Dit protocol beschrijft cloaca massage, een niet-invasieve handmatige techniek voor het verzamelen van sperma van vogels, en DNA-extractie van aviaire-sperma met behulp van een commerciële winning kit met wijzigingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Aviaire-sperma door cloaca Massage en isolatie van DNA van sperma
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Van sperma kan nuttig zijn voor een breed scala aan toepassingen waaronder studies waarbij kwaliteit van het sperma, sperma telomeer dynamiek en epigenetica. Vogels zijn gebruikte onderwerpen in biologisch onderzoek en zijn ideaal voor studies waarbij herhaalde spermastaaltje. Er zijn echter weinig middelen momenteel beschikbaar voor diegenen die willen leren hoe te verzamelen en DNA halen uit aviaire-sperma. Hier beschrijven we cloaca massage, een zachte, niet-invasieve handmatige techniek voor het verzamelen van aviaire-sperma. Hoewel deze techniek is gevestigd in de literatuur, kan het moeilijk zijn om te leren van de beschrijvingen van de beschikbare. We bieden ook informatie voor de extractie van DNA van aviaire-sperma met behulp van een commerciële winning kit met wijzigingen. Cloaca massage kan gemakkelijk worden gebruikt op elke kleine tot middelgrote mannelijke zangvogels reproductieve voorwaarde. Na collectie, het sperma kan worden onmiddellijk gebruikt voor beweeglijkheid testen of bevroren voor DNA-extractie volgens het protocol hierin beschreven. Dit extractie-protocol werd verfijnd voor aviaire-sperma en met succes heeft geweest tweedehands voort monsters verzameld uit verschillende uit de orde zangvogels soorten (Passer domesticus, Spizella passerina Haemorhous mexicanusen Turdus migratorius ) en een columbid (Columba livia).
Inleiding
Vogels zijn ideale onderwerpen voor studies waarbij kwaliteit van het sperma en competitie1, sperma telomeer dynamics2epigenetica3en soortgelijke onderwerpen, zoals ze veel in biologisch onderzoek gebruikt worden en sperma kan gemakkelijk worden bemonsterd met behulp van cloaca Massage. Cloaca massage is een zachte, niet-invasieve handmatige techniek voor het verzamelen van sperma van vogels4,5,6. Herhaalde monsters kunnen gemakkelijk worden verkregen en geen speciaal gereedschap nodig, waardoor het eenvoudig uit te voeren in het veld of het lab zijn. Hoewel cloaca massage al decennialang gebruikt, is het moeilijk om te leren van de beschikbare geschreven beschrijvingen. Deze publicatie is bedoeld om de tijd en de onzekerheid die betrokken zijn bij het leren van de cloaca massage.
Sperma van dieren met behulp van cloaca massage kan worden onmiddellijk gebruikt voor motiliteit beoordeling4,7 of8van de kunstmatige inseminatie, of bevroren voor andere toepassingen zoals geavanceerde imaging en DNA-extractie. Sperma monsters van zangvogels zijn klein maar bevatten dichtbevolkte vol sperma. DNA wordt geëxtraheerd met behulp van een commerciële winning kit voor eenvoud, met wijzigingen aan het overwinnen van de speciale beschermende functies van sperma9. Na extractie, kunnen sperma telomeren worden gemeten met behulp van qPCR10.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol omvat gewervelde dieren onderwerpen en is goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) in North Dakota State University.
1. sperma uit een zangvogel met behulp van cloaca massage
Opmerking: Cloaca massage is een effectieve sperma collectie techniek op reproductief actieve vogels alleen, maar kan met succes worden uitgevoerd buiten het broedseizoen in passende gevangenschap situaties. Reproductieve activiteit moet worden bepaald voor de doelsoort voorafgaand aan het gebruiken van cloaca massage. Deze techniek kan worden gebruikt op wilde vogels op vangen of in gevangenschap gehouden vogels.
- Beginnen met een mannelijke vogel, (in de fokkerij voorwaarde) bander van grip in de niet-dominante hand, de vogel aan de dominante hand Pipetteer met behulp van de ventrale zijde aanraken van de palm (Figuur 1).
- Zorg ervoor dat de kop van de vogel die het dichtst bij de laterale rand van de palm. Licht de hoofd en lichaam met behulp van de pinky, ring en middelste vingers te beveiligen. Dit laat van de vogel vent en staart blootgesteld.
