Terwijl infiltrerende macrofagen continu worden aangeworven op volwassen weefsels uit circulerende precursoren, zitten inwendige macrofagen hun weefsel tijdens ontwikkeling, waar ze worden gehandhaafd zonder verdere input van stamvaders. De voorlopers voor ingezette macrofagen werden recent geïdentificeerd. Hier presenteren wij methoden voor de genetische lotvorming van de ingezeten makrofage stamvaders.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Identificatie van Erythromyeloid Progenitors En Hun Nakomelingen In De Muis Embryo Door Flow Cytometry
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Macrofagen zijn professionele fagocyten uit de aangeboren arm van het immuunsysteem. In stabiele toestand worden sessiele macrofagen gevonden in volwassen weefsels waar ze fungeren als frontlinks van infectie en weefselschade. Terwijl andere immuuncellen voortdurend worden vernieuwd van hematopoietische stam- en stamcellen (HSPC) in het beenmerg, is een reeks macrofagen, bekend als inwendige macrofagen, aangetoond dat ze zelfstandig in weefsels zijn gehandhaafd zonder input van beenmerg HSPC's. Deze lijn wordt geïllustreerd door microglia in de hersenen, Kupffer cellen in de lever en Langerhans cellen in de epidermis onder anderen. De darm- en colon lamina propria zijn de enige volwassen weefsels zonder HSPC-onafhankelijke inwendige macrofagen. Recente onderzoeken hebben aangetoond dat inwendige macrofagen afkomstig zijn van de extra-embryonale dooierzak hematopoiesis van stamvader (e) die onderscheiden zijn van foetale hematopoietische stamcellen (HSC). Onder de dooierzak definitieve hematopoiesis, eRythromyeloïde stamvogens (EMP) veroorzaken zowel erythroid en myeloïde cellen, in het bijzonder inwendige macrofagen. EMP worden alleen gegenereerd binnen de dooierzak tussen de E8.5 en E10.5 dagen van ontwikkeling en ze migreren naar de foetale lever zodra de circulatie is verbonden, waar ze zich uitbreiden tot en met elkaar onderscheiden tot minstens E16.5. Hun nakomelingen omvatten erythrocyten, macrofagen, neutrofielen en mastcellen, maar alleen EMP-afgeleide macrofagen blijven tot volwassenheid in weefsels. De transiënte aard van EMP-opkomst en de tijdelijke overlap met HSC-generatie maakt de analyse van deze voorgangers moeilijk. We hebben een tamoxifen-induceerbaar loting protocol op basis van expressie van de macrofage cytokine receptor Csf1r promotor vastgesteld om EMP en afgeleide cellen in vivo door flowcytometrie te karakteriseren.
Inleiding
Er zijn verscheidene opeenvolgende maar overlappende golven van hematopoietische voorlopers tijdens de ontwikkeling waarvan de myeloïde nakomelingen in de volwassenheid blijven. Ten eerste komen unipotente "primitieve" stamvaders op in de muisbloemzak 1 , 2 tussen E7.5-E8.25 en geven aanleiding tot embryonale macrofagen zonder enig monocytisch intermediair. Of macrofagen afgeleid van primitieve stamvaders volharden in de volwassen hersenen, aangezien microglia een onderwerp blijft van actief onderzoek. Ten tweede ontstaan er erythro-myeloïde precursoren (EMP's) in de dooierzak op E8.5, de bloedbaan binnendringen en het embryo coloniseren. EMP's komen uit het geelogenische endothelium van de dooier in een Runx1-afhankelijke endotheel-naar-hematopoietische overgang 3 , 4 . Terwijl EMP kan onderscheiden in macrofagen binnen de dooierzak, koloniseren ze ook de foetale lever vanaf de embryonale dag (E) 9 5 en verschillenTiëren in erythrocyten, megakaryocyten, macrofagen, monocyten granulocyten en mastcellen 6 . De macrofagen die afkomstig zijn van EMP's vertoont proliferatieve capaciteit in ontwikkelings- en volwassen weefsels. Of EMP-afgeleide macrofagen het monocyt-stadium van differentiatie omzeilen, is nog steeds controversieel omdat er weinig bekend is over hun differentieringsroute 7 , 8 . Tenslotte verschijnen hematopoietische stamcellen (HSC's) op E10.5 binnen het embryo dat goed is van het aorta-gonad-mesonephros-gebied en migreert naar de foetale lever. HSC's met langetermijnreplopatiecapaciteit worden pas na E11 gedetecteerd (bij de 42 somite pair-fase) 9 . Daar worden ze uitgebreid en onderscheiden van E12.5 tot definitieve hematopoiesis begint te verschuiven naar het beenmerg, dat de overheersende plaats van bloedcelproductie wordt voor de duur van het postnatale leven 10 .
