Methodenartikel

Met behulp van Primary neurosfeerculturen om te studeren Primary Cilia

DOI:

10.3791/55315

⸱

14 april 2017

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De primaire cilium fundamenteel belang neurale proliferatie, neuronale differentiatie en volwassen neuronale functie. Hier beschrijven we een werkwijze voor ciliogenese en het transport van signalerende eiwitten trilharen neurale stam / progenitorcellen en gedifferentieerde neuronen in het primaire neurosfeerculturen bestuderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het primaire cilia is fundamenteel belangrijk voor de proliferatie van neurale stam-/voorlopercellen en voor neuronale differentiatie tijdens embryonale, postnatale en volwassen leven. Bovendien bezitten de meeste gedifferentieerde neuronen primaire cilia die signaalreceptoren huisvesten, zoals G-proteïnegekoppelde receptoren, en signaalmoleculen, zoals adenylcyclasen. Het primaire cilia bepaalt de activiteit van meerdere ontwikkelingspaden, inclusief de sonic hedgehog-route tijdens embryonale neuronale ontwikkeling, en functioneert ook in het bevorderen van gecompartimenteerd subcellulair signaalverkeer tijdens volwassen neuronale functie. Het is niet verrassend dat defecten in primaire cilia-biogenese en -functie zijn gekoppeld aan ontwikkelingsstoornissen van de hersenen, centrale obesitas en tekorten in leren en geheugen. Daarom is het van essentieel belang om primaire cilia-biogenese en ciliair verkeer te bestuderen in de context van neurale stam-/voorlopercellen en gedifferentieerde neuronen. Cultuurmethoden voor primaire neuronen vereisen echter aanzienlijke expertise en zijn niet geschikt voor bevriezing-ontdooi cycli. In dit protocol bespreken we kweekmethoden voor gemengde populaties van neurale stam-/voorlopercellen met behulp van primaire neurosferen. De neurosfeer-gebaseerde kweekmethoden bieden de gecombineerde voordelen van het bestuderen van primaire neurale stam-/voorlopercellen: geschiktheid voor meerdere passages en bevriezing-ontdooi cycli, differentiatiepotentieel naar neuronen/glia en transfecteerbaarheid. Belangrijk is dat we hebben vastgesteld dat neurosfeer-afgeleide neurale stam-/voorlopercellen en gedifferentieerde neuronen bewimperd zijn in cultuur en signaleringsmoleculen lokaliseren die relevant zijn voor ciliaire functie in deze compartimenten. Met behulp van deze culturen beschrijven we verder methoden om cilogenese en ciliair verkeer te bestuderen in neurale stam-/voorlopercellen en gedifferentieerde neuronen. Deze neurosfeer-gebaseerde methoden stellen ons in staat om cilia-gereguleerde cellulaire paden te bestuderen, inclusief G-proteïnegekoppelde receptor- en sonic hedgehog-signalering, in de context van neurale stam-/voorlopercellen en gedifferentieerde neuronen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De primaire cilium is een microtubulus gebaseerde dynamische subcellulair compartiment dat functioneert als een zintuiglijke antenne coördinatie cellulaire signaalroutes, zoals de Sonic-hedgehog (Shh) route tijdens de embryonale neuronale ontwikkeling 1, 2 en gecompartimenteerde subcellulaire signalering bij volwassen neuronale functie 3, 4 . Signaleringscomponenten van deze routes, zoals Shh receptor Patched 5; het pad activator Smoothened (Smo) 6; en Gpr161 7, wees G eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) die negatief reguleert de Shh route, lokaliseren op cilia op een dynamische wijze. Meerdere GPCRs zijn gerapporteerd te lokaliseren aan de cilia van neuronen in de hersenen 7, 8, 9, 10 sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defecten in cilia en trilharen gegenereerde signaalroutes beïnvloeden meerdere weefsels en zijn gezamenlijk bekend als ciliopathieën 17, 18, 19. De ciliopathie ziektespectrum omvat vaak neurologische afwijkingen zoals craniofaciale abnormaliteiten 20, 21, 22. Daarnaast kunnen primaire cilia in neuronen van de hypothalamus regelen centrale verzadiging paden en defecten leiden centrale obesitas 23, mirroring obesitas bij syndromale ciliopathieën zoals Bardet Biedel syndroom 24. Bovendien, neuropeptide receptor signalering bij cilia regelt central verzadiging trajecten 11, 14. Ciliaire lokalisatie van adenylylcyclase III (ACIII) en GPCR's zoals somatostatine receptor 3 in hippocampale neuronen leiden tot nieuwe defecten objectherkenning en geheugenstoornissen 25, 26 en parallel met een gebrek aan integriteit ciliaire 27. De ontwikkelingsdoelen aspecten van trilharen-gegenereerde signalering zijn nauw verbonden met weefsel homeostase; met name cilia zijn belangrijk voor de voortgang van Shh-subtype medulloblastomas gevolg van granule voorlopers in het cerebellum 28, 29. Zo primaire cilia een belangrijke rol spelen tijdens de embryonale, postnatale en volwassen neuronale ontwikkeling en functie.

