Een eenvoudige kamer voor langdurige confocal beeldvorming van wortel- en hypocotylontwikkeling

Samenvatting

Hier wordt een simpele techniek voor de confocal time-lapse beeldvorming van wortel- en hypocotyloplossing met hoge resolutie voor maximaal 3 dagen gegeven met behulp van hoge numerieke diafragma-doelstellingen en perfluorodecaline als onderdompelingsmedium.

Samenvatting

Verschillende aspecten van plantontwikkeling, zoals laterale wortelmorfogenese, gebeuren op tijdsperioden van meerdere dagen. Om onderliggende cellulaire en subcellulaire processen te bestuderen, zijn microcontopiestrategieën met hoge resolutie, die de fysiologische omstandigheden behouden, vereist. Plantweefsels moeten voldoende voedings- en watertoevoer hebben met duurzame gasuitwisseling, maar wanneer ze onderdompeld en geïmmobiliseerd zijn onder een deklaag, zijn ze bijzonder gevoelig voor anoxie. Een succesvolle strategie is het gebruik van een perfusiesysteem om een ​​constante voorraad zuurstof en voedingsstoffen te behouden. Zulke afspraken kunnen echter ingewikkeld, omslachtig zijn en vereisen gespecialiseerde apparatuur. Hier gepresenteerd is een alternatieve strategie voor een simpel beeldvormend systeem dat gebruik maakt van perfluorodecaline als een onderdompelingsmedium. Dit systeem is makkelijk op te zetten, vereist minimale apparatuur en kan gemakkelijk op een microscoopfase worden gemonteerd, waardoor meerdere beeldkamers kunnen worden opgesteld en afgebeeld in parenallel. In dit systeem zijn laterale wortelgroeipercentages voor de eerste twee dagen onderscheiden van groeitempo's onder standaard omstandigheden op agarplaten, en laterale wortelgroei blijft gedurende ten minste nog een dag met verminderde tarieven. Plantweefsels worden geleverd met voedingsstoffen via een agarplaat die ook kan worden gebruikt om een ​​reeks farmacologische verbindingen te beheren. Het systeem werd opgericht om laterale wortelontwikkeling te monitoren, maar is gemakkelijk aan te passen aan andere plantenorganen zoals hypocotylen en primaire wortels.

Inleiding

Om cel- en subcellulaire processen te onderzoeken die de ontwikkeling van planten ondersteunen, is er een toenemende vraag naar langetermijn-time-lapse imaging strategieën. Een belangrijke uitdaging bij dergelijke imaging-experimenten is het behoud van fysiologische omstandigheden, waaronder voldoende gaswisseling, plus een aanvoer van water en voedingsstoffen ^{1 , 2 , 3} . Om doelstellingen te gebruiken met hoge numerieke diafragma's voor optimale optische resolutie, dienen de specimens in de nabijheid te worden geplaatst en parallel aan de deklip gericht. Bewegingen in de x-, y- en z-richting dienen bij voorkeur ideaal tijdens beeldvorming.

Terwijl zaailingen vaak worden gemonteerd in water of waterige oplossing voor korte termijn beeldvorming, heeft water een lage capaciteit om CO ₂ en O ₂ (respectievelijk 1,54 mg / ml en 0,04 mg / ml respectievelijk bij 20 ° C, 0,1 MPa) op te lossen ⁴ , wat maaktHet is ongeschikt voor uitgebreide tijdverlopen experimenten. Perfusie systemen die constante niveaus van zuurstof en nutriënten handhaven, zijn een oplossing voor dit probleem en zijn ontwikkeld voor zowel de confocal laser scanning microscopie (CLSM) ^{1 , 2 , 3} en lichte microscopie (LSM) ⁵ . Systemen zoals de RootChip ² en de RootArray ³ zijn speciaal ontworpen voor de tijdverliesbeelden van ontwikkelende wortels en omvatten ontkiemende zaden in een op maat gemaakte multi-specimen apparaat. Deze regelingen zorgen voor minimale mechanische verstoring en zijn ontworpen voor de parallelle analyse van meerdere zaailingen, maar zijn niet geoptimaliseerd voor beeldvorming van subcellulaire structuren. Calder en collega's hebben een complexere perfusiegebaseerde beeldkamer ontwikkeld die is geoptimaliseerd voor het imaging van subcellulaire structuren waarin het monster in positie wordt gehouden door een gaasOm het gebruik van hoge vergrotingsdempers toe te staan ¹ .

