De hier beschreven protocollen maken de studie van de elektrische eigenschappen van prikkelbare cellen mogelijk in de meest niet-invasieve fysiologische omstandigheden door het gebruik van zebravis-embryo's in een in vivo systeem, samen met een op fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde, genetisch gecodeerde spanningsindicator (GEVI) die selectief wordt tot expressie gebracht in het celtype van belang.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Biosensing Motor Neuron Membraan Potentieel in Live Zebrafish Embryo's
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De hier beschreven protocollen zijn ontworpen om onderzoekers in staat te stellen celcommunicatie te bestuderen zonder de integriteit van de omgeving waarin de cellen zich bevinden te veranderen. Specifiek zijn ze ontwikkeld om de elektrische activiteit van prikkelbare cellen, zoals spinale neuronen, te analyseren. In een dergelijk scenario is het van cruciaal belang om de integriteit van de spinale cel te behouden, maar het is ook belangrijk om de anatomie en fysiologische vorm van de betrokken systemen te behouden. Inderdaad, het begrip van de manier waarop het zenuwstelsel - en andere complexe systemen - werkt, moet gebaseerd zijn op een systemische aanpak. Om deze reden is het levende zebravis-embryo gekozen als modelsysteem, en werden de spanningsveranderingen van het membraan van het spinale neuron geëvalueerd zonder de fysiologische omstandigheden van de embryo's te verstoren.
Hier wordt een aanpak beschreven die het gebruik van zebravis-embryo's combineert met een FRET-gebaseerde biosensor. Zebravis-embryo's worden gekenmerkt door een zeer vereenvoudigd zenuwstelsel en zijn bijzonder geschikt voor beeldvormingstoepassingen dankzij hun transparantie, waardoor het gebruik van fluorescentie-gebaseerde spanningsindicatoren op het plasmamembraan mogelijk is tijdens de ontwikkeling van de zebravis. De synergie tussen deze twee componenten maakt het mogelijk om de elektrische activiteit van de cellen in intacte levende organismen te analyseren, zonder de fysiologische toestand te verstoren. Ten slotte kan deze niet-invasieve aanpak naast andere analyses bestaan (bijv. opnames van spontane bewegingen, zoals hier getoond).
Inleiding
In vivo systeemanalyse analyse maakt wetenschappers in staat om cellulaire gedrag op de meest betrouwbare manier te onderzoeken. Dit is vooral waar wanneer de onderzochte activiteit sterk beïnvloed wordt door cel-cel interacties (zowel contact- als niet-contactafhankelijk), zoals in het zenuwstelsel, waarbij membraanspanning verandert de communicatie onder excitabele cellen. Het begrip van de informatie die door deze elektrische signalen wordt gecodeerd, is de sleutel tot het begrijpen van de manier waarop het zenuwstelsel in zowel fysiologische als ziektestaten werkt.
Om cellulaire elektrische eigenschappen te bestuderen in de meest niet-invasieve fysiologische omstandigheden, zijn verscheidene genetisch gecodeerde spanningsindicatoren recentelijk ontwikkeld 1 . In tegenstelling tot de vorige generaties optische spanningsensoren (voornamelijk spanningsgevoelige kleurstoffen) 2 , bieden GEVI's in vivo analyses van het intacte neurale systeem enHun expressie kan worden beperkt tot specifieke celtypen of populaties.
Het embryo van de zebravis is het in vivo "substraat" van de keuze om te profiteren van het grote potentieel dat aan GEVI's wordt toegeschreven. Dankzij zijn optische helderheid en zijn vereenvoudigde, maar evolutionair geconserveerde zenuwstelsel, maakt het zebravismodel de identificatie en manipulatie van elke cellulaire component in een netwerk eenvoudig. De werkgelegenheid van de FRV-GEVI-zeemeermin 3 leidde immers tot het identificeren van pre-symptomatische veranderingen in het spinale motorische neurongedrag in een zebravismodel van amyotrofe laterale sclerose (ALS) 4 .