Neurale stamcellen (NSC's) zijn gehuisvest in de subventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikel, de subgranulaire zone van de dentate gyrus van de hippocampus, enventriculaire zone van het derde ventrikel in de hypothalamus bij zoogdieren 30, 31, 32. NSCs zijn multipotente, bezitten het vermogen tot zelf-vernieuwing, en zijn belangrijk voor de ontwikkeling van de hersenen en regeneratieve geneeskunde 30. De meeste NSC in de SVZ zijn rust en beschikken over een eenzame primaire cilium dat, in veel gevallen, strekt zich uit naar de laterale ventrikel 33. De primaire cilium signalen via de lokalisatie van de verschillende receptoren induceren stroomafwaartse cellulaire reacties, met name met betrekking tot Shh, TGFp en receptor tyrosine kinase pathways 2, 34, 35, 36. Aangezien primaire cilia uitstrekken in de laterale ventrikel, wordt verondersteld dat primaire cilia cytokines gedetecteerd in de cerebrospinale vloeistof (CSF) om NSC's 37 activeren . Recente studies suggereren dat de Shh signaleringsroute en primaire cilia zijn cruciaal voor de activering van stamcellen in de reparatie en regeneratie van meerdere weefsels, waaronder de reukepitheel, longen en nieren 38, 39, 40, 41. Echter, de mechanismen die CSF communiceert met NSC en of primaire cilia zijn betrokken zijn niet bekend. Hechtende NSCs in cultuur worden trilharen; lokaliseren Shh pathway componenten zoals Smo en Gpr161 in trilharen; en zijn Shh responsief 42. Aldus kan NSC dienen als een belangrijk modelsysteem voor het bestuderen Shh route, ciliaire handel en neuronale differentiatie paden. Bovendien kunnen neuronen opzichte van NSC ook voor ciliaire handel assays.

Neurospheres zijn samengesteld uit clusters van vrij zwevende cellen die voortvloeien uit de proliferatie van neural stam / progenitorcellen die groeien in de aanwezigheid van specifieke groeifactoren en klevende oppervlakken 43, 44. Neurosferen zijn belangrijke in vitro cultuurmodellen neurale stam / progenitorcellen in de normale ontwikkeling en ziekte 31, 45, 46, 47 bestuderen. We beschrijven hier een neurosfeer gebaseerde test voor het kweken van neurale stam / progenitorcellen en differentiatie tot neuronen / glia. Wij benadrukken het bijzonder het transport van signaleringscomponenten op cilia van neurale stam / voorlopercellen en gedifferentieerde neuronen (Figuur 1). In tegenstelling tot het kweken van primaire neuronen, primaire neurosferen zijn relatief gemakkelijk te kweken, zijn ontvankelijk voor meervoudige passages en vries-dooicycli en kunnen differentiëren tot neuronen / glia. Belangrijker, we vastgesteld dat neurosfeer afgeleide neuralestam / progenitorcellen en gedifferentieerde neuronen zijn trilharen in kweek en te lokaliseren signalerende moleculen trilhaarfunctie in deze compartimenten relevant. Neurosphere-gebaseerde kweekmethoden kan dienen als een ideaal model voor het bestuderen ciliogenese en trilharen handel in NSCs en gedifferentieerde neuronen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Isolatie van Neurosferen van de volwassen muis Brain

