Het analyseren van de celoppervlakadhesie remodeling in reactie op mechanische spanning met behulp van Magnetic Beads

Samenvatting

Celoppervlak verklevingen staan ​​centraal in mechanotransductie, omdat ze mechanische spanning verzenden en inleiding van de signaalwegen die betrokken zijn in het weefsel homeostase en ontwikkeling. Hier presenteren we een protocol voor het ontleden van de biochemische routes die worden geactiveerd in reactie op de spanning, onder toepassing van ligand beklede magnetische microkralen en krachtuitoefening adhesie receptoren.

Samenvatting

Mechanosensitieve celoppervlak adhesie complexen laat cellen om de mechanische eigenschappen van hun omgeving detecteren. Recente studies hebben zowel force sensing moleculen aan adhesieplaatsen en kracht-afhankelijke transcriptiefactoren die lijn genexpressie reguleren en rijden fenotypische uitkomsten van. Echter, de signalering netwerken omzetten van mechanische spanning in biochemische routes bleef ongrijpbaar. Om de signaalwegen betrokken bij mechanische spanning aangebracht op het celoppervlak receptor te verkennen, kan superparamagnetische microkralen worden gebruikt. Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van magnetische korrels krachten toepassing celoppervlak adhesie-eiwitten. Met deze aanpak kan men niet alleen kracht-afhankelijke cytoplasmatische signaleringsroutes door verschillende biochemische benaderingen, maar ook adhesie remodellering onderzoeken door magnetische isolatie van adhesie complexen aan de ligand-gecoate kralen. Dit protocol omvat de bereiding van ligand-coated superparamagnetische delen en de toepassing van vast trekkrachten gevolgd door biochemische analyses. Daarnaast bieden wij een representatieve steekproef van gegevens die aantonen dat de spanning toegepast op-integrine gebaseerde adhesie triggers hechting renovatie en verandert eiwittyrosinefosforylatie.

Inleiding

In metazoen, mechanische spanning regisseert weefsel ontwikkeling en homeostase door middel van de regulering van een groot aantal cellulaire processen zoals proliferatie, differentiatie en overleving ^{1, 2.} Mechanische spanning kan ontstaan ​​uit de extracellulaire matrix of kunnen worden gegenereerd door hechtende cellen, welk monster de extracellulaire omgeving via actomyosine contractiele machinerie die trekt op extracellulaire matrix en sondes zijn stijfheid met spanningsgevoelige moleculen. In reactie op spanning mechanosensitieve adhesieproteïnen ondergaan conformationele veranderingen die complexe signalering cascades activeren. In reactie op deze signaalwegen orkestreren een mechanoresponse omvat proliferatie, differentiatie en overleving dat de cellulaire gedrag de extracellulaire omgeving aanpast. Dergelijke processen kunnen worden geregeld in een korte tijd (seconden tot minuten) om snel terug te voeren op de lus van mecha notransduction door aanpassing van de mechanosensitieve structuren. Bijvoorbeeld integrine-gebaseerde adhesies versterken als reactie op spanning door middel Rho GTPase-gemedieerde cytoskelet remodeling ^{3, 4, 5.} Tegelijkertijd worden ook andere signaleringsroutes geactiveerd via uren en dagen van genetische programma's die uiteindelijk van invloed zijn cel lot ⁶ beheersen. Dat, hebben vele studies de effecten van Matrix stijfheid op mobiele determinisme en ziekteontwikkeling ^{1, 2} gemarkeerd, de precieze moleculaire mechanismen van adhesie gemedieerde mechanotransductie nog steeds ongrijpbaar.

Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om de effecten van cel optredende krachten of uitwendige krachten op celgedrag, waaronder stroomsystemen, fluorescentie-energieoverdracht (FRET) -tension sensors ^{7 bestuderen}lass = "xref"> 8, compliant substraten ^9, magnetische pincet, optisch pincet ¹⁰ en atomic force microscopie (AFM) ^11. Hier presenteren we een protocol gebruiken superparamagnetische kralen mechanotransductie pathways te karakteriseren als reactie op trekkrachten toegepast op specifieke adhesiereceptoren. Superparamagnetische deeltjes die reversibel magnetiseren wanneer geplaatst in een magnetisch veld. Eenmaal bekleed met een ligand voor een bepaalde receptor, deze kralen een krachtig hulpmiddel om de effecten van extracellulair krachtuitoefening bestuderen. Deze methode is gevalideerd door verscheidene studies ^{3, 5, 12-17} en brengt het voordeel van biochemische analyse van hechtende cellen grotendeels vergemakkelijken. Met soortgelijk met collageen beklede magnetische korrels gevolgd door biochemische analyse, vroege werk rapporteerde een stijgingeiwittyrosinefosforylatie en RhoA activatie als reactie op spanning ^{5, 18, 19.} De hieronder beschreven methode is ook gebruikt met fibronectine (FN) beklede kralen om de signaalwegen stroomafwaarts karakteriseren van spanning toegepast integrinen ^3. In deze studie GUILLUY et al. toonde aan dat de spanning activeert RhoA door de werving van de twee guanine nucleotide uitwisseling factoren (GEFs), LARG en GEF-H1, naar integrine adhesie complexen. Sindsdien hebben andere studies aangetoond dat GEF-H1 is aangeworven om adhesie complexen in reactie op cel gegenereerde spanning op verschillende manieren ^{20, 21,} waaruit de robuustheid van de hier beschreven methode. Dientengevolge werd geactiveerd RhoA aangetoond hechting versterking bevorderen door cytoskelet remodeling. Dit systeem werd ook gebruikt om staand spanning wordt toegepast to cel / cel adhesie receptoren. Toepassing van krachten op magnetische bolletjes gecoat met het extracellulaire domein van E-cadherine-geïnduceerde verhoging van vinculin recruitment soortgelijke integrine geassocieerd hechting complexen ^12. Collins en collega's opgemerkt dat de toepassing van spanning op PECAM-1 bevordert integrine en RhoA activeren ^13. Een andere experimentele aanpak met behulp van magnetische bolletjes is de studie van de spanning toegepast op geïsoleerde kernen. Gebruik parels bekleed met antilichamen tegen nucleaire envelopeiwit nesprin-1 werden kernenvelop complexen gezuiverd aantonen dat zij dynamisch gereguleerd in reactie op mechanische spanning ^22. Deze resultaten ondersteunen de almacht van deze methode in de studie van mechanotransductie trajecten. Bovendien, terwijl stroom of trekkracht systemen stimuleren algemene cellulaire processen, magnetische korrels specifiek op een celadhesie receptor met behulp van receptorliganden ^{3 of monoklonale antilichamen tegen celoppervlak receptor 13, 15.}

Een ander voordeel van deze methode is de isolatie van hechting complexen door een eenvoudige ligandaffiniteit zuiveringsprocedure. Het is algemeen bekend dat toevoeging van ligand-gecoate bolletjes aan cellen bindt adhesie receptoren induceert en de rekrutering van diverse adhesie-eiwitten ^23. Verdere toepassing van de strijdkrachten-ligand gecoate magnetische bolletjes blijkt deze adhesie complexen in macromoleculaire platforms dat verschillende spanning-afhankelijke signaalwegen ^{4 bemiddelt, 24.} Cellysis gevolgd door concentratie kraal met een magneet maakt de isolatie van de hechting platforms. Andere methoden toegepast om de hechting complexen zuiveren zijn al gebruikt in hechtende cellen. Zij combineren chemische verknoping eiwit-eiwit interacties behoudenen een cel-lysis stap detergens en schuifkracht of sonificatie ^{20, 21, 25, 26, 27, 28.} De laatste stap is het verzamelen van de resulterende ventrale plasma membranen die de hechting complexen. In tegenstelling tot deze methoden, magnetische bolletjes in een grotere zuivering niveau van cel adhesie complexen door het selectief richt op een specifieke familie van adhesie receptoren. Magnetische korrels zijn reeds toegepast om de hechting complexen zuiveren in niet-hechtende cellen gehecht aan ligand-gecoate microkorrels ^{29, 30.} De methode die hieronder bootst biologische situaties beschreven waarbij kracht wordt uitgeoefend voor een korte aanhoudende periode (seconden tot minuten). Daarom is een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van de moleculaire samenstelling van gezuiverde adhesie complexen ende downstream mechanosensitieve-signaalwegen.

Hier presenteren we een gedetailleerd experimenteel protocol voor het gebruik van magnetische korrels aan trekkrachten van toepassing op de hechting oppervlakte-eiwitten. Een permanente neodymium magneet bovenop de kweekschaal oppervlak. Het pooloppervlak van de magneet op een hoogte van 6 mm, zodat de kracht op een 2,8 urn magnetische korrels constant (ongeveer 30-40 pN) ^31. De duur van spanning stimulatie wordt bepaald door de operator afhankelijk van het molecuul van belang en de tijdschaal van activatie. Cellen worden gelyseerd slotte, adhesie complexen worden gezuiverd met kralen kleurscheiding met een magneet en biochemische analyses worden verwerkt. Dit protocol omvat de bereiding van ligand-beklede superparamagnetische delen en de toepassing van spanning door Magneet gevolgd door biochemische analyses. Daarnaast bieden wij een representatieve steekproef van gegevens die aantonen dat de spanning toegepast op-integrine gebaseerde adhesions induceert hechting renovatie en verandert eiwittyrosinefosforylatie.