De spAtiale en temporele overlap in opkomst, evenals gedeelde immunofenotypische markers heeft tot dusver ons vermogen om de specifieke bijdragen van deze golven van embryonale hematopoietische stamvogens te onderscheiden, verholpen. Terwijl zowel EMP als HSC op een Runx1-afhankelijke manier worden gegenereerd en de transcriptiefactor Myb en de groeifactorreceptor Csf1r (Colony-Stimulerende Factor 1 Receptor, ook wel Macrophage Colony Stimulating Factor Receptor) onder andere, uiten, kunnen EMP's onderscheiden worden van HSC's door hun gebrek aan lymfoïde potentieel, zowel in vitro als in vivo , hun gebrek aan langdurig repopulatiepotentieel en gebrek aan oppervlakte-expressie van de afstamingsmarkering Sca- 11 . Genetische kaartvormingsmodellen zijn nodig om macrofage ontogenie te karakteriseren, omdat ze op een celspecifieke en tijdspecifieke manier gericht zijn op embryonale voorlopers. Hier presenteren we het protocol in het laboratorium dat in ons laboratorium wordt gebruikt om tussen de twee lijn te onderscheidenS van macrofagen gevonden in de meeste volwassen weefsels: HSC-afgeleide infiltrerende macrofagen en HSC-onafhankelijke inwendige macrofagen.
Weefsel-ingezette macrofagen zijn teruggevonden naar Myb-onafhankelijke precursorcellen die de cytokine-receptor Csf1r 12 uitdrukken en aanwezig zijn in het embryo bij E8.5-E10.5 met behulp van drie complementaire strategieën voor schematische strategieën 6 . Om de bloedsomloop hematopoiesis te bestuderen zonder het labelen van foetale HSC's, gebruiken we een transgene stam, Csf1r MeriCreMer , die een tamoxifen-induceerbaar fusie-eiwit uitmaakt van 'verbeterde Cre-recombinase en twee muis-oestrogeenreceptoren (Mer-iCre-Mer) onder controle van De Csf1r promotor. Derhalve zal het Cre recombinase actief zijn in Csf1r-expressieve cellen tijdens een beperkt tijdvenster. Wanneer het wordt gebruikt met een reporterstam die een fluorescerend eiwit bevat stroomafwaarts van een lox-STOP-lox cassette (Rosa26 LSL-eYFP ), zal het leiden tot de permanenteGenetische labeling van de cellen die aanwezig zijn op het moment van inductie maar ook van hun nakomelingen. Toediening bij E8.5 van de actieve vorm van tamoxifen, 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM), etiketten EMP's en macrofagen, zonder etikettering van dooierzak unipotente "primitieve" stamvogens of foetale HSC's. Daarbij hebben we het immuunfenotype van EMP's en hun nakomelingen tijdens embryonale ontwikkeling gekenmerkt, evenals de bijdrage van geel-afkomstige macrofagen aan de volwassen macrofagepoolen beoordeeld. Verdere werkzaamheden zijn nodig om te karakteriseren of primitieve stamvader-afgeleide macrofagen ook met deze aanpak worden gemerkt en of ze kunnen bijdragen aan volwassen macrofagepoolen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met het goedgekeurde instituut voor dierenwelzijn en gebruik van het Institut Pasteur (CETEA).
