Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Inductie van een ontstekingsreactie in het jeugdwerk hepatocytenculturen van Muizen

9.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55319

⸱

10 maart 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Katz Family Drug Discovery Center and Division of Nephrology and Hypertension, Department of Medicine, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 2Department of Cell Biology and Anatomy, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier tonen wij een enzymatische benadering van primaire hepatocyten te isoleren van volwassen muizen, en beschrijven we de kwantificering van een ontstekingsreactie middels ELISA en real-time PCR.

Samenvatting

De lever speelt een beslissende rol in de regulering van systemische ontsteking. Bij chronische nierziekte in het bijzonder de lever reageert in reactie op de uremische milieu, oxidatieve stress, endotoxemie en verminderde klaring van circulerend proinflammatoire cytokinen door het produceren van een groot aantal acute fase reactanten. Experimentele instrumenten te bestuderen ontsteking en de achterliggende rol van hepatocyten zijn cruciaal voor de regulering en de bijdrage van hepatische cytokinen ze systemisch acute fase respons en langere pro-inflammatoire scenario, vooral in een ingewikkelde omgeving begrijpen zoals chronische nierziekte. Aangezien het bestuderen van complexe mechanismen van een ontsteking in vivo uitdagend blijft, resource-intensieve en meestal vereist het gebruik van transgene dieren, primaire geïsoleerde hepatocyten zorgen voor een robuust hulpmiddel om mechanistische inzicht te krijgen in de lever acutefasereactie. Aangezien dit in vitro techniek beschikt over een matige kosten, hoge reproduceerbaarheid en gemeenschappelijke technische kennis, geïsoleerde primaire hepatocyten kunnen ook gemakkelijk worden gebruikt als een screening aanpak. We beschrijven hier een enzymatische methode gebaseerd op primaire muizen hepatocyten te isoleren en beschrijven we de beoordeling van een ontstekingsreactie in deze cellen middels ELISA en kwantitatieve real-time PCR.

Inleiding

Chronische nierziekte (CKD) kan worden gedefinieerd als een toestand van acute en chronische ontsteking 1. Bij patiënten met CKD, serum niveaus van het hormoon phosphaturic fibroblast groeifactor 23 (FGF23) geleidelijk stijgen, om het serum fosfaat homeostase 2 te handhaven. Verhoogde serum niveaus FGF23 onafhankelijk geassocieerd met cardiovasculaire morbiditeit en mortaliteit bij patiënten die beginnen hemodialysebehandeling 3, 4. Bovendien hebben verschillende klinische studies aangetoond een sterke correlatie tussen verhoogde niveaus FGF23 en serum niveaus van C-reactief proteïne (CRP), interleukine-6 (IL-6) en tumornecrosefactor α (TNFa) 5, 6. Bovendien is in een experimentele studie werd onlangs aangetoond dat FGF23 direct richten hepatocyten en een ontstekingsreactie door het verhogen CRP en IL-6 p veroorzakenroduction in de lever 7. Daarom FGF23 kan fungeren als een circulerende factor die bijdraagt ​​aan systemische ontsteking in CKD.

In de vroege jaren '70, de primaire hepatocyten werden geïsoleerd en bestudeerd voor de eerste keer 8. Sindsdien primair gekweekte levercellen zijn uitgebreid gebruikt metabolische verwerking, hormonale functie, metabolisme en toxiciteit en immuniteit en ontstekingsreacties 9 onderzoeken 10. Vorige protocollen zijn voornamelijk de enzymatische isolatie van primaire hepatocyten uit menselijk leverweefsel 11, 12. Terwijl een uitstekend model, laat dit uit de mogelijkheid om te onderzoeken hoe genetische manipulatie beïnvloedt complex lever signalering mechanismen evenals functionele gevolgen op verschillende soorten stimuli. Hieronder beschrijven we de isolatie van muizen hepatocyten. Met name kan het effect van verschillende mediatoren van de hepatische acute fase respons, zoals lipopolysaccharide (LPS), IL-6 en FGF23 worden geanalyseerd op een gemakkelijke, snelle en reproduceerbare wijze 13.

Hierin presenteren we een protocol voor de enzymatische isolatie van hepatocyten van volwassen muizen, en we tonen aan dat vastgesteld inductoren van ontsteking, zoals LPS en IL-6, alsook nieuwe ontstekingsmediatoren zoals FGF23 rechtstreeks expressie en uitscheiding van kunnen stimuleren inflammatoire cytokines, zoals CRP en IL-6 in gekweekte hepatocyten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dieren protocollen en experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Miami Miller School of Medicine.

1. Voorbereiding

  1. Verwarm leverperfusie media en lever verteren media in een waterbad bij 37 ° C.
  2. Stel een perfusie pomp (30 ml / min). Zorgvuldig Prefill de slang systeem van de pomp met leverperfusie media. Vermijd luchtbellen in het systeem en de voorbereiding van de stereotactische microscoop.
  3. Coat celcultuurschalen middels collageen type I volgens het protocol van de fabrikant.

2. Lever Recovery

  1. Verdoven van de donor muis met behulp van zuurstof / isofluraan inhalatie (isofluraan 4% / 2 L / min zuurstof).
    1. Handhaaf anesthesie door verlaging isofluraan 2-2,5% of door injectie van ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht intraperitoneaal) en xylazine (10 mg / kg lichaamsgewicht intraperitoneally). Continue isofluraan anesthesie voorkeur aangezien ketamine verlaagt de bloeddruk en hepatotoxiciteit veroorzaken.
  2. Plaats de verdoofde muis op een absorberend kussen. Bevestig de ledematen van de muis met plakband.
  3. Scheer en desinfecteer de buik van de muis en het uitvoeren van een ventrale laparotomie van het schaambeen naar de craniale rand van de lever met behulp van chirurgische schaar met scherpe / stompe uiteinden. Incise de buikwand aan beide zijden, staart van het middenrif.
  4. Expose de vena cava inferior (IVC) door voorzichtig het verplaatsen van de darm naar de rechterkant. ontleden zorgvuldig vetweefsel rond de IVC met behulp van steriele wattenstaafje swabs en schuine tip tang.
  5. Incise de suprahepatic diafragma en open de borstholte door twee laterale incisies met behulp van fijne chirurgische schaar met scherpe / scherpe tips. Afbinden de thoracale IVC met behulp van chirurgische zijde (5/0).
  6. Canule de infrarenale IVC met behulp van een afgeschermde iv catheter, verwijder voorzichtig de naald,sluit de perfusie pomp en start perfuseren de lever. Als dit goed wordt uitgevoerd, moet de lever onmiddellijk beginnen te blancheren en deining.
  7. Doorsnijden de poortader zodat geschikte afvoer van bloed en perfusie media met behulp van fijne chirurgische schaar.
  8. Perfuseren van de lever, waarbij ongeveer 30 ml leverperfusie media, en dan overschakelen naar de lever te verteren media (30 ml). Schakel de perfusie pomp en verwijder de canule eenmaal perfusie is voltooid.
  9. Voorzichtig bloot de centrale regio van de lever en zoek het bindweefsel tussen de lever lobben. Pak de centrale aansluiten van vezels en zorgvuldig te ontleden alle weefsels die de lever op zijn plaats en verwijder voorzichtig de lever.
  10. Onmiddellijk over de lever in een 50 ml polypropyleen conische buis met 15 ml lever verteren media.
    NB: Er is geen specifieke tijd-lijn voor deze stap. Na perfusie, de lever blijft digest media voor het transport naar een steriele celkweek kap. alle subsequent stappen moeten worden uitgevoerd in een steriele omgeving.

3. Isolatie en behandeling van Cellen

  1. Binnen een celkweek kap, overdracht van de lever van de 50 ml polypropyleen conische buis met de spijsvertering media in een steriele weefselkweek schotel.
  2. Met behulp van een steriel pincet voorzichtig scheur de vier lobben van de lever. Als dit goed wordt uitgevoerd, moet de spijsvertering medium troebel worden als gevolg van het isoleren van hepatocyten uit de lever.
  3. Met behulp van een 25 ml steriele pipet tip, filter instellen voor het troebele spijsvertering medium door een 70 um nylon cel zeef in een nieuwe 50 ml polypropyleen conische buis om onverteerd weefsel deeltjes en celresten te verwijderen.
  4. Herhaal de stappen 3,2 en 3,3 met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Dit helpt bij het verwijderen van eventueel resterend hepatocyten van de lever.
  5. Centrifugeer bij 50 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant bevattende overmaat celafval en voorzichtig resuspendeer cellen in 25 ml koude 1xWilliams 'Medium E.
  6. Met behulp van een 25 ml steriele pipet tip, filter instellen voor het re-suspensie door een nieuwe 70 um nylon cel zeef in een 50 ml polypropyleen conische buis aan een schoner schorsing te bereiken.
  7. Herhaal stap 3.5 en 3.6 voor drie extra wassingen met koud Williams 'Medium E 1x tot een duidelijker cel suspensie te verkrijgen.
  8. Na de laatste wasstap, aspiraat supernatant overtollige celresten te verwijderen. Re-schorten en filter cellen in 25 ml warm Williams 'Media E 1x dat de primaire hepatocyt ontdooien en plating supplementen bevat door een nieuwe 70 um nylon cel zeef in een 50 ml polypropyleen conische buis.
  9. Aantal cellen in de 25 ml celsuspensie met een hemocytometer. Gemiddeld verwachten 15-20000000 cellen per volwassene lever. Bepaal de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van trypan blauw kleuring.
  10. Plaat cellen in 2 ml Williams 'Media E 1x dat primaire hepatocyten ontdooien en uitplaten supplementen op een collageen beklede 6-well ce bevatcultuur cluster II (9 x 10 5 cellen per well).
  11. Na 4 uur, veranderen media om Williams 'Media E 1x dat de primaire hepatocyten onderhoud supplementen bevat.
  12. Na 24 uur serum verhongeren cellen met Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) media 1x gedurende 6 uur.
  13. Behandel de cellen met PBS als drager, FGF23 (25 ng / ml), LPS (100 ug / ml) of IL-6 (50 ng / ml) in serumvrij medium en incubeer gedurende 24 uur.

4. Isolatie van RNA

  1. Bereid RNA onder toepassing van een commerciële spin kolom kit volgens instructies van de fabrikant.

5. Het genereren van cDNA uit geïsoleerde RNA door reverse transcriptie

  1. Voeg 200 ng van geïsoleerde RNA-monster van een PCR-buis.
  2. Voeg 14 ul van endonuclease-vrij H2O tot PCR-buis van stap 5,1.
  3. Voeg 4 pi van reverse transcriptase PCR-buis van stap 5,1.
  4. Re-schorten inhoud zachtjes om mengsel homogeen te maken; centrifuge voorzichtig.
  5. Plaats PCR buis met het mengsel in een thermocycler. Run thermocycler voor reverse transcriptie: 1 cyclus van 25 ° C (5 min), 42 ° C (30 min), 85 ° C (5 min) en houdt bij 4 ° C. Het eindproduct zal het gewenste cDNA zijn.

6. Analyse van de cellen door kwantitatieve real-time PCR (qPCR)

  1. Bereid de 96-well plaat.
    1. Plaats alle componenten van qPCR reactie op ijs: 1 pi cDNA, 0,25 pM forward primer, 0,25 uM reverse primer, 5 pi SYBR Green, 3,5 pl PCR kwaliteit water tot een totaal volume van 10 pi. Met behulp van SYBR Green, voor te bereiden master mix aan alle monsters lopen in drievoud.
    2. Zodra de master mix is ​​voltooid, vortex homogene maken. Aliquot 9 pi van qPCR master mix in elk putje van een 96-wll plaat. Na voorzichtig voeg 1 pi van cDNA in elk putje. Totaal reactievolume wordt 10 ul worden.
    3. Na het laden is voltooid, sluit 96-well plaat met optischekleeffolie en kort centrifugeer 96 putjes (50 x g gedurende 1 min).
  2. Run monsters in een Real Time-PCR-instrument. Plaats verzegelde 96-well plaat in Real Time-PCR-instrument en lopen monsters per instrument aanbevelingen van de fabrikant. Voorbeelden van standaard en snelle cycli zijn hieronder opgenomen.
    1. Voor standaard cyclusparameters Gebruik de volgende: initiële denaturatie bij 94 ° C gedurende 120 s, vervolgens 40 cycli van 94 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 60 s, en vervolgens eventueel houden op 4 ° C.
    2. Voor snelle cyclusparameters: Gebruik de volgende: initiële denaturatie bij 94 ° C gedurende 30 seconden, vervolgens 40 cycli van 95 ° C gedurende 5 s, 58 ° C gedurende 15 s, en vervolgens 72 ° C gedurende 10 s.
  3. Raadpleeg instrument handleiding voor aanwijzingen over hoe om gegevens te analyseren.

7. Analyse van celsupernatanten met ELISA

Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant.