Protocol

1. Ligand Conjugatie naar Magnetic Beads

Opmerking: Ligand conjugatie wordt uitgevoerd met behulp superparamagnetische-tosyl geactiveerde kralen met een diameter 2,8 urn (voorraadoplossing concentratie 10 ⁸ kralen / ml, 30 mg kralen / ml). Het volgende protocol is gebaseerd op monsters van ongeveer 2 x 10 ⁵ cellen, die overeenkomen met MRC-5-cellen gekweekt tot 80% confluentie in een 60 mm weefselkweekplaat. Pas het volume van kralen en reagentia dienovereenkomstig bij gebruik van platen van verschillende grootte of cellen op verschillende confluences. Gebruik een hoeveelheid superparamagnetische om 2 korrels per cel. Daarom worden 4 x 10 ⁵ kralen nodig voor een 60 mm plaat.

1. Grondig resuspendeer de kralen in de oorspronkelijke flacon door vortexen ten minste 30 s. Aliquot 40 ul van de geresuspendeerde superparamagnetische (overeenkomend met 4 x 10 ⁶ korrels) in 1,5 ml microcentrifugebuis.
2. Plaats de buis op een magnetische separatistand om de magnetische korrels te scheiden van de oplossing. Verwijder het supernatant, verwijdert buis uit het magnetische scheiding stand en resuspendeer de kralen in 1 ml 0,1 M Na-fosfaat pH 7,4.
   1. Herhaal wasstap tweemaal met 1 ml 0,1 M Na-fosfaat pH 7,4.
3. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de kralen in 1 ml 0,1 M Na-fosfaat pH 7,4.
4. Combineer 100 ug Bovine fibronectine (FN) of andere celadhesie receptorligand de 1 ml 0,1 M Na-fosfaat pH 7,4 bevattende korrels en meng door pipetteren.
5. Bovenstaande stappen herhalen door het vervangen FN of andere specifieke ligand met BSA, poly-D-lysine of apo-transferrine voor negatieve controles.
6. Optioneel voor gel-analyse, neem een ​​10 pi hoeveelheid van ligand oplossing voor de analyse van het verknopen van efficiency en meng met een geschikt volume van geconcentreerde Laemmli Sample Buffer.
7. Incubeer kralen met het ligand-bevattende oplossing gedurende 12-24 uur bij 37 ° C op een rotor.
8. Als kraal aggregaten verschijnen nadat de reactie heeft plaatsgevonden, ultrasone trillingen (continu 39 W vermogen) voor niet meer dan 10-20 s.
9. Isoleer de parels middels magnetische scheiding stand, zuigen de overblijvende oplossing en voeg 1 ml PBS / 0,2% BSA pH 7,6 oplossing. Incubeer gedurende 1 uur op rotor bij 37 ° C.
10. Wassen kralen met een magneet tweemaal met 1 mL PBS / 0,2% BSA pH 7,6. Resuspendeer kralen in 1 mL PBS / 0,2% BSA pH 7,6.
11. Sonificeer kralen als aggregaten lijken niet meer dan 20-30 s.
12. Optioneel verwijderen van een 10 pi aliquot om koppeling efficiëntie door western blot analyse van (te mengen met een geschikt volume van geconcentreerde Laemmli Sample Buffer).
13. Overgaan tot assays of opslag cel kralen bij 4 ° C gedurende maximaal 1 maand.
14. Eventueel uitvoeren van een SDS-PAGE gel en vlek met Coomassie blauw naar FN verknoping analyseren om de magnetische korrels.