1. In Utero Pulse Labeling in Csf1r MeriCreMer Rosa LSL-YFP Embryo's
- Bereid de voorraadoplossing van 4-hydroxytamoxifen (OH-TAM, 50 mg / ml) op.
- Open de 25 mg injectieflacon van OH-TAM onder het rookgedrag en voeg 250 μL ethanol (100%) toe.
- Breng de OH-TAM-oplossing over in een 2 ml microcentrifugebuis met een truncated tip en vortex bij maximale snelheid gedurende 10 minuten.
- Sonicate 30 minuten in een sonicatorbad.
- Voeg 250 μL PEG-35-ricinusolie toe onder de dampkwaliteit om een 50 mg / ml voorraadoplossing te verkrijgen.
OPMERKING: PEG-35 ricinusolie is een oplosmiddel met amfifiele eigenschappen die hydrofobe moleculen binden en ze oplosbaar maken in waterige oplosmiddelen. - Vortex gedurende ongeveer 5 minutenBij maximale snelheid en soniceren 30 minuten in een sonicatorbad.
- Aliquot 90 μL (4,5 mg) per microcentrifugebuis (1 portie per injectie).
- Bewaar bij 4 ° C gedurende 1 week of bij -20 ° C voor de lange termijn zoals eerder beschreven 13 .
- Bereid de voorraadoplossing van Progesteron (10 mg / ml)
- Voeg 250 μl 100% Ethanol toe aan 25 mg progesteron om een suspensie van 10 mg / 100 μl onder de rook te bereiden. Vortex zachtjes.
- Voeg 2250 μL geautoclaveerde zonnebloemolie toe om 10 mg / ml progesteronoplossing onder de kap te maken.
- Vortex gedurende ongeveer 5 minuten bij maximale snelheid, aliquot en opslaan bij 4 ° C. Merk op dat de oplossing duidelijk is bij het opslaan.
- Tamoxifen toediening
OPMERKING: Embryonale ontwikkeling werd geschat gezien de dag van de vorming van vaginale stekker als Embryonische dag (E) 0,5. Recombinatie wordt geïnduceerd door een enkele injectie bij E8.5In zwangere Csf1r MeriCreMer vrouwen 12 . Supplement OH-TAM met 37,5 μg per g Progesteron om abortuspercentages te verminderen na toediening van tamoxifen. Injecteer om 1 uur (voor de vaginale stekker die in de ochtend wordt waargenomen).- Op de ochtend van de injectie soniceren een aliquot van de OH-TAM oplossing gedurende 10 minuten (of tot volledig geresuspendeerd).
- Voeg 360 μL NaCl 0,9% onder de dampvorm toe om een 10 mg / ml OH-TAM oplossing en vortex grondig te verkrijgen. Soniceren tot de oplossing helder is en volledig geresuspendeerd is (minstens 30 minuten).
- Voorverwarmen progesteron tot kamertemperatuur.
- Meng 450 μL OH-TAM en 225 μL progesteron in een microcentrifugebuis. Vortex.
- Soniceer tenminste 10 minuten en laad op een 1 ml spuit met een 25G naald.
- Weeg de zwangere vrouw in de dierenfaciliteit ( Csf1r MeriCreMer- vrouwtjes zijn in een inheemse FVB-genetische achtergrond en typisch wegenEn 25 en 33 g).
- Voer een intraperitoneale injectie uit door het berekende volume langzaam in de muis te injecteren. Nadat u de naald hebt ingetrokken, duwt u voorzichtig op de punctuurwond en masseer de buik om de OH-TAM te verdelen.