  1. Euthanaseren een volwassen muis (ongeveer 2 maanden oud) door een overdosis van isofluraan. Double-check dat de muis ademhaling is gestopt en ontleden onmiddellijk na de dood.
  2. Met een schaar, maak een middellijn incisie aan de schedel te openen. Verwijder de hersenen.
  3. Plaats de hersenen in koude PBS in een 10 cm schotel op ijs. Volg de hele-mount versnijdingsmethode de SVZ van het laterale ventrikel 48 te verkrijgen.
  4. Plaats de laterale ventrikel in een 1,5 ml buis, voeg 500 ul van 0,05% trypsine-EDTA in PBS en incubeer de buis gedurende 15 minuten bij 37 ° C in een waterbad.
  5. Na 15 minuten, voeg 500 ul stoppen medium en voorzichtig pipetteren 20-30 keer met 1 ml tip. Vermijd de vorming van luchtbellen tijdens het pipetteren.
    OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang voor de overleving van de cel.
  6. Draai de cellen bij 500 xg gedurende 8 minuten. Verwijder het supernatant, voeg 1 ml PBS en resuspendeer tHij cellen door voorzichtig pipetteren met een 5x 1 ml tip.
  7. Spin down bij 500 xg gedurende 8 minuten. Verwijder het supernatant onder gebruikmaking van een 1 ml tip en voeg 1 ml basismedium.
  8. (Optioneel) Als celresten worden opgemerkt, laat de cellen door een 70 urn cel zeef.
  9. Tel het aantal cellen met een hemocytometer; in het algemeen, ongeveer 30.000 - 60.000 cellen / SVZ verkregen.
  10. Plaat de cellen van de ene SVZ in een 10 cm schaal met 10 ml NSC medium en kweek bij 37 ° C met 5% CO2.
  11. (Optioneel) fusie tussen gebieden 49 te vermijden, zet 1.000 cellen in één putje van een ultralage binding 6-wells plaat die is voorgevuld met 1,5 ml NSC medium en kweek bij 37 ° C met 5% CO2.
    OPMERKING: Na het 5-7 dagen, neurospheres kan worden waargenomen (Figuur 2A). De kweekperiode kan verschillen met de leeftijd van de muis of de genetische achtergrond.
  12. Voeg 2 ml van NSC medium elke 3-4 dagen om de cultuur te behouden(Niet bij de reguliere medium te verwijderen).

2. Analyse van het differentiatievermogen neurosferen en ciliogenese Tests

  1. Om de differentiatie capaciteit te analyseren, het analyseren van de neurospheres onder klevende omstandigheden in differentiatie medium.
  2. Steriliseren 12 mm rond dekglaasjes autoclaaf of met UV-blootstelling voor gebruik. Voor een hechtende celkweek, zet een gesteriliseerde 12 mm rond dekglaasje in een putje van een plaat met 24 putjes onder steriele omstandigheden.
  3. Bekleden van het dekglas gedurende 10 s met 500 ui 0,002% poly-L-lysine (PLL). Aspireren de oplossing en drogen gedurende 10-15 minuten.
  4. Voeg 500 ul van laminine-oplossing (5 ug / ul). Incubeer de dekglas gedurende 1 uur bij 37 ° C.
  5. Zuig het laminine en voeg 500 ul van differentiatiemedium of NSC medium (ongedifferentieerde controle).
  6. Voor de differentiatie assay, pak een 100-200 urn bol met een 200 pi tip onder de microscoop. Toevoegen5-10 neurospheres aan elk putje van een 24-well plaat en cultuur voor 7-10 dagen in differentiatie medium.
  7. Om ongedifferentieerde neurospheres analyseren, voeg 5-10 neurospheres aan elk putje van een 24-well plaat en cultuur voor 1-2 dagen in NSC medium. Bevestigd neurosferen verspreiden en groeien als een monolaag (figuur 2B).
  8. Na zorgvuldige verwijdering van het medium, bevestig de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, en daarna wassen met PBS tweemaal gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De plaat kan 1-2 maanden worden bewaard bij 4 ° C.
    Opmerking: Om neurale stam / progenitorcellen in NSC medium en gedifferentieerde cellen in differentiatiemedium visualiseren Voer immunokleuring tegen Nestin (neurale stamcellen / voorlopercellen cel marker), β-tubuline III (TUJ1 monoklonaal neuronale merker), GFAP (glia fibrillair zuur eiwit , astrocyt marker) en O4 (oligodendrocyt marker) (Figuur 2B-E). Om de trilharen te analyseren, uitvoeren van immunokleuring tegen Arl13b (primair cilia marker) en Gpr161 (ciliaire GPCR) (figuur 3).
  9. Monteer het dekglaasje met montage oplossing op een glasplaatje. Kantel het objectglaasje om overmaat oplossing te verwijderen.

3. Analyse van ciliogenese in Neurosferen

  1. Aan cellen in intacte neurosferen geanalyseerd door immunokleuring breng 1 ml kweekmedium bevattende meervoudige neurosferen een 1,5 ml buis en spin neer op 500 xg gedurende 8 minuten. Bevestig de bolletjes met 4% (PFA) na verwijdering van het medium gedurende 15 minuten en wassen met PBS. Spin down bollen bij 500 xg gedurende 8 minuten, verwijder supernatant en incubeer de sferen O / N met 30% sucrose bij 4 ° C.
  2. Verwijder het supernatant onder gebruikmaking van een 1 ml tip en voeg 500 ul van oktober oplossing wordt een ondergrens 1 ml tip. Snijd de rand van het uiteinde van de opening groter naarmate oktober viskeus.
  3. Breng de oktober oplossing die de neurosferen in een wegwerp plastic bevriezing vorm (10 mm x 10 mm x 5 mm).
  4. Bevries de moud op droog ijs gedurende ten minste 15 min.
  5. (Optioneel) Stop het experiment en bewaar de schimmel in een -80 ° C vriezer gedurende 1 jaar.
  6. Snijd de secties met een cryostaat; de dikte van gedeelten moeten 15-30 urn.
  7. De primaire cilia in een neurosfeer visualiseren voeren immunokleuring tegen Arl13b (figuur 4).

4. Cultuur en Passage van Neurosferen en Adherent NSC

  1. Passage de neurospheres terwijl de bol grootte is tussen 100-200 urn; wanneer de neurospheres zijn te groot (300 micrometer of hoger), ze zijn niet ideaal voor experimenten.
  2. Breng de neurosferen in een 50 ml buis met een 1 ml tip en spin neer op 500 xg gedurende 8 minuten.
  3. Verwijder het supernatant met behulp van een zuigpomp, voeg 500 ul van 0,05% trypsine-EDTA in PBS en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C. De hoeveelheid trypsine afhankelijk van het aantal sferen.
  4. Voeg 500 ul serum medium en voorzichtig pipet 20 maal met 1 ml tip.
  5. Spin down bij 500 xg gedurende 8 minuten. Verwijder het supernatant onder gebruikmaking van een 1 ml tip en voeg 1 ml basismedium.
  6. (Optioneel) Als celafval of gedissocieerde neurosferen worden gezien, laat de cellen door een 70 urn cel zeef.
  7. Passage van de cellen in een schaal van 10 cm bij een dichtheid van 10.000 cellen / cm2 in NSC medium; de cellen klaar voor de volgende passage na een week zijn.
  8. (Optioneel) cellen in te vriezen, voeg invriesmiddel 500.000 tot 1.000.000 cellen / ml suspensie te genereren. Bevries de cellen met behulp van cryo invriezen containers; gedissocieerde neurosferen kunnen ook worden bevroren.
  9. De hechtende kweek, dillute de cellen 50.000 cellen / cm2 op PLL en laminine beklede dekglaasjes met NSC medium en kweek gedurende 1-2 dagen.

5. Honger en analyse van Cilia

  1. Bereid uitputtingsmedium (tabel 1).
  2. 1-2 dagen na de eerste plating hechtende cellen na dissociatie, wijziging NSC medium in een putje (controle) en uitputtingsmedium in een andere put (experiment).
  3. Kweek de hechtende cellen gedurende 24 uur.
  4. Fixeer de cellen met 4% PFA in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en tweemaal wassen met PBS gedurende 5 min elk bij kamertemperatuur.
  5. (Optioneel) Stop het experiment en bewaar de 24-wells platen met dekglaasjes in PBS bij 4 ° C gedurende 1-2 maanden.
  6. Uitvoeren van een protocol voor immunofluorescentie kleuring 7, 50.
  7. Monteer de dekglaasjes u aan een montage-oplossing. Droog het objectglaasje O / N bij kamertemperatuur in het donker.
  8. Acquire beelden op een samengestelde microscoop op de noodzakelijke vergroting. Gebruik een microscoop, een camera, en doelstellingen (40X / 1.3 olie- en 63x / 1,4 olie), geregeld met behulp van de meegeleverde software. Neem voldoende z-secties 0.5-0.8 urn intervallen (Figuur 5).
  9. Voor de kwantitatieve analyse van trilharen lokalisatie inhechtende cellen verwerven stapels beelden 3-8 opeenvolgende velden met confluente cellen door te kijken naar de DAPI kanaal. Kwantificeren van het aantal primaire cilia behulp ImageJ / Fiji. Typisch, gebruik dan de "Cell teller" tool in de ImageJ Plugins> Analyse dialoogvenster om de cellen met GPCR-positieve cilia te tellen; maximale projecties van stapels beelden kunnen ook van ImageJ / Fiji.Use gelijke beeldintensiteit en contrast parameters worden uitgevoerd voor alle beelden van hetzelfde experiment voor het tellen en export doeleinden.

6. Transfectie van Neurosferen

  1. Hechten gedissocieerde cellen dekglaasjes gedurende 24 uur. Gebruik een celdichtheid typisch tussen 75.000 en 150.000 cellen in 500 pl medium NSC in een enkel putje van een plaat met 24 putjes.
  2. Meng 25 pl verlaagde serum medium en 1,5 pl transfectiereagens in een 0,5 ml microbuisjes door wervelen gedurende 5 s.
  3. Voeg 2,5 ug endotoxine-vrij plasmide DNA aan een afzonderlijke 0,5 ml microtube bevattende 25 pl verminderde serum media en meng door vortexen gedurende 5 s.
  4. Voeg 1 ul van transfectiereagens tot de tweede microbuis die DNA en mengen door vortexen gedurende 5 s.
  5. Voeg het mengsel van het DNA-bevattende buis naar de eerste microbuisjes en meng door pipetteren.
  6. Incubeer het mengsel gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur. Na incubatie voorzichtig het transfectiemengsel druppelsgewijs toevoegen putjes bovenop de NSC medium (500 pl / putje).
  7. Verander het medium 24 h na transfectie met medium (NSC gemiddeld) of uitputtingsmedium (500 ul / putje) besturen.
  8. Fixeer de cellen door het veranderen van het medium tot 4% PFA na 24 uur en immunokleuring voeren; kenmerkend tot 10% transfectie efficiëntie verkregen met dit protocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na plating van de cellen van de SVZ in NSC medium voor een week, dreven neurosferen waargenomen (Figuur 2A). De afmetingen van de bolletjes varieerde tussen 50 en 200 urn. Te onderzoeken of de bolletjes werden afgeleid van neurale stam / progenitorcellen werden de neurosferen uitgeplaat op PLL en laminine beklede dekglaasjes in NSC medium gedurende 2 dagen. Zij werden vervolgens immunostained tegen de neurale stamcellen / voorlopercellen cel marker, Nestin. Twee dagen wa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een methode om te genereren en te onderhouden neurosphere culturen uit volwassen muis SVZ. Enkele relevant ten aanzien van de culturen zijn als volgt. Ten eerste, de afmetingen van de bolletjes zijn typisch tussen 50-200 urn. In onze ervaring, wanneer een neurosphere groter wordt dan 300 micrometer in diameter, is de optimale tijd voor passage gemist. Deze grotere bolletjes bevatten dode cellen in de kern. Ten tweede, als neurosferen algemeen worden gebruikt voor neurale stamcellen / voorlopercellen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk in S.M.'s laboratorium wordt gefinancierd door wervingssubsidies van CPRIT (R1220) en NIH (1R01GM113023-01).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12 mm round cover glassFisherbrand12-545-80 
24-well plateFalcon353047
4% paraformaldehyde (PFA)Affymetrix19943
50 mL tubeFalcon352098
95 mm x 15 mm petri dish, slippable lidFisherbrandFB0875714G10 cm dish
70 µm cell strainerFalcon352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-545-152Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody
Arl13B, Clone N295B/66NeuromabAB_11000053
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504001B27
CentrifugeThermo scientificST 40R
Cryogenic vialCorning430488
DAPISigmaD9542-10MG
Deoxyribonuclease I from bovine pancreaseSigmaD5025-15KUDnase I
Dimethyl sulfoxideSigmaD8418-100MLDMSO
Disposable Vinyl Specimen MoldsSakura Tissue-Tek Cryomold456510 mm x 10 mm x 5 mm
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell cultureSigmaD1408-500MLDPBS
Dumont #5 ForcepsFine science tools11254-20
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF9026-500ML
Fluoromount-G solutionSouthern Biotech0100-01mounting solution
GFAPDAKOZ0334
Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateThermoFisher ScientificA-21127Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody
Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateThermoFisher ScientificA-21137Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody
Gpr161home madeN/A
human bFGFSigmaF0291FGF
hemocytometerHausser Scientific0.100 mm deepimproved neubauer
IsothesiaHenry ScheinNDC 11695-0500-2Isofluorane
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membraneSigmaL2020Laminin
L-Glutamine (200 mM)SigmaG7513
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermoFisher ScientificL3000
Mr. FrostyNalgene 5100-0036
N-2 supplement (100X)ThermoFisher Scientific17502001N2
Neurobasal mediumGibco21103-049
Normal Donkey SerumJackson ImmunoResearch017-000-121
OCT compoundSakura Tissue-Tek4583OCT
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333-100ML
Poly-L-Lysine (PLL)SigmaP4707
Recombinant human EGF protein, CFR and D systems236-EG-200EGF
ScissorFine science tools14060-10
Superfrost plus microscope slideFisher scientific12-550-15slides
Triton X-100Bio-Rad161-0407
Trypsin-EDTA solution (10X)SigmaT4174-100Trypsin
COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, SterileCorning3471ultra-low binding 6-well plate
β-tubulin IIICovanceMMS-435PTUJ1