  1. monstervoorbereiding
    1. Verdeel 398 ul verdunningsmiddel in afzonderlijke buisjes. Pipetteer 2 pi van de cel supernatant monster in de buis 398 pi verdunningsmiddel. Dit zal een verdunning van 200 maal verschaffen.
    2. Herhaal stap 7.1.1 voor elk te testen monster.
  2. Procedure
    1. Pipetteer 100 ul van 200-voudig verdunde monster en standaard in de putjes van een 96-wells plaat.
    2. Incubeer de 96-well plaat bij 25 ° C gedurende 45 min op een microplaat schudinrichting bij 150 rpm.
    3. Was de putjes 5 keer met 1x wasbuffer oplossing. Zodra de laatste wasbeurt is voltooid, verwijdert u alle resten van het wassen oplossing met absorberend papier.
    4. Voeg 500 ul HRP-conjugaat reagens in elk putje.
    5. Herhaal stap 7.2.2 - 7.2.3.
    6. Pipetteer 100 ul van tetramethylbenzidine (TMB) reagens aan elke well van 96-well plaat.
    7. Meng 96-puts plaat bij 25 ° C gedurende 20 min op een microplaatschudinrichting bij 150 rpm. Stop de reactie door het direct toevoegen van 100 pl stopoplossing aan elk putje en meng voorzichtig. Zodra de stopoplossing toegevoegd moet de kleur geel. Dit meldt dat de stop oplossing correct is gemengd.
    8. Met behulp van een microtiter plaatlezer, de extinctie bij 450 nm in de eerste 5 minuten.
  3. Berekening van de resultaten
    1. Berekenen een tabel van de gemiddelde absorptiewaarden (A 450) voor elk monster en elke standaard.
    2. Monteer een standaard kromme door het uitzetten van de gemiddelde A450 van elke standaard tegen de standaardconcentratie in ng / mL op een lineaire grafiek. Laat de x-as de concentratie en de y-as A 450 waarden vertegenwoordigen vertegenwoordigen.
    3. Gebruik makend van de gemiddelde A450 van elk verdund monster, het gehalte aan het gewenste eiwit in mg / ml van de standaard curve.
    4. Vermenigvuldig het monster concentratie door de verdunning factor. Dit maakt de bepaling van de werkelijke concentratie van het gewenste eiwit in de cel supernatant monster.
    5. Plot de geconstrueerde tafel uit monsters in een lijngrafiek. Als OD 450-waarden buiten de standaardkromme vallen, moeten de monsters op geschikte wijze worden verdund en opnieuw getest.
    6. Normaliseren resultaten 500.000 cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

histologie

Vertegenwoordiger lichtmicroscopie beelden van primaire geïsoleerde en gekweekte cellen zijn weergegeven in figuur 1A. Immunocytochemische analyse toont dat afzonderlijke hepatocyten sterk tot expressie albumine (rood) en fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) (groen). Kernen zijn gekleurd met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blauw). (Figuur 1B).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het isoleren van primaire hepatocyten van muizen is een snel, goedkoop en betrouwbaar hulpmiddel om ontstekingsreacties ex vivo te bestuderen. Indien correct uitgevoerd, kunnen de resultaten eenvoudig worden gegenereerd en gereproduceerd op een tijdige en kostenefficiënte manier. De volgende punten moet zorgvuldig worden beoordeeld met het oog op een succesvolle isolatie te waarborgen.

De chirurgische incisie en de canule van het IVC moet worden uitgevoerd onder algemene verdoving e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH (R01HL128714 CF) en (F31DK10236101 KS) en de American Heart Association (CF AG).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Verbruiksartikelen
Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainerFalcon352350
BD Insyte AutoguardBD381412
50 mL Polypropylene Conical TubeFalcon352098
100 6-inch Cotton Tipped Applicators Puritan806-WC
1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2Becton Dickinson329420
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm StyleCorning353003
6 well Cell Culture ClusterCostar3516
5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards)LOOKSP115
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Apparatuur
Minipuls 3 Perfusion PumpGilsonF155007
Hemacytometer Kits, PropperVWR48300-474
Hemacytometer Cover Glasses, PropperVWR48300-470
Surgical Scissers - Sharp/BluntF.S.T.14001-12
Iris Scissors-ToughCut StraightF.S.T.14058-11
Dumont SS-45 ForcepsF.S.T.11203-25
Student Tissue ForcepsF.S.T.991121-12
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagentia
Acetic acid solution, 2.0 NSigma    A8976-100ML
Isoflurane, USP 250 mLPiramal Healthcare   66794-013-25
KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL)VEDCO    50989-161-06
Xylazine 100 mg/mLAnaSed Injection139-236
Willams' Medium E (1x)gibco12551-032
Liver Perfusion Medium (1x)gibco17701-038
Liver Digest Medium (1x)Life Technologies17703034
Primary Hepatocyte Thawing and Plating SupplementsLife TechnologiesCM3000
Primary Hepatocyte Maintenance SupplementsLife TechnologiesCM4000
Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4ThermoFisher scientific10010031
Collagen Type 1Corning354236
Trypan Blue SolutionVWR45000-717

Referenties

  1. Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
  2. Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
  3. Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
  4. Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
  5. Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
  6. Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885(2015).
  7. Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
  8. Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
  9. Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
  10. Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
  11. Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
  12. Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
  13. Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
  14. Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
  15. Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
  16. Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
  17. Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
  18. Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Isolatie van primaire hepatocytenmurine hepatocytenkweekbeoordeling van de ontstekingsresponsELISA cytokine detectiekwantitatieve real time PCRLPS behandelingsprotocolFGF23 stimulatieIL6 expressieanalysemeting van CRP secretiemethode voor hepatocytenuithongering
Inductie van een ontstekingsreactie in het jeugdwerk hepatocytenculturen van Muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.