OPMERKING: De dosis OH-TAM is 75 mg / kg en de Progesteron dosis is 37,5 mg / kg. Tabel 1 geeft het volume in zwangere vrouwtjes te injecteren.
| Muis gewicht (g) | Totaal volume te injecteren uit de mix (μL) |
| 25 | 281 |
| 26 | 292 |
| 27 | 303 |
| 28 | 315 |
| 29 | 326 |
| 30 | 338 |
| 31 | 348 |
| 32 | 360 |
| 33 | 371 |
| 34 | 382 |
| 35 | 394 |
Tabel 1: Injectievolume van 4-OH-tamoxifen (OH-TAM). Volume vereist voor een enkele injectie bij E8.5 van 75 μg per g (lichaamsgewicht) van OH-TAM aangevuld met 37,5 μg per g progesteron.
2. Dissectie van de Yolk Sac (YS) en Fetale Lever (FL)
OPMERKING: Sterke steriele technieken zijn niet nodig bij het manipuleren van embryo's, tenzij ze gebruikt worden voor de lange termijncultuur. Desalniettemin moet het werkgebied schoon zijn en bedekt zijn met folie onder absorberend papier.
- Bereid ijskoude fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) en digestiemix (PBS bevattende 1 mg / ml collagenase D, 100 U / ml deoxyribonuclease I (DNase I) en 3% foetaal runder serum).
- Offer zwangere vrouwtjes door cerVical dislocatie op de vereiste zwangerschapsdag ( bijv. Embryonale stadium E10.5).
- Knip de huid net boven de geslachtsdelen en maak een kleine incisie aan de middellijn met een schaar. Trek de huid naar het hoofd om de lichaamsmuur volledig zonder bont bloot te stellen. Snij de buikspieren om de inwendige organen bloot te leggen en duw de darm om de twee baarmoederhoren bloot te leggen.
- Met middelste stompe pennen, pak de vetstoot aan de ovary vast en trek de baarmoeder voorzichtig. Snij op de baarmoederhalssnelheid van de baarmoederhoorns en haal de hoorn uit de buikholte. Verwijder het vetpaneel om de baarmoederhoorn volledig te bevrijden en snijd de hoornen van de eierstok aan weerszijden.
- Zet de hoornen in ijskoude PBS in een 10 mm Petri schotel. Snijd de baarmoeder spierlagen in één uiteinde (cervicale einde) en schuif een fijne schaar tussen de spierlaag en het decidale weefsel om de embryo's met het omliggende decidale weefsel los te maken.
OPMERKING: Spier heeft de neiging om snel afte te contractenR de winning, dus deze stap moet zo snel mogelijk zijn. - Gebruik een paar fijne tang om het membraan van de Reichert en de placenta af te snijden.
- Verwijder de dooierzak voorzichtig en plaats deze in een 24-putjes weefselkweekplaat met 0,5 ml verteringsmengsel.
OPMERKING: bij deze stap kan embryonaal bloed worden verzameld.- Onmiddellijk na het scheiden van de navel- en vitelline-vaten, verplaats het embryo in een 12-putjes weefselkweekplaat met 10 mM ijskoud ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA). Decapiteer het embryo met behulp van een scherpe fijne schaar, proberen zo veel mogelijk weefselverdunning te beperken. Incubeer op ijs gedurende 10-15 minuten en haal de EDTA op die het bloed bevat.
- Verwijder de amnion rond het embryo.
- Voor fasen
- Snijd het hoofd van het embryo onsIngangen of fijne scharen. Breng het kop naar een 24-putjes plaat met 0,5 ml spijsverteringskombinat.
OPMERKING: De neuroectoderm en de hersenen in latere fases worden verder gedissecteerd voor flowcytometrie analyse; Verwijder de omringende vasculaire plexus zorgvuldig. - Knip het embryo boven de achterkant en verwijder de voorbenen.
- Om de lever te isoleren, open de thorax met een paar fijne tangjes. Knijp voorwaarts aan het hart en trek zachtjes terwijl u de tweede tang gebruikt om de organen van het lichaam te bevrijden.
- Verdeel de foetale lever uit het hart en de darm zorgvuldig. Breng de foetale lever over naar een 24-putjes plaat met 0,5 ml spijsvertering mengsel. Controleer de overdracht zorgvuldig onder de dissectiemicroscoop.
- Verzamel het staartgebied (of elk ander embryo-onderdeel) voor genotypering door polymerase kettingreactie-analyse (PCR).
OPMERKING: Andere weefsels en organen kunnen worden geoogst uit E10.5 embryo's voor een soortgelijke analyse met behulp van flowcytometrie. Bloed, hoofd skiN, aorta-gonad-mesonephros regio (AGM), hart en neuroectoderm kunnen bij E10.5 verzameld worden. In latere stadia kan ook long, nier, milt en alvleesklier worden verzameld. Een gedetailleerde beschrijving van de dissectie van de algemene vergadering in verschillende ontwikkelingsfasen is eerder beschreven 14 .
3. Verwerking van embryonale weefsels voor flowcytometrie
- Incubeer de organen (in de spijsverteringskombuis) gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Breng de weefsel- en enzymatische oplossing over op een 100 μm filter, geplaatst in een 6-putjes weefselkweekplaat, gevuld met 6 ml FACS-buffer (0,5% Bovine Serum Albumin (BSA) en 2 mM EDTA in 1x PBS). Mechanisch dissociëren door zachtjes te mengen met de zwarte rubberzuiger van een 2 ml spuit om een eenzijdige suspensie te verkrijgen.
OPMERKING: vanaf nu zijn alle stappen uitgevoerd bij 4 ° C. - Verzamel de celvering met een Pasteur pipette en overbrengen in een 15 ml buis.
- SpiN gedurende 7 minuten bij 320 xg bij 4 ° C. Verwijder de supernatant door aspiratie.
- Resuspendeer de pellet in 60 μL Fc-blokkerende buffer (CD16 / CD32 blokkerende antilichaam verdund 1/50 in FACS buffer).
- Vervolgens 50 μl van de enkelcelsuspensie per putje in een 96-putjesplaat met ronde bodem 96. Incubeer gedurende minstens 15 minuten op ijs.
OPMERKING: De kleuring kan ook worden uitgevoerd in 5 ml polystyreen FACS buizen bij het hanteren van een klein aantal monsters. - Breng de resterende 10 μL over in een 5 ml polystyreen FACS buis om een pool van de monsters van elk weefsel te verkrijgen. Dit zwembad zal dienen als de controles ( dwz onbeschadigde monsters en fluorescerende minus één (FMO) regelaar voor elke fluorochroom). Breng 50 μL van het zwembad voor elke fluorescerende minus één (FMO) controle (een per fluorochroom) over naar de 96 multi-well plaat.
OPMERKING: Elke FMO-controle bevat alle fluorochroom-gekoppelde antilichamen uit het antilichaampaneel, behalve de eneDat wordt gemeten FMO's worden gebruikt om grenzen te identificeren en te controleren voor de spectrale overlap in multicolor panelen. Om de variaties in de achtergrond en autofluorescentie tussen verschillende weefsels correct aan te pakken, is het belangrijk om deze controles uit het pool van monsters van elk weefsel te bereiden. De juiste controle op YFP-expressie zijn de monsters van Cre-negatieve embryo's, die worden bevestigd door PCR genotypering.
- Vervolgens 50 μl van de enkelcelsuspensie per putje in een 96-putjesplaat met ronde bodem 96. Incubeer gedurende minstens 15 minuten op ijs.
4. Oppervlakte-antigeenverf
- Bereid de antilichamenmix in FACS-buffer (tabel 2). Bereid 50 μl antilichamenmix per monster op.
- Gebruik de volgende fluorochroom-gekoppelde antilichamen: anti-CD45.2 (kloon 104); Anti-CD11b (kloon M1 / 70); Anti-F4 / 80 (kloon BM8); Anti-AA4.1 (kloon AA4.1); Anti-kit (kloon 2B8); En anti-Ter119 (clone Ter119).