Het volgende in vivo protocol beschrijft hoe de elektrische eigenschappen van spinale motorische neuronen in intacte zebravis embryo's op een neuronale manier worden uitgedrukt. Bovendien toont het aan hoe farmacologisch geïnduceerde chanGes in dergelijke elektrische eigenschappen kan worden geassocieerd met veranderingen in de frequentie van embryonale spontane spoelingen, de stereotype motorische activiteit die het bewegingsgedrag van de zebravis in zeer vroege ontwikkelingsstadia kenmerkt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. pHuC_Mermaid Plasmid Generation
OPMERKING: Zeemeermin is een biosensor die is ontwikkeld door het spanningswaarnemende domein (VSD) van de Ciona intestinalis te koppelen (nu Ciona robusta ) 5 spanningssensor die fosfatase (Ci-VSP) bevat met de FRET-partner fluorophoren Umi-Kinoko Green (mUKG: donor) en een monomere versie van het oranje-emitterende fluorescerende eiwit Kusabira Orange (mKOk: acceptor). Voor deze biosensor verhogen conformiteitsveranderingen van het VSD-domein, geïnduceerd door membraan depolarisatie, de nabijheid van de donor- en acceptor fluorescerende eiwitten, waardoor de energieoverdracht tussen hen wordt verhoogd (de FRET Ratio) 3 verhogen. De VSD verzekert de efficiënte lokalisatie van de biosensor bij het plasmamembraan. De neuronale expressie van de biosensor (in het ruggenmerg, het signaal is detecteerbaar in zowel interneuronen als motorneuronen) wordt bereikt door de Zeemeermin op te klonenEn leesframe (ORF) onder de zebravis pan-neurale promotor HuC 6 .
- Versterk met behulp van de T3 Universal primer en de Mermaid Sma I primer (5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) door polymerase kettingreactie (PCR) de Mermaid ORF van het pCS4 + Mermaid plasmide 3 met Pfu (proofreading) DNA polymerase om een Sma I restrictie plaats in de stroomopwaartse stroom Van de zeemeermin ORF.
- Gebruik het volgende PCR mengsel: 0,5 μL Pfu DNA polymerase, 7,5 μl van de specifieke 10x buffer, 1 μl 10 mM dNTPs, 2,5 μl dimethylsulfoxide (DMSO), 0,5 μL (50 ng) van de plasmide bereiding en 1 ΜL 20 μM voorraadoplossingen van elke primer in een totaal volume van 50 μl.
- Verhit het PCR-mengsel gedurende 15 s bij 95 ° C, prikkel het gedurende 15 s bij 50 ° C en verleng het gedurende 4 minuten bij 72 ° C gedurende een totaal van 35 cycli.
- Gel-zuiveren de specifieke stompePCR-product met een commercieel gelzuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant.
- Kloneer het DNA-fragment in de pCMV-SC stompe vector volgens het protocol van de fabrikant.
- Lineariseer het zeemeermin-positieve plasmide (genaamd pCMV-SC_Mermaid) met het Sma I-restrictie-enzym voor de volgende invoeging van de HuC-promotor.
- Stel de restrictie-reactie als volgt in: 0,5 μL (10 U) van Sma I-restrictie-enzym, 2 μl van de kit 10x buffer en 5 μg plasmide-DNA in een totaal volume van 20 μl. Incubeer de reactie bij 25 ° C gedurende 1 uur.
- Gel-zuiveren het verteerde plasmide met behulp van een commerciële gelzuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant.
- PCR-amplificeer de HuC-promotor (pHuC), met Pfu DNA-polymerase en zebravis genomisch DNA als sjabloon, met behulp van een paar HuC-specifieke primers (HuCprom-forw1_SalI: 5'-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA en HuCproM-rev1: 5'-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) en strekt zich uit op een gebied van 3,150-bp stroomopwaarts van de ATG.
- Stel het PCR-mengsel op met behulp van de volgende schema: 0,5 μl Pfu DNA-polymerase, 7,5 μl van de specifieke 10x buffer, 1 μl 10 mM dNTPs, 2,5 μl DMSO, 200 ng genomisch DNA en 1 μl 20 μM Voorraadoplossingen van elke primer in een totaal volume van 50 μl.
- Na een eerste stap van 2 minuten bij 95 ° C verwarm het PCR-mengsel gedurende 15 s bij 95 ° C, prikkel het gedurende 15 s bij 50 ° C en verleng het gedurende 4 minuten bij 72 ° C gedurende een totaal van 35 cycli .
- Gel-zuiveren het specifieke stompe PCR-product met behulp van een commerciële gelzuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant.
- Ligereer een equimolaire hoeveelheid van de gezuiverde pCMV-SC_Mermaid (stap 1.5) en het pHuC-DNA (stap 1.7) onder gebruikmaking van 1 μl T4 DNA-ligase en 1 μl van de specifieke 10X buffer in een totaal volume van 10 μl. Incubeer de reactie gedurende 16 uur bij4 ° C.
- Transformeer een aliquot van bevoegde cellen met 5 μl van de ligatie-reactie (stap 1.8) volgens de instructies van de fabrikant.