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet. 11, 331-344 (2010).
  3. Guemez-Gamboa, A., Coufal, N. G., Gleeson, J. G. Primary cilia in the developing and mature brain. Neuron. 82, 511-521 (2014).
  4. Louvi, A., Grove, E. A. Cilia in the CNS: the quiet organelle claims center stage. Neuron. 69, 1046-1060 (2011).
  5. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Scott, M. P. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium. Science. 317, 372-376 (2007).
  6. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437, 1018-1021 (2005).
  7. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152, 210-223 (2013).
  8. Hilgendorf, K. I., Johnson, C. T., Jackson, P. K. The primary cilium as a cellular receiver: organizing ciliary GPCR signaling. Curr Opin Cell Biol. 39, 84-92 (2016).
  9. Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol Biol Cell. 19, 1540-1547 (2008).
  10. Berbari, N. F., Lewis, J. S., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 4242-4246 (2008).
  11. Loktev, A. V., Jackson, P. K. Neuropeptide Y family receptors traffic via the Bardet-Biedl syndrome pathway to signal in neuronal primary cilia. Cell Rep. 5, 1316-1329 (2013).
  12. Marley, A., Choy, R. W., von Zastrow, M. GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk. PLoS One. 8, e70857(2013).
  13. Marley, A., von Zastrow, M. DISC1 regulates primary cilia that display specific dopamine receptors. PLoS One. 5, e10902(2010).
  14. Omori, Y., et al. Identification of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Primary Cilia and Their Possible Involvement in Body Weight Control. PLoS One. 10, e0128422(2015).
  15. Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 10335-10340 (2014).
  16. Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Res. 872, 271-275 (2000).
  17. Hildebrandt, F. .,,T. .,&K. atsanis,N. ., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364, 1533-1543 (2011).
  18. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  19. Badano, J. L., Mitsuma, N., Beales, P. L., Katsanis, N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 7, 125-148 (2006).
  20. Novarino, G., Akizu, N., Gleeson, J. G. Modeling human disease in humans: the ciliopathies. Cell. 147, 70-79 (2011).
  21. Brugmann, S. A., Cordero, D. R., Helms, J. A. Craniofacial ciliopathies: A new classification for craniofacial disorders. Am J Med Genet A. 152A (12), 2995-3006 (2010).
  22. Valente, E. M., Rosti, R. O., Gibbs, E., Gleeson, J. G. Primary cilia in neurodevelopmental disorders. Nat Rev Neurol. 10, 27-36 (2014).
  23. Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Curr Biol. 17, 1586-1594 (2007).
  24. Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J Clin Invest. 119, 428-437 (2009).
  25. Einstein, E. B., et al. Somatostatin signaling in neuronal cilia is critical for object recognition memory. J Neurosci. 30, 4306-4314 (2010).
  26. Wang, Z., Phan, T., Storm, D. R. The type 3 adenylyl cyclase is required for novel object learning and extinction of contextual memory: role of cAMP signaling in primary cilia. J Neurosci. 31, 5557-5561 (2011).
  27. Berbari, N. F., et al. Hippocampal and cortical primary cilia are required for aversive memory in mice. PLoS One. 9, e106576(2014).
  28. Han, Y. G., Alvarez-Buylla, A. Role of primary cilia in brain development and cancer. Curr Opin Neurobiol. 20, 58-67 (2010).
  29. Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nat Med. 15, 1062-1065 (2009).
  30. Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The Adult Ventricular-Subventricular Zone (V-SVZ) and Olfactory Bulb (OB) Neurogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 8, (2016).