- Bereid zes antilichamen mixen voor de FMO controles in FACS buffer. Bereid 50 μl antilichamenmix per controlemonster op.
NEETE: De verdunning van antilichamen in de antilichamenmix is twee keer meer geconcentreerd dan de uiteindelijke concentratie die in de materiaaltafel wordt aangegeven. Voor een paneel met zes fluorochroom-gekoppelde antilichamen worden 6 FMO controles bereid. Tabel 2 geeft de samenstelling van het antilichaammengsel en FMO-controles voor één buis.
| Volume (μL) van antilichaam (eindvolume 50 μl) | ||||||||
| Antilichaam | Clone | Antibody Mix | FMO CD45.2 | FMO CD11b | FMO F4 / 80 | FMO AA4.1 | FMO Kit | FMO Ter119 |
| anti-CD45.2 | 104 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| anti-CD11b | M1 / 70 | 0.5 | 0.5 | 0 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| anti-F4 / 80 | BM8 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 |
| anti-AA4.1 | AA4.1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 |
| anti-Kit | 2B8 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0 | 0.5 |
| anti-Ter119 | Ter119 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0 |
| FACS buffer | 45.5 | 46.5 | 46 | 46.5 | 46.5 | 46 | 46 | |
Tabel 2: Volume van antilichamen die gebruikt worden voor kleuring en fluorescerende minus één (FMO) controles. Volume (μL) van antilichaam vereist voor een eindvolume van 50 μl.
- Voeg 50 μl van het antilichamenmengsel toe aan de monsters in de 96-multiwellplaat (eindvolume tijdens het vlek is 100 μl). Duw twee keer zachtjes omhoog en omlaag en incubeer 30 minuten op ijs.
- Spin de 96-multiwellplaat gedurende 7 minuten bij 320 xg bij 4 ° C en wrijf de supernatant af. Resuspenderen in 200 μl FACS buffer.
- Herhaal de wasprocedure (stap 4.3) tweemaal met 150 μl FACS-buffer.
- Filter de monsters en de controles (FMO's en onbeschadigde poolmonsters) in 5 ml polystyreenbuizen door een 70 μm filter. Bewaar op ijs tot opnemen.
5. Identificatie van EMP's en YS-afgeleide macrofagen door flowcytometrie
OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd met behulp van een 4-flow-flow cytometer eqAfgezogen met een 405 nm violette laser, een 488 nm blauwe laser, een 562 nm gele laser en een rode laser van 638 nm.
- Bereid compensatiekralen voor elk gekoppeld antilichaam op volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik onbedekte monsters en compensatiekralen om de laserintensiteiten te optimaliseren.
- Om grenzen te identificeren, gebruik FMO (Fluorescentie minus één) controles voor elk antilichaam.
- Om dode cellen uit te sluiten, voeg 1 μL DAPI (1 mg / ml) toe aan de buis (bevattende 200 μL gekleurde cel suspensie) 1 min voor de aankoop. Gebruik het sterke DAPI-signaal en de forward-scattered parameter (FSC) om uitsluiting van dode cellen en puin te voorkomen.
OPMERKING: Gebruik software van de flow cytometer om poorten te trekken tijdens de overname. Compensatiematrix en analyse kunnen worden uitgevoerd na het verzamelen van een monster door gebruik te maken van andere commercieel beschikbare software. - Gebruik voorwaartse en zijspreiding (FSC vs SSC) om livecellen en dubbele diskriminatie uit de totale gebeurtenissen uit te voeren.
- Creëer fluorescentie dot plots in log-axis en teken dochter poorten om eerst erythrocyten (Ter119 + ) uit te sluiten en vervolgens voorvadercellen (Kit + ) en hematopoietische cellen (CD45 + Kit neg ) te identificeren (zie figuur 1 ).