- Selecteer de pHuC-positieve klonen (pHuC_Mermaid) met de promotor die in de juiste oriëntatie is ingebracht door een dubbele verdeling van Sal I- Eco RV (de Sal I-restrictieplaats is stroomopwaarts van het promotorfragment in stap 1.6 ingevoegd, terwijl de Eco RV restrictieplaats Is stroomafwaarts geplaatst van het polyadenyleringsgebied, PolyA, van het plasmide pCMV-SC).
- Stel de restrictie-reactie als volgt in: 0,5 μL (10 U) van zowel Sal I als Eco RV restrictie enzymen, 2 μl van de kit10X buffer en 1 μg pHuC_Mermaid DNA in een totaal volume van 20 μl. Incubeer de reactie gedurende 1 uur bij 37 ° C. Breng de reacties op een agarosegel.
2. Embryo Microinjectie
- Vervoer de bevruchte bvGs verkregen uit wildtype (AB-stam) of Sod1-G93R volwassen zebravis 4 op een 10 mm petrischaal met behulp van een plastic pipet.
- Spoel de embryo's in koud (4 ° C) viswater en meng ze onmiddellijk in de dooier met 200 pg pHuC_Mermaid plasmide met behulp van een microinjector (voor een algehele en gedetailleerde beschrijving van de microinjectie procedure, zie Referenties 7 en 8).
- Met behulp van een plastic pipet, verplaats de embryo's naar een Petri-schotel en incubeer ze in viswater bij 28 ° C tot ze de gewenste ontwikkelingsfase (20-24 uur na bevruchting, hpf) bereiken voor de volgende analyses.
3. Spontane Tail Coiling Analysis
OPMERKING: Evalueer het spontane staartwisselingsgedrag in 20-24 pkf embryo's met of zonder de drug riluzole.
- Breng een embryo over op een 90 mm ronde Petri-schaal, gevuld met viswater dat 0,2% DMSO bevat (riluzole voertuig) en handmatig deksioneren met twO juwelierspinnen met scherpe tips. Incubeer het embryo gedurende 5 minuten.
- Ontdek de staartcoiling bij RT tijdens een 1 minuten videorecorder met behulp van een digitale camera die op een stereomicroscoop is gemonteerd. Verkrijg tijdsreeks bij een tijdresolutie van 30 frames / s.
- Bereken de frequentie van spontane staartspoelen door het aantal bochten (zowel contralaterale als ipsilaterale) per tijdseenheid te tellen.
- Om het effect van het geneesmiddel riluzole te evalueren, gebruikt u een plastic Pasteur pipette voorzichtig om het embryo over te brengen naar een nieuwe 90 mm Petri-schaal, gevuld met viswater dat 5 μM riluzole bevat.
- Incubeer het embryo gedurende 5 minuten voordat u een 1-min-video opneemt en de gedragsanalyse uitvoert zoals hierboven.
4. Imaging Setup voor Mermaid Biosensor Visualisatie in Living Embryo's: Simultaneous Detection of Donor and Acceptor Signals
- Monteer de 20-24 pk embryo's in 1% laagsmeltpunt agarose in viswater bij37 ° C in een 35 mm glazen bodem beeldschotel. Richt de embryo's aan hun zijden. Wacht tot de agarose bij kamertemperatuur stoomt.
- Verplaats de beeldschotel naar het stadium van een omgekeerde confocal die op een omgekeerde microscoop is gemonteerd. Identificeer motorische neuronen die de biosensor uitdrukken met een 20X-doelstelling (0,7 numerieke diafragma, NA) door de mUKG op te spannen met de 488 nm-argonlaserlijn en de emissie tussen 495 en 525 nm op te nemen.
- Voor een FRET-meting, exciteer mUKG, de donor van het FRET-paar, met de 488 nm laserlijn. Gelijktijdig detecteren, met een resonante scanner die actief is bij 8000 Hz in de bidirectionele modus, de fluorescentie die door de donor wordt uitgestoten (tussen 495 en 525 nm) en de fluorescentie die door de mKOk-acceptor wordt afgegeven (tussen 550 en 650 nm, FRET-kanaal). Indien beschikbaar, gebruik de 473 nm laser.
OPMERKING: De excitatie-efficiëntie van de donor zal licht verminderd worden (85% in plaats van 93% bij 488 nm), maar de kruis-excitatie van de acceptor zalEveneens verminderd (van 17% met de 488 nm tot 9% met 473 nm laserlijn). - Om de fototoxiciteit en het fluorofore bleken te verminderen, minimaliseer de belichting van het monster door de kracht van de laserlijn te verminderen (op het straalpadvenster van de acquisitie software).
