De hier beschreven protocollen maken de studie van de elektrische eigenschappen van prikkelbare cellen mogelijk in de meest niet-invasieve fysiologische omstandigheden door het gebruik van zebravis-embryo's in een in vivo systeem, samen met een op fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde, genetisch gecodeerde spanningsindicator (GEVI) die selectief wordt tot expressie gebracht in het celtype van belang.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Biosensing Motor Neuron Membraan Potentieel in Live Zebrafish Embryo's
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De hier beschreven protocollen zijn ontworpen om onderzoekers in staat te stellen celcommunicatie te bestuderen zonder de integriteit van de omgeving waarin de cellen zich bevinden te veranderen. Specifiek zijn ze ontwikkeld om de elektrische activiteit van prikkelbare cellen, zoals spinale neuronen, te analyseren. In een dergelijk scenario is het van cruciaal belang om de integriteit van de spinale cel te behouden, maar het is ook belangrijk om de anatomie en fysiologische vorm van de betrokken systemen te behouden. Inderdaad, het begrip van de manier waarop het zenuwstelsel - en andere complexe systemen - werkt, moet gebaseerd zijn op een systemische aanpak. Om deze reden is het levende zebravis-embryo gekozen als modelsysteem, en werden de spanningsveranderingen van het membraan van het spinale neuron geëvalueerd zonder de fysiologische omstandigheden van de embryo's te verstoren.
Hier wordt een aanpak beschreven die het gebruik van zebravis-embryo's combineert met een FRET-gebaseerde biosensor. Zebravis-embryo's worden gekenmerkt door een zeer vereenvoudigd zenuwstelsel en zijn bijzonder geschikt voor beeldvormingstoepassingen dankzij hun transparantie, waardoor het gebruik van fluorescentie-gebaseerde spanningsindicatoren op het plasmamembraan mogelijk is tijdens de ontwikkeling van de zebravis. De synergie tussen deze twee componenten maakt het mogelijk om de elektrische activiteit van de cellen in intacte levende organismen te analyseren, zonder de fysiologische toestand te verstoren. Ten slotte kan deze niet-invasieve aanpak naast andere analyses bestaan (bijv. opnames van spontane bewegingen, zoals hier getoond).
Inleiding
In vivo systeemanalyse analyse maakt wetenschappers in staat om cellulaire gedrag op de meest betrouwbare manier te onderzoeken. Dit is vooral waar wanneer de onderzochte activiteit sterk beïnvloed wordt door cel-cel interacties (zowel contact- als niet-contactafhankelijk), zoals in het zenuwstelsel, waarbij membraanspanning verandert de communicatie onder excitabele cellen. Het begrip van de informatie die door deze elektrische signalen wordt gecodeerd, is de sleutel tot het begrijpen van de manier waarop het zenuwstelsel in zowel fysiologische als ziektestaten werkt.
Om cellulaire elektrische eigenschappen te bestuderen in de m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. pHuC_Mermaid Plasmid Generation
OPMERKING: Zeemeermin is een biosensor die is ontwikkeld door het spanningswaarnemende domein (VSD) van de Ciona intestinalis te koppelen (nu Ciona robusta ) 5 spanningssensor die fosfatase (Ci-VSP) bevat met de FRET-partner fluorophoren Umi-Kinoko Green (mUKG: donor) en een monomere versie van het oranje-emitterende fluorescerende eiwit Kusabira Orange (mKOk: acceptor). Voor deze biosensor verhogen conformiteitsveranderingen van het VSD-domein, geïnduceerd door membraan depolarisatie, de nabijheid van de donor- en acceptor fluorescerende eiwitten, waard....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een expressievector die de FRET-gebaseerde zeemeermin biosensor coderende sequentie draagt onder de controle van de pHuC pan-neuronale promotor, die de synthese van het eiwit uitsluitend in het zenuwstelsel drijft, werd afgeleverd in enkelvoudige bevruchte eieren door middel van een microinjectie in Om transiente transgene embryo's te verkrijgen ( Figuur 1 , Linker paneel). Na het masteren van de microinjectietechniek was het percentage zeemeermi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het hier gepresenteerde protocol liet ons de associatie tussen de elektrische eigenschappen van embryo-spinale motorische neuronen en de spontane coilgedrag, de vroegste stereotiepe motoractiviteit, ongeveer 17 pk. Van embryonale ontwikkeling verkennen en duurt tot 24 pkf 10 .
Onze aanpak biedt onderzoekers een instrument om het neurale systeem van intacte embryo's te bestuderen, waarbij de complexiteit van de interacties tussen cellen in een ontwikkelend function.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Simona Rodighiero bedanken voor haar onschatbare ondersteuning bij de FRET-beeldanalyse.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Low Melting Point Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 | |
| Pfu Ultra HQ DNA polymerase | Agilent Technologies - Stratagene Products Division | 600389 | |
| T3 Universal primer | Sigma-Aldrich | ||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system | Promega | A9280 | |
| Universal SmaI primer | Eurofins | ||
| StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector | Agilent Technologies - Stratagene Products Division | 240228 | |
| SmaI | New England Biolabs | R0141S | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| 35 mm, glass-bottomed imaging dish | Ibidi | 81151 | |
| forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | M10 F | |
| Digital camera | Leica Microsystems | DFC 310 FX | |
| Leica Application Suite 4.7.1 software | Leica Microsystems | ||
| QuickTime Player, v10.4 | Apple | ||
| Confocal microscope (inverted) | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| ImageJ macro Biosensor_FRET | |||
| GraphPad Prism 6.0c | GraphPad Software, Inc |
Referenties
- Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
- Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