- Creëer fluorescentiehistogrammen om de etiketteringsefficiëntie van YFP tussen de verschillende geïdentificeerde populaties in de YS ( Figuur 2 ), de foetale lever ( Figuur 3 ) en de hersenen te kwantificeren ( Figuur 4 ).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Genetische kaartvorming werd bereikt door toediening bij E8.5 van OH-TAM in Csf1r-Mer-iCre-Mer-vrouwtjes met paren met een Rosa26-LSL-eYFP-reporter. In aanwezigheid van OH-TAM leidt afscheiding van de stopcassette naar de permanente expressie van YFP in de cellen die Csf1r uitdrukken. We verzamelden twee hematopoietische weefsels: de dooierzak en de foetale lever en een niet-hematopoietisch weefsel, de neuroectoderm, uit de embryo's bij E10.5. Enkel-cel suspensies w...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De verschillende golven van hematopoietische precursorcellen overlappen gedeeltelijk over een kort tijdsbestek, waardoor de analyse van de bijdrage van elke golf van ontwikkelingshematopoiesis aan immuuncellen technisch zeer uitdagend is.
Tamoxifen-induceerbare Cre-systemen bieden de mogelijkheid om specifieke cellen op een temporele induceerbare manier te merken en lijnanalyse uit te voeren in embryo's of volwassenen, zonder de noodzaak van ex vivo of in vitro- cultuur...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken prof Frederic Geissmann en prof Christian Schulz voor inzichtige discussies; Dr Hannah Garner voor kritisch lezen van het manuscript, Dr Xavier Montagutelli en Dr Jean Jaubert en het personeel van de Institut Pasteur-dierfaciliteit ter ondersteuning van de veeteelt; En Pascal Dardenne en Vytaute Boreikaite, een Amgen Scholar, voor hun technische bijstand. Onderzoek in het EGP-laboratorium wordt gefinancierd door de Institut Pasteur, de CNRS, de Cercle FSER (FRM en een startpakket van het Institut Pasteur en het REVIVE-consortium. LI wordt ondersteund door een PhD-genootschap van het REVIVE-consortium.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| #5 Straight Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 | |
| 8.5 cm straight scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Anti-Mouse Kit-PE (clone 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 verdunning in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (clone 104) | Sony | 1149120 | 1/100 verdunning in FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93, clone AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 verdunning in FACs Buffer |
| Anti-Mouse Ter119 PerCP-Cy5.5 (clone Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 verdunning in FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4/80-BV421 (clone BM8) | BD Pharmingen | 123137 | 1/100 verdunning in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (clone M1/70) | BD Pharmingen | 552850 | 1/200 verdunning in FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block, clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 11570506 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| 6-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353046 | |
| 12-well tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353224 | |
| 24-well tissue culture plate | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 wells U-shape bottom tissue culture plate | Dutscher Dominique | 353227 | |
| Syringe Plastipak 2 mL | Dutscher Dominique | 300185 | |
| Nylon grid 100 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352360 | |
| Nylon grid 70 µm cell strainers | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 ml Falcon tubes | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore filtration kit, 0.2 μm | Dutscher Dominique | 51246 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-500G | |
| (Z)-4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | Speciale zorg moet worden genomen bij het bereiden en werken met tamoxifen en zijn derivaten. Gebruik altijd geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen |
| Progesterone | Sigma | P3972 | Gebruik altijd geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen |
| PEG-35 castor oil (Kolliphor/Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| Sunflower oil | Sigma | S5007-250ML | |
| Ethanol | Sigma | 24103-1L-R-D | Gebruik altijd geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en gebruik onder de afzuigkap |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI, 1 ML (1 MG/ML IN WATER) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 flow cytometer | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp Antibody Capture Bead kit (2x5 mL) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg(Csf1r-cre/Esr1*)1Jwp/J | The Jackson laboratory | 19098 | |
| B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J | The Jackson laboratory | 6148 |
Referenties
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. , (2015).
- Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139 (19), 3521-3530 (2012).
- Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42 (4), 665-678 (2015).
- Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27 (6), 369-378 (2015).
- Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10 (5), 243-252 (1981).
- Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
- Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
- Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 134-139 (2005).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