- Optimaliseer de excitatie om winst- en compensatieparameters aan te passen die aan het begin van het experiment zijn ingesteld en constant blijven door de sessie. Om de offset in te stellen, wijzigt u de kleur van de afbeelding op intensiteitswaarden (met behulp van de Q-opzoektabel) en schuift u met de laser uit de offsetknop (slimme offset) zodat de achtergrondpixels een lichtintensiteit hebben Hoger dan nul. Met de zelfde opzoektafel, door de laser aan te zetten tijdens het scannen, draai dan de winstknop (slimme versterking) om de signaal-ruisverhouding te maximaliseren, zodat u verzadigde pixels vermijdt.
- Met behulp van een geopend pinhole (2 luchtige eenheden), verwerven u 16-bits beelden om een voldoende dynamisch bereik voor kwantitatief te biedenE analyses. Vermijd gemiddelde om de aanschafsnelheid te verhogen en om het fotobak te minimaliseren.
- In het venster voor het ophalen van software selecteert u een afbeeldingsveldgrootte van 512 x 64 pixels (pixelformaat: 605 nm) in de vervolgkeuzelijst.
- Selecteer in het acquisitiemodus venster xyt (tijdverloop op een enkel xy-vliegtuig) in het vervolgkeuzemenu en let op de veranderingen in de spiernervelspanning van het embryo door een enkel xy-vliegtuig te verwerven, waarbij de acquisitieparameters één beeld opnemen elke 30 Ms gedurende 1 min.
- Om het effect van riluzole toediening op membraan depolarisatie in hetzelfde neuron te evalueren, verwerven een nieuwe dataset 5 minuten na de toevoeging van viswater dat 5 μM riluzole bevat.
- Voor FRET analyse, gebruik de ImageJ macro Biosensor_FRET (expressie van single-chain FRET biosensors.
- Evalueer de basale membraan FRET verhouding van elke neuron bij t 1 als ((FRET gemiddelde - FRET achtergrond) / (Donor gemiddelde - Donor achtergrond)), waar FRET en DonOf gemiddelde intensiteit is de gemiddelde fluorescentie-intensiteit, berekend in dezelfde regio van belang (ROI), getekend rond de cel voor elk verkregen kanaal. FRET en Donor background zijn de gemiddelde fluorescentie-intensiteit berekend in een ROI van het zichtveld zonder het fluorescerende monster.
OPMERKING: een gedetailleerde stap-voor-stap beschrijving van het gebruik van de plugin vindt u op de website www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret . - Gebruik een grafische software om de frequentie, amplitude en duur van depolarisatie tussen verschillende experimentele paradigma's te vergelijken. Vergelijk twee groepen met behulp van een unpaired Student's t- test en let op gemiddelde waarden als statistisch verschillend wanneer P <0,05.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een expressievector die de FRET-gebaseerde zeemeermin biosensor coderende sequentie draagt onder de controle van de pHuC pan-neuronale promotor, die de synthese van het eiwit uitsluitend in het zenuwstelsel drijft, werd afgeleverd in enkelvoudige bevruchte eieren door middel van een microinjectie in Om transiente transgene embryo's te verkrijgen ( Figuur 1 , Linker paneel). Na het masteren van de microinjectietechniek was het percentage zeemeermi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hier gepresenteerde protocol liet ons de associatie tussen de elektrische eigenschappen van embryo-spinale motorische neuronen en de spontane coilgedrag, de vroegste stereotiepe motoractiviteit, ongeveer 17 pk. Van embryonale ontwikkeling verkennen en duurt tot 24 pkf 10 .
Onze aanpak biedt onderzoekers een instrument om het neurale systeem van intacte embryo's te bestuderen, waarbij de complexiteit van de interacties tussen cellen in een ontwikkelend function...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Simona Rodighiero bedanken voor haar onschatbare ondersteuning bij de FRET-beeldanalyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Low Melting Point Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 | |
| Pfu Ultra HQ DNA polymerase | Agilent Technologies - Stratagene Products Division | 600389 | |
| T3 Universal primer | Sigma-Aldrich | ||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system | Promega | A9280 | |
| Universal SmaI primer | Eurofins | ||
| StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector | Agilent Technologies - Stratagene Products Division | 240228 | |
| SmaI | New England Biolabs | R0141S | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| 35 mm, glass-bottomed imaging dish | Ibidi | 81151 | |
| forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | M10 F | |
| Digital camera | Leica Microsystems | DFC 310 FX | |
| Leica Application Suite 4.7.1 software | Leica Microsystems | ||
| QuickTime Player, v10.4 | Apple | ||
| Confocal microscope (inverted) | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| ImageJ macro Biosensor_FRET | |||
| GraphPad Prism 6.0c | GraphPad Software, Inc |
Referenties
- Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
- Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
- Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515(2016).
- Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879(2015).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, Suppl 1S7 (2007).
- Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566(2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