- Laat van de vogel benen los of licht ingetogen met behulp van de palm.
Figuur 1 : Grip voor cloaca massage. De vogel is licht in de dominante hand beveiligd met de ventrale zijde de palm en het hoofd beveiligd door de pinky-vinger aanraken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Plaats de dominante wijsvinger en duim aan weerszijden van het superieure einde van de cloaca en de vingers licht samen te knijpen tijdens het toepassen van zeer lichte druk richting de staart ( Figuur 2). De cloaca zal evert, bloot de cloaca mucosa (roze interieur).
Opmerking: Als de vogel niet is momenteel de productie van sperma, de cloaca uitsteeksel kunnen klein en de cloaca is moeilijk te evert. Met ervaring is het gemakkelijk om te differentiëren tussen de cloacas van reproductief actieve en inactieve mannetjes5,11.
Figuur 2 : Vinger positie en cloaca uitsteeksel. Evert de cloaca door lichte druk op het superieure einde (A) te passen. In een reproductief actieve mannelijke zangvogel, de cloaca uitsteeksel is duidelijk en firma (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Plaats het pad van de wijsvinger aan de dorsale zijde van de voet van de staart te stabiliseren van de hand met de niet-dominante hand, en plaats dan het topje van de duim net onder de everted cloaca.
Opmerking: Een kort en glad miniatuur is gunstig voor het uitvoeren van cloaca massage en beschermt de vogels tegen accidentele schade. - Verplaats de niet-dominante duim diep en cranially in een herhaalde motie met gemiddelde druk, verblijf van minder dan de cloaca. Totdat de vogel ejaculeert. Afhankelijk van het individu duurt dit meestal tussen de 1 en verscheidene dozijn slagen.
- Zodra de vogel ejaculeert, verzamelen het sperma in de buis van een microhematocrit. Herhaal cloaca massage om meerdere ejaculeert.
Opmerking: Uit de orde zangvogels sperma is licht bruin en heeft meestal een ietwat dikke consistentie. Witte of donkere stoffen uitgeworpen uit de cloaca zijn geen sperma, en het sperma monster kunnen besmetten. Het uiterlijk van een kleine hoeveelheid bloed op de cloaca of gemengd in met het sperma wordt meestal veroorzaakt door teveel druk tijdens de massage. - Voor DNA-extractie, plaatst u het sperma in de buis van een microcentrifuge met 20 µL van 1 x PBS (pH 7.4). Opmerking: Sperma opgeslagen in 1 x PBS is niet geschikt voor kunstmatige inseminatie, maar kan worden gebruikt voor DNA-extractie op een later tijdstip wanneer opgeslagen bij-80 ° C. De PBS kan kamertemperatuur of gekoeld, maar moet in een vloeibare toestand wanneer het sperma monster wordt gestort.
- De aanwezigheid van sperma in de steekproef bevestigen door het bekijken van een kleine hoeveelheid van het verdunde monster onder een samengestelde microscoop (Figuur 3).
- Bewaar het verdunde sperma bij-80 ° C tot extractie.
2. extractie van DNA van sperma van de vogel
Opmerking: Dit protocol is ook getest met meerdere commerciële DNA-extractie kits, maar het is alleen geslaagd wanneer gebruikt in combinatie met een DNA-kit12. Stappen die zijn gewijzigd van het kit-protocol worden aangegeven met *.
- Bereid een 1 M-oplossing van dithiothreitol (DTT) in water en meng met behulp van een vortex.*
- Aliquot de DTT-oplossing en opslaan bij-20 ° C tot vlak voor gebruik. Elk monster moet worden geëxtraheerd vereist 10 µL van 1 M DTT solution.*
- Bereiden van een buffer met 20 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; en 4% SDS. Elk monster moet worden geëxtraheerd vereist 90 µL van dit buffer.*
- Bewaar de buffer bij kamertemperatuur. Als het heeft neergeslagen, warm het op 56 ° C tot dissolve.*
- Verwarm een broedmachine met een rocker of shaker tot 65 ° C.*
- Onmiddellijk voordat u begint de winning, meng 10 µL DTT oplossing met 90 µL van de buffer die is bereid in stap 2.2 voor elk monster moet worden geëxtraheerd, bijvoorbeeld 900 µL buffer plus 100 µL DTT oplossing als 10 monsters wilt uitpakken. Dit mengsel zal worden zogenaamde DTT-buffer.*
- Voeg 70 µL 1 x PBS aan het gehele verdunde sperma monster en meng goed met behulp van een vortex.*
- Voeg 100 µL DTT-buffer en 10 µL proteïnase K oplossing van het monster. Vortex gedurende 20 seconden, incubeer vervolgens in de voorverwarmde incubator voor 1 uur op een rocker of shaker.*
- Voeg toe 200 µL buffer AL en 200 µL verse EtOH (100%) en vortex voor 20 seconds.*
- Het gehele monster overbrengen in een spin kolom samen en centrifugeer 1 minuut bij 6.000 x g. negeren de collectie buis.