2. Toepassing van trekkrachten op de ligand-gecoate kralen Bond adhesiereceptoren de DorsaleOppervlak van cellen

1. Cultuur hechtende cellen op 60 mm weefselkweekplaat in geschikte groeimedium (DMEM gewoonlijk 4,5 g / l D-glucose gesupplementeerd met FCS 10%) tot aan 80% confluentie.
2. Bereid niet-denaturerende niet-ionische lysis buffer (20 mM Tris HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 2 mM _MgCl2, 0,1% NP-40) en chill microcentrifugebuizen.
3. Pellet de-ligand beklede parels uit paragraaf 1.10 en resuspendeer in 1 ml PBS / 0,2% BSA pH 7,6. Voeg 100 ul van de ligand-gecoate parels oplossing voor 5 ml warm kweekmedium en vortex.
4. Zuig medium in 60 mm cultuur schotel en voeg 5 ml warm groeimedium aangevuld met kralen.
5. Incubeer gedurende 20 minuten onder celcultuur omstandigheden (37 ° C en _5% CO2) om de parels bezinken en zich aan de cellen. Het is cruciaal om niet meer dan 20 min sinds kralen kunnen worden geïnternaliseerd door fagocytose.
6. Eventueel, observeren de parels onder een lichtmicroscoop met behulp van een 10X of 20X objective en controleer kraal hechting door lichtjes schudden van de schotel om onderscheid te maken tussen verbonden en drijvende kralen.
7. Terwijl het houden van de cultuur schotel in de couveuse, wisselen de normale schaal deksel voor een deksel met een ronde 38 mm neodymium magneet bevestigd aan de bovenzijde. De magneet wordt vastgehouden door twee kleinere 13 mm neodymium magneten gepositioneerd op de onderzijde van het deksel. Omdat de magneten zijn zeer krachtig, manipuleren ze zorgvuldig.
8. Incubeer cellen onderworpen aan spanning voor de gewenste punten in celcultuur omstandigheden (37 ° C en _5% CO2).
9. Na de behandeling plaatst schotel op ijs en zorgvuldig zuigen het hele medium uit de schotel.
10. Voeg 300 pl cellysis buffer en incubeer 10 min op ijs. Verzamel het lysaat met behulp van een celschraper en overbrengen in een voorgekoelde 1,5 ml microcentrifugebuis.
11. Pellet de magnetische korrels met behulp van de magnetische scheiding stand en breng de totale cellysaat om een ​​nieuwe pre-chilled 1,5 ml microcentrifugebuis. Bewaar deze fractie bij -20 ° C voor verdere analyse.
12. Was de kralen 3 maal met 1 ml ijskoude lysisbuffer. Voeg 50 ul Laemmli monsterbuffer aan de korrel pellet, meng door pipetteren en kookt bij 95 ° C gedurende 5 minuten met een droge blokverwarming. Deze fractie bevat de geïsoleerde hechting complexen. Overgaan tot biochemische analyse of op te slaan bij -20 ° C.
13. Van het totale cellysaat verkregen na afscheiding parels (ongeveer 300 ui), verwijderen van een 50 ul aliquot voor western blot analyse.
    OPMERKING: De 250 pl linker kan worden gebruikt voor verdere biochemische studies zoals eiwit-eiwit interactie studies (immunoprecipitatie GST pull-down assays) of GTPase activiteit experimenten (verandering van lysis buffer kan, afhankelijk van de GTPase plaats nodig).

Resultaten

Het schema van de techniek wordt geïllustreerd in figuur 1a. Na conjugatie ligand, worden magnetische korrels geïncubeerd met cellen gedurende 20 min, en daarna een permanente magneet wordt gebruikt om trekkrachten toepassing van ongeveer 30-40 pN van verschillende tijdsduur. Figuur 1b toont 2,8 um FN-beklede magnetische korrels gebonden aan MRC5 celadhesie receptoren.

De wasstappen van superparamagnetische na cellysis zijn van cruciaal belang en bepalen de ...

Discussie

De hier beschreven methode is een eenvoudige benadering van spanning celoppervlak adhesie receptoren brengen en laten hun daaropvolgende zuivering. Sommige stappen zijn essentieel voeren efficiënte hechting zuivering en mogelijke optimalisatie kan afhankelijk van de beoogde hechting receptoren. We presenteren potentiële problemen kan de gebruiker hieronder tegenkomen.

We gebruikten 2,8 urn diameter magnetische korrels maar grotere kralen kunnen worden gebruikt, zoals 4,5 pm diameter. Toch mo...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Neodymium magneten (op de bovenkant van 60 mm schaal)	K&J Magnetics, Inc	DX88-N52	kwaliteit N52 afmeting: 1 1/2" dia. x 1/2" dik
Neodymium magneten (op de onderkant van 60 mm schaal)	K&J Magnetics, Inc	D84PC-BLK	kwaliteit N42 afmeting: 1/2" dia. x 1/4" dik Zwart Plastic Gecoat
Dynabeads M280 Tosylactivated	Thermofisher	14203	superparamagnetische kralen
DynaMag-2 Magneet	Thermofisher	12321D
Fibronectine	Sigma-Aldrich	F1141-5MG	Fibronectine van bovien plasma
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280-5MG
Apo-Transferrine	Sigma-Aldrich	T1428-50MG	Bovine Apo-Transferrine
Bovien serumalbumine	Sigma-Aldrich	A7906-500G
DMEM hoge glucose, GlutaMAX supplement, pyruvaat	Life Technologies	31966-021	DMEM+GlutaMAX-I 500 ml
60*15 mm kweekschaal	Falcon	353004