Hier is een alternatieve, eenvoudige oplossing voor dit probleem, dat niet gebaseerd is op perfusiesystemen, maar maakt gebruik van perfluorodecaline (PFD), een perfluorkoolstof die onlangs gewild is als montagemedium voor Arabidopsis imaging ^{6 , 7 , 8} . Bij dergelijke toepassingen maakt de hoge capaciteit van PFD voor het oplossen van CO ₂ en O ₂ (1,9 g / ml voor O ₂ in PFD in vergelijking met 0,04 mg / ml in water) ⁹ , gasuitwisseling door het ondergedompelde weefsel mogelijk. Bovendien is PFD niet-fluorescerend en de brekingsindex (1.313) is vergelijkbaar met die van water (1.333) en is dichter bij die van cytosol (~ 1.4) dan lucht (1.000) ⁶ . Parfluorkoolwaterstoffen zijn gemeld dat ze een minimale fysiologische werking hebben op een verscheidenheid aan planten en plantenKwesties ⁶ , met radijszaadjes die gemakkelijk ontkiemd worden wanneer ze in PFD gedompeld worden en normale groei en ontwikkeling gedurende tenminste twee volle dagen vertoont wanneer ze worden geleverd met water ¹⁰ . Soortgelijke waarnemingen zijn gemaakt voor ontkiemende Arabidopsis zaden ⁶ . Gebaseerd op gestimuleerde Raman verstrooiing om de verspreiding van PFD in Arabidopsis bladweefsels na infiltratie direct te bepalen, concluderen Littlejohn en collega's dat PFD waarschijnlijk niet door levende cellen ^{8 wordt} opgenomen. PFD is eerder voornamelijk gebruikt voor beeldluchtweefsels, waar het de beelddiepte aanzienlijk verhoogt, aangezien het gemakkelijk luchtruimen infiltreert door zijn lage oppervlaktespanning ⁶ . Hier wordt PFD aangenomen voor langdurige confocale beeldvorming van ontwikkelende laterale wortels. In deze configuratie worden één of meer zaailingen geplaatst op een plaat van groeimedium dat met agar wordt gestard en ondergedompeld in PFD. De PFD laat gAseous uitwisseling in de beeldkamer, het voorkomen van anoxie. PFD is zeer vluchtig, zodat het door een pakking van poly (dimethylsiloxaan) gom wordt gehouden, die ook een hoge gasdoorlaatbaarheid heeft (1,5 x ^10-12 pmol m ^-1 s ^-1 Pa ^-1 voor CO ₂ ) ¹¹ . Voedingsstoffen en water worden geleverd door middel van de plaat van het medium dat met agar wordt gestolven. Tegelijkertijd drukt deze agarplaat voorzichtig de wortel tegen de deklaag, waardoor de relatieve positie in de beeldkamer wordt bevestigd en het gebruik van wateroplosbare lenzen met hoge resolutie mogelijk maakt. Bovendien kan de agarplaat gebruikt worden om een ​​reeks farmacologische behandelingen te beheren, waaronder dexamethason, oryzalin en isoxaben. De imagingkamers kunnen in grote aantallen worden samengesteld uit standaard microscopische dia's met behulp van minimale apparatuur. De imagingkamers werden ontwikkeld en gekenmerkt om laterale wortelontwikkeling te bestuderen, maar zijn aan te passen aan het imaging van andere zaailingsorganen zoals primaire wortelpunten enhypocotylen.

Protocol

1. Het creëren van de kamer

1. Gebruik een glazen snijder, snijd 3 mm brede strips van het uiteinde van een 1 mm dikke microscoopschuif. Lijm deze glasstrips ongeveer 45 mm uit elkaar over de breedte van een tweede microscoopschuif ( Figuur 1A ) met een superlijm of dubbelzijdige tape met cyanoacrylaat. Er is één dia per kamer nodig, plus extra dia's om agarplaten te gieten (één dia geeft 2-3 agarplaten). Slides kunnen hergebruikt worden.
2. Tussen de glasstrips vormt u een pakking met dezelfde hoogte uit gasdoorlatende poly (dimethylsiloxaan) gom. Plaats een bal van poly (dimethylsiloxaan) gom op de glijbaan ( Figuur 1B ), nat een tweede glijbaan met een kleine hoeveelheid 100% absolute ethanol en platte de poly (dimethylsiloxaan) gombal met de tweede glijbaan tot het de hoogte bereikt heeft Van de glasstrips ( figuur 1C ).
   1. Indien nodig, snijd overtollig poly (dimeThylsiloxaan) tandvlees met een scheermesje en herhaling.
3. Verwijder het binnenste deel van de poly (dimethylsiloxan) tandvlees met behulp van een geschikt snij- of scheermesje dat in absolute ethanol is bevochtigd om de holte te creëren die later de zaailingen en agarplaten zal vasthouden ( Figuur 1D ).
4. Trek de gel voorzichtig af met een scheermesje om een ​​pakking te maken met een uiteindelijke wanddikte van ongeveer 2 mm (afbeelding 1E ). De permeabiliteit van gassen via een poly (dimethylsilaxaan) barrière is onafhankelijk van diktes boven 50 μm ¹¹ .

2. Het maken van de Agar-gestolde Slab Growth Medium

1. Plaats op een microscoopschuif met twee glazen stroken een deklip (22 mm x 50 mm) zodat deze op beide glazen stroken rust.
2. Pipette gesmolten halfsterkte Murashige en Skoog groeimedium bevattