Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Kinetiek van Achterblijvende-streng DNA-synthese

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55312

⸱

25 februari 2017

 , 
1Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven gevoelige, gel-gebaseerde discontinue assays om de kinetiek van lagging-strandinitiatie te onderzoeken met behulp van de replicatie-eiwitten van bacteriofaag T7.

Samenvatting

Hier bieden we protocollen voor de kinetische onderzoeking van de achterblijvende-streng DNA-synthese in vitro door de replicatie-eiwitten van bacteriofaag T7. Het T7-replisome is een van de eenvoudigste replicatiesystemen die bekend zijn, samengesteld uit slechts vier eiwitten, wat een aantrekkelijk kenmerk is voor biochemische experimenten. Speciale nadruk wordt gelegd op de synthese van ribonucleotide-primers door de T7-primase-helicase, die door DNA-polymerase worden gebruikt om DNA-synthese te initiëren. Omdat de mechanismen van DNA-replicatie geconserveerd zijn door de evolutie, zouden deze protocollen toepasbaar moeten zijn, of nuttig als een conceptueel springplank, voor onderzoekers die andere modelsystemen gebruiken. De protocollen die hier worden beschreven zijn zeer gevoelig en een ervaren onderzoeker kan deze experimenten uitvoeren en gegevens voor analyse verkrijgen in ongeveer een dag. Het enige gespecialiseerde stuk apparatuur dat vereist is, is een snel-quenching flow-instrument, maar dit stuk apparatuur is relatief gebruikelijk en verkrijgbaar bij verschillende commerciële bronnen. De belangrijkste nadelen van deze assays zijn echter het gebruik van radioactiviteit en de relatief lage doorvoer.

Inleiding

De replicatie van DNA is geconserveerd kenmerk van alle cellulaire leven. Hoewel de identiteit en het aantal replicatie componenten sterk variëren, zijn de algemene mechanismen gedeeld over de evolutie 1. We beschrijven gel gebaseerde discontinue kinetische experimenten, met behulp van radioactieve substraten, gericht op het begrijpen van de kinetiek van achterblijvende streng DNA synthese in vitro door componenten van de T7 replisome. De replicatiemachinerie van bacteriofaag T7 is zeer eenvoudig, bestaande uit slechts vier eiwitten (DNA polymerase, GP5 en de processivity factor, E. coli thioredoxine, de bifunctionele primase-helicase GP4, en de enkelstrengs DNA-bindend eiwit, GP2. 5) 2. Deze functie maakt het een aantrekkelijke modelsysteem om de geconserveerde biochemische mechanismen van DNA-replicatie bestuderen.

Speciale nadruk wordt gelegd op de vorming van ribonucleotide primers door T7 DNA primase, een criticaIk stap in de initiatie van DNA-synthese. Bovendien kan men ook het gebruik van deze primers door T7 DNA- polymerase replicatie of andere eiwitten onderzocht door ze in het reactiemengsel. De T7 primase-helicase, GP4, katalyseert de vorming van primers voor DNA-synthese op specifieke DNA-sequenties genoemd primase herkenningsplaatsen of PRS, (5'-GTC-3 '). De cytosine in het PRS cryptisch, is het essentieel voor herkenning van de website, maar het is niet gekopieerd naar het product 3. De eerste stap in de synthese primer door GP4 omvat de vorming van het dinucleotide pppAC, die vervolgens wordt uitgebreid tot een trimeer en uiteindelijk functionele tetranucleotide primers pppACCC, pppACCA of pppACAC afhankelijk van de sequentie in de mal 4. Deze primers kunnen vervolgens worden gebruikt door T7 DNA polymerase om DNA-synthese, die ook een gp4 werkwijze met 5, 6 initiëren. In dit opzicht is de primasedomein stabiliseert de extreem korte tetraribonucleotides de sjabloon, voorkomen van dissociatie grijpt DNA polymerase zodanig bevorderlijk is voor een primer / matrijs in de polymerase actieve plaats 7. Deze stappen (RNA primer synthese primer handoff te polymerase en extensie) worden herhaald in meerdere cycli op de bekledings bundel repliceren en worden gecoördineerd met de replicatie van de belangrijke bundel.

De hier beschreven assays zijn zeer gevoelig en kan worden uitgevoerd in een gematigd tijdsbestek. Ze zijn echter relatief lage-throughput en goede zorg moet worden betracht bij het gebruik en de verwijdering van radioactieve stoffen. Afhankelijk van de snelheid waarmee de reactie verloopt, kan men een snelle quench-instrument te gebruiken om monsters opbrengen op tijdschalen vatbaar voor zinvolle analyse reactietijd gangen in zowel de constante of de pre-steady state. Onlangs hebben we gebruikten assays hier beschreven evidenc biedene van het belang van primer vrijlating uit de primase domein van GP4 in de inleiding van Okazaki fragmenten. Bovendien toonden we aan een regulerende rol voor het T7 enkelstrengs DNA-bindend eiwit, gp2.5, voor de efficiëntie van vorming en gebruik 8 primer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

LET OP: Volg alle institutionele voorschriften met betrekking tot het veilig gebruik en de verwijdering van radioactief materiaal, inclusief maar niet beperkt tot, het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals handschoenen, een veiligheidsbril, laboratoriumjas en passende acryl schilden.

OPMERKING: De standaard buffer bestaat uit 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM kalium- glutamaat, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (dit buffer wordt pre een 5x concentratie) en 0,3 mM van elke dNTP. T7 replicatie eiwitten gezuiverd zoals beschreven 8, 9, 10. Enkelstrengs DNA bevattende één T7 primase herkenningsplaats (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3 ') is verkrijgbaar bij diverse bedrijven DNA-synthese (de lengte van de ssDNA kan afhangen van het enzym van keuze, voor T7 primase, een pentameer is de minimale lengte template volledige lengte primer te synthetiseren 11, de cryptische C is echter essentieel indien de primer verlengd met polymerase, additionele nucleotiden aanwezig op het 3 'uiteinde van de template. Reacties worden geïnitieerd door het toevoegen van een eindconcentratie van 10 mM MgCl2 en geïncubeerd bij 25 ° C. Handmatige sampling werkt goed voor tijdstippen van 5 seconden of meer. Als tijdstippen korter dan die vereist, wordt aanbevolen een snelle quench-stroom instrument om nauwkeurige gegevens te verkrijgen.

1. Multiple-omzet Primer Synthese Reactie door Manual Sampling

  1. Voordat de proef begon, monster 2 pl formamide kleurstof buffer (93% (v / v) formamide, 50 mM EDTA, 0,01% xyleencyanol en 0,01% broomfenolblauw) in 8 1,5 ml polypropyleen buizen. In het algemeen is het aantal buizen is gelijk aan het aantal tijdstippen geanalyseerd.
  2. Bereid een 20 pi mengsel bestaande 1x buffer, 0,1 mM ATP en CTP, 0,25 mCi / ml [α- 32P] CTP, 0,1 uM ssdNA template en 0,1 uM GP4 (uitgedrukt als hexameer concentratie - 0,6 uM monomeer).
  3. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
  4. Verwijder 2 pi van het mengsel met behulp van een pipet en meng met 2 pl formamide kleurstof buffer in een 1,5 ml buis bereid in stap 1.1 voor de niet reactiecontrole (tijdstip nul).
  5. Voeg 2 ul van 0,1 M MgCl2 tot reactiemengsel (een eindconcentratie van 10 mM).
  6. Handmatig intrekken 2 pl monsters van de reactiemengsels onder toepassing van een pipet in 10 s intervallen en meng met formamide kleurstof voorverdeeld in 1,5 ml buisjes bereid in stap 1.1.
  7. Warmte monsters bij 95 ° C gedurende 5 min in een verwarmingsblok.
  8. Laad porties van de monsters op een denaturerende gel. De kleine tetraribonucleotide primer gesynthetiseerd door T7 primase goed ontbonden op een 0,4 mm dikke 25% acrylamide: bisacrylamide (19: 1), 3 M ureum, 1x TBE (100 mM Tris-boraat, 1 mM EDTA).
  9. Plaats de gehele gel op ChromatograPHY papier en dek af met plastic folie. Droog onder toepassing van een gel droger.
  10. Bereid een verdunningsreeks van de rest van het reactiemengsel en spot hetzelfde volume geladen op de gel chromatografie op papier, dat wil zeggen, spotten 4 pl van de verdunning of 4 pl monster werd geladen.
    Opmerking: Dit zal dienen als de standaardcurve om de concentratie van de producten gevormd tijdens de reactie te bepalen. Bijvoorbeeld vijfvoudige verdunningen behulp TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) werken goed, verspreid over een bereik van 1:25 tot 1: 15.625 (5 2 -5 6), maar de verdunningen worden aangepast afhankelijk van de mate van activiteit.
  11. Expose droge gel en standaard gebruik van een phosphorimager scherm. Kwantificeren van de radioactiviteit in de verdunningsreeks en bouw een standaardkromme zoals beschreven 8, 12
    OPMERKING: Opname van T7 DNA polymerase aan het reactiemengsel maakt het mogelijk om EXAmine het gebruik van tetraribonucleotide primers door dit enzym. Optimaal dienen de polymerase concentratie te verzadigen met de interpretatie van de gegevens te vereenvoudigen. Een polymerase concentratie van 0,4 pM of hoger geeft goede resultaten. Bovendien kan het effect van andere eiwitten, zoals enkelstrengs DNA bindende eiwitten, aan beide primer synthese of achterblijvende streng inleiding op deze manier onderzocht.

2. Multiple-omzet Primer Synthese Reactie Met behulp van een Rapid-demping Instrument

  1. Bereiding van reactiemengsels
    1. Bereid 400 ul oplossing A, die 1 x buffer, 0,2 uM GP4 hexameer, 0,2 uM ssDNA template, 0,6 mM dNTPs, 0,2 mM ATP en CTP (inclusief 0,5 mCi / ml [α- 32P] CTP.
    2. Bereid 400 pi oplossing B, bestaande uit 1x buffer en 20 mM MgCl2.
  2. Werking van rapid-demping doorstroming instrument
    1. Schakel rapid-doof stroming instrument; na het hoofdmenu verschijnt, type 7 op het instrument toetsenbord om de spuit chauffeur te verplaatsen naar de beginpositie.
    2. Open buffer spuit positie om "LOAD".
  3. Laadbuffer spuiten
    1. Bevestig een 10 ml spuit met buffer om de drive spuit poort. Verander spuit knop positie op "LOAD".
    2. Gebruik 10 ml spuiten, vul instrument bufferreservoir A en B met 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA en vul spuit C met afschrikoplossing (250 mM EDTA en 0,2% SDS). Verwijder luchtbellen door te drukken zuigers in en uit.
    3. Change knop posities om 'vuur'. Type 2 om de positie van de spuit bestuurder bar aan te passen. Druk op de "ADJUST DOWN" knop om de spuit te verlagen tot buffer komt uit de exit lus: (7-onder gaat continu; 8-grote stap naar beneden, 9-small step down). Typ "ESC" om terug te keren naar het hoofdmenu.
  4. wash tubing
    1. attach exit lijn naar vacuüm. Verander sample knoppen om "FLUSH". Afsluiten buffer spuit door de knoppen in de horizontale stand. Zet vacuüm en dompel de 2 flush lussen in H 2 O voor 10 s, dan duik in MeOH gedurende 10 s. Droog lussen door te zuigen lucht voor ~ 15 s, of tot het droog is.
  5. Loading samples
    1. Change monster knop positie op "LOAD". Plaats oplossing A bij 1 ml spuit. Sluit spuit in één belading van het monster poorten. Herhaal dit voor oplossing B en plaats in tegengestelde sample load-poort.
  6. Het verzamelen van time-punten
    1. Op het hoofdmenu, type 1 voor demping-flow run. Voer reactietijd (s) en druk op "ENTER". De reactie lusnummer te gebruiken wordt weergegeven. Overschakelen naar verplichte reactie lus. Herhaal wassen procedure in stap 2.2.4.
    2. Draai sample knoppen om "LOAD". Load reactie mengt in sampleloops tot net buiten het centrale mengen compartiment. Draai alle knoppen op "FIRE '. Controleer of alle knoppen in de juiste positie.
    3. Plaats 1,5 ml buis op het einde van de afrit loop. Druk op "GO" om de reactie te draaien. Herhaal wassen procedure in stap 2.2.4. Reload buffer spuiten A en B totdat ze de bestuurder raken.
    4. Herhaal stap 2.2.6.2-2.2.6.3 voor elk gewenst tijdstip. Uitzondering: Laat oplossing die de start reagens (bijv MgCl 2 in dit geval) bij afschrikken van het tijdstip nul-punt controle niet geladen.
    5. Wanneer u klaar bent het verzamelen van monsters, voert u "ESC" om terug te keren naar het hoofdmenu. Druk op "7" om buffer spuit bestuurder terug te keren naar de uitgangspositie.
  7. Instrument clean-up
    1. Verwijderen reactiemengsel spuiten. Draai monster laden knop om "LOAD" -stand. Onder vacuüm, wassen elk monster lus met 10 ml 0,2 N NaOH, gevolgd door 10 ml 0,3 NH 3 PO 4 en 10 mL MeOH.
    2. Draai spuit knoppen om "LOAD" -stand. Druk naar beneden op alle 3 SYRinge zuigers om reactie en demping buffers op te halen. Wassen spuiten met 5 ml H2O ten minste tweemaal.
    3. Vul spuiten opnieuw met 5 mL H2O en draai knoppen om "vuur" positie. Verander knop posities en zet vacuum aan H 2 O. Flush te verwijderen zoals in stap 2.2.4. Schakel instrument.
      LET OP: De producten worden geanalyseerd zoals beschreven in stappen 1,7-1,12. Bovendien kan T7 DNA-polymerase en andere eiwitten replicatie in het reactiemengsel worden toegevoegd om het effect op synthese primer of uitbreiding analyseren.

3. Single-omzet Primer Synthese Reactie

OPMERKING: Single-omzet primer synthese / extensie assays zijn eveneens uitgevoerd om meerdere omzet reacties, met enkele belangrijke verschillen: deze assays volgen de omzetting van radioactief gemerkt ATP in of primer verlengingsproducten, maar de concentratie van substraten en eiwitten considerably hoger. Bovendien, teneinde milliseconde bereiken analyse van de primer synthesereactie toelaten, moet men een snelle quench-stroom machine gebruiken.

  1. Bereiding van reactiemengsels.
    1. Bereid 400 ul oplossing A, bevattende 1 x buffer, 3 uM GP4 hexameer, 6 uM ssDNA template, 0,6 mM dNTPs, 1 mM CTP en 2 nM [γ- 32 P] ATP. Bereid 400 pi oplossing B, bestaande uit 1x buffer en 20 mM MgCl2.
  2. Rapid-demping stroom operatie
    1. Verricht reacties zoals beschreven in stap 2.2. Voeg desgewenst T7 DNA polymerase of T7 enkelstrengs DNA-bindend eiwit bij een concentratie van 15 uM en 20 uM, respectievelijk. In dit geval, de verlengingsproducten accumuleren tegelijk regeling die voorziet in handmatige bemonstering van het reactiemengsel.