- Plaats van de kolom op een nieuwe buis en voeg 500 µL bereid buffer AW1. Centrifugeer 1 minuut bij 6.000 x g. negeren de collectie buis.
- Plaats van de kolom op een nieuwe buis en voeg 500 µL bereid buffer AW2. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 6.000 x g. negeren de doorstroming en plaats de kolom terug op de buis.
- Centrifugeer 3 minuten op 20.000 x g. negeren de collectie buis en plaats van de kolom op een 1,5 mL microcentrifuge buis.
- Pipetteer 35 µL van AE buffer rechtstreeks op het membraan van de kolom en Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 minutes.*
- Centrifugeer 1 minuut bij 14.000 x g. Gooi de spin kolom en opslaan van geëxtraheerde monsters bij-80 ° C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Cloaca massage en DNA extractie met behulp van die het protocol beschreven heeft verricht voor verschillende uit de orde zangvogels soorten en een columbid (tabel 1). De aanwezigheid van zaadcellen in sperma monsters verzameld door cloaca massage werd bevestigd door het bekijken van een kleine hoeveelheid van de verdunde monsters onder een samengestelde microscoop op 400 X vergroting (Figuur 3). Na extractie van DNA van sperma monsters verzam...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Beschrijven we een eenvoudige en betrouwbare methode voor het verzamelen van sperma van kleine en middelgrote zangvogels reproductief actieve toestand en extractie van DNA van aviaire-sperma.
Het protocol van de extractie van het DNA van omschreven sperma is aangepast ten opzichte van een kit voor eenvoud, maar werd verfijnd voor gebruik op aviaire-sperma. Sperma resistent zijn tegen lysis door standaard extractie chemicaliën9,13, en s...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Wij danken Jose Noguera voor vroege hulp bij cloaca massage, en Jeffrey Kittilson voor lab ondersteunen. Dit werk werd gesteund door een award ND EPSCoR FAR0022429 te BJH. Publicatiekosten waren genereus ondersteund door de NDSU afdeling biologische wetenschappen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Microhematocrit capillaire buizen | Fisherbrand | 22-362566 | Elke leverancier kan worden gebruikt. Kleinere buizen kunnen effectiever zijn voor het verzamelen van kleine zaadmonsters, zoals van zeer kleine zangvogels zoals de chipping sparrow. |
| Microcentrifugebuizen | Elke | ||
| 1x PBS | Elke | Gebaat voor het bewaren van zaadmonsters voorafgaand aan DNA-extractie. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Elke leverancier kan worden gebruikt. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Elke leverancier kan worden gebruikt. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Elke leverancier kan worden gebruikt. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Elke leverancier kan worden gebruikt. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit wordt specifiek aanbevolen. Dit DNA-extractieprotocol is geprobeerd met andere commerciële kits, maar met weinig succes. De redenen hiervoor zijn ons onbekend. |
Referenties
- Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
- Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
- Carrell, D. T. Epigenetics of the male gamete. Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).
- Burrows, W. H., Quinn, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).
- Wolfson, A. The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds. Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).
- Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment. The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).
- Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus. Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).
- Purchase, C. F., Earle, P. T. Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data. J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).
- Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. Forensic application of DNA 'fingerprints'. Nature. 318 (12), 577-579 (1985).
- Criscuolo, F., et al. Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres. J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).
- Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , Wiley-Blackwell, Princeton University Press. ISBN 9781118291047 (2016).
- QIAamp DNA Micro Handbook. , Third edition (2014).
- Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).
- Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler. Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).
- Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds. Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).
- Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates). Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).
- Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species. J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