  31. Shimada, I. S., LeComte, M. D., Granger, J. C., Quinlan, N. J., Spees, J. L. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke. J Neurosci. 32, 7926-7940 (2012).
  32. Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. eLife. 3, e02669(2014).
  33. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell stem cell. 3, 265-278 (2008).
  34. Pedersen, L. B., Mogensen, J. B., Christensen, S. T. Endocytic Control of Cellular Signaling at the Primary Cilium. Trends Biochem Sci. , (2016).
  35. Christensen, S. T., Clement, C. A., Satir, P., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of receptor tyrosine kinase (RTK) signalling. J Pathol. 226, 172-184 (2012).
  36. Clement, C. A., et al. TGF-beta signaling is associated with endocytosis at the pocket region of the primary cilium. Cell reports. 3, 1806-1814 (2013).
  37. Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
  38. Joiner, A. M., Green, W. W., McIntyre, J. C. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. J Neurosci. 35, 13761-13772 (2015).
  39. Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
  40. Peng, T., et al. Hedgehog actively maintains adult lung quiescence and regulates repair and regeneration. Nature. 526, 578-582 (2015).
  41. Rauhauser, A. A., et al. Hedgehog signaling indirectly affects tubular cell survival after obstructive kidney injury. Am J Physiol: Renal Physiol. 309, F770-F778 (2015).
  42. Chavez, M., et al. Modulation of Ciliary Phosphoinositide Content Regulates Trafficking and Sonic Hedgehog Signaling Output. Dev Cell. 34, 338-350 (2015).
  43. Lobo, M. V., et al. Cellular characterization of epidermal growth factor-expanded free-floating neurospheres. J. Histochem. Cytochem. 51, 89-103 (2003).
  44. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  45. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
  46. Nishino, J., Kim, I., Chada, K., Morrison, S. J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell. 135, 227-239 (2008).
  47. Shimada, I. S., Peterson, B. M., Spees, J. L. Isolation of locally derived stem/progenitor cells from the peri-infarct area that do not migrate from the lateral ventricle after cortical stroke. Stroke. 41, e552-e560 (2010).
  48. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
  49. Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, 2938-2944 (2008).
  50. Pal, K., et al. Smoothened determines beta-arrestin-mediated removal of the G protein-coupled receptor Gpr161 from the primary cilium. J Cell Biol. 212, 861-875 (2016).
  51. Caspary, T., Larkins, C. E., Anderson, K. V. The graded response to Sonic Hedgehog depends on cilia architecture. Dev Cell. 12, 767-778 (2007).
  52. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 17, 113-122 (2015).
  53. Berbari, N. F., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Lewis, J. S., Mykytyn, K. Hippocampal neurons possess primary cilia in culture. J Neurosci Res. 85, 1095-1100 (2007).
  54. Paridaen, J. T., Wilsch-Brauninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155, 333-344 (2013).
  55. Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 180, 897-904 (2008).
  56. Mukhopadhyay, S., et al. TULP3 bridges the IFT-A complex and membrane phosphoinositides to promote trafficking of G protein-coupled receptors into primary cilia. Genes Dev. 24, 2180-2193 (2010).
  57. Ishikawa, H., Marshall, W. F. Efficient live fluorescence imaging of intraflagellar transport in mammalian primary cilia. Methods Cell Biol. 127, 189-201 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

neurale stamcellenneurosfeerkweekciliabiogeneseciliair transportimmunokleuringARL13B markerGPR161 lokalisatiedissectie van de subventriculaire zoneconfocale microscopie

Gerelateerde artikelen