrich	242276-250G	Maak zwarte Sylgard-schalen
Dumont #5 pincet	Fine Science Tools	11252-30	Dissect en monteer vliegenhersenen
Micro-glijplaat	Corning	2948-75x25	Monteer vliegenhersenen
Micro dekglas nr. 1.5	VWR International	48366-205	Monteer vliegenhersenen
Nailpolish	Lokale leverancier	niet beschikbaar	Versiegel micro dekglas op micro glijplaten
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	Kweek vliegen bij 25 & deg; C
(of andere leveranciers)
Waterbad	Kansin Instruments	WB212-B2	Induceer hitteschok bij vliegen bij 37 & deg; C
(of andere leveranciers)
Orbitaal schudder	Kansin Instruments	OS701	Was en immunokleuring van vliegenhersenen
(of andere leveranciers)
Dissectiemicroscoop	Leica	EZ4	Sorteer, kruis en zet vliegen over; Dissect, spoel, was en immunokleuring van vliegenhersenen
Confocale microscoop	Zeiss (of andere leveranciers)	LSM 700 (of andere modellen)	Beeld tsMARCM-klonen
beeldverwerkingssoftware 1 (bijv., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	niet beschikbaar	Projecteer stacks van confocale beelden
beeldverwerkingssoftware 2 (bijv., ImageJ)	niet beschikbaar	niet beschikbaar	Tel het aantal cellen van tsMARCM-klonen