4. Data Analysis

  1. Fit product vooruitgang curves voor niet-lineaire minstpleinen modellen met behulp van commercieel verkrijgbare software die in staat kleinste kwadraten horten en / of numerieke integratie. De details van de operatie zal variëren met de gebruikte software, maar onder zijn algemene vorm vergelijkingen voor de montage van de data.
  2. Bepaal de snelheid van vorming product van meerdere omzet primer synthese reacties door het aanbrengen naar krommen ontwikkelen tot een lineaire vergelijking. Als er een aanzienlijke kromming Gebruik de initiële werkwijze tarief 13, 14 door het aanbrengen van de data voor een enkelvoudige exponentiële functie: y = A (e - k t), waarbij y de productconcentratie, A de reactie amplitude, k de waargenomen snelheidsconstante, t de tijd in seconden. De helling van de raaklijn op tijdstip = 0 is de initiële snelheid.
    OPMERKING: Geschikte pre-steady state primer synthesereacties een lineaire vergelijking of de pre-steady state burst vergelijking y = A (e - k bueerste t) + rate ss t, waarbij A de reactie amplitude, k burst is de waargenomen snelheidsconstante voor de pre-steady state burst, percentage ss is de constante frequentie ss = kcat [Enzyme]), t de tijd , in seconden. Fit single-omzet primer synthese reacties vooruitgang bochten om een single-exponentiële functie y = A (e - k t). Bij GP4, bij de data door numerieke integratie 15, een model met drie NTP condensatiestappen, waarbij elke tussenproduct in evenwicht met het enzym, met in de handel verkrijgbare software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De in Figuur 1A resultaten werden verkregen zoals beschreven in stap 1 van het protocol, dat wil zeggen, door handmatig een primer synthese gekatalyseerd door gp4 onder meervoudige omzetvoorwaarden bemonstering. Hier kan een reeks producten na gelelektroforese worden waargenomen door CTP gemerkt met 32P bij de α-plaats in primer synthesereacties (Figuur 1A). Het gemerkte precursor, CTP, toont de hoogste mobiliteit en ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De belangrijkste factor bij het uitvoeren van deze experimenten is de beschikbaarheid van zeer actieve gezuiverd enzym. Tijdens ons werk met GP4, bijvoorbeeld, vonden wij dat de opslag van het gezuiverde enzym in buffer (20 mM kaliumfosfaat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) bevattende 50% glycerol bij -20 ° C leidt tot een vermindering de specifieke activiteit van het preparaat over een paar maanden. Daarom hebben we nu flash-freeze kleine fracties gezuiverd gp4 in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM TCE...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken de leden van het C.C.R. laboratorium voor hun opmerkingen en S. Moskowitz voor de voorbereiding van de figuur. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) en GM54397 (C.C.R.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Tris voorgeprogrammeerde kristallen
pH 7.5		SIGMAT4128
Tris baseSIGMA93362
L-Glutaminzuur kaliumzout monohydraatSIGMAG1501 
Magnesiumchloride hexahydraatMallinckrodt Chemicals5958-04
1,4-DithiothreitolJ.T. BakerF780-02
NatriumdodecylsulfaatMP Biomedicals811030
(Ethylenedinitrilo) tetraazijnzuur, dinatriumzout, dihydraatMallinckrodt Chemicals4931-04
[α-32P] CTPPerkinElmerBLU508Hradioactief, neem beschermende maatregelen
[γ-32P] ATPPerkinElmerBLU502Aradioactief, neem beschermende maatregelen
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP Affymetrix77100vier dNTPs onderdeel van set
100 mM ATP en CTPEpicentreRN02825onderdeel van NTP set
ssDNA constructiesIntegrated DNA TechnologiesN/Aaangepaste sequenties 
methanol Macron Fine Chemicals3017-08
FormamideThermo Scientific17899
BroomfenolblauwSIGMAB8026 
Cylene xyanol SIGMAX4126 
AcrylamidSIGMAA9099Toxisch
N,N′-MethyleenbisacrylamideSIGMAM7279 Toxisch
UreaBoston BioproductsP-940
BoorzuurMallinckrodt Chemicals2549
Rapid Quench-Flow Instrument Kintek Corp.RQF-3 
Kintek ExplorerKintek Corp.N/A
Kaleidagraph Synergy SoftwareN/A

Referenties

  1. Kornberg, A., Baker, T. A. DNA replication. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).
  2. Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
  3. Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
  4. Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
  5. Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
  6. Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
  7. Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
  8. Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
  9. Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
  10. Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
  11. Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
  12. Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
  13. Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658(2013).
  14. Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
  15. Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
  16. Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
  17. Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56(2013).
  18. Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Rapid quench flow instrumentkinetiek van primersyntheseanalyse van Okazaki fragmentenT7 primase helicaseDNA polymeraseactiviteitradioactieve nucleotide markeringdenaturerende gelelektroforesesingle turnover experimenten
Kinetiek van Achterblijvende-streng DNA-synthese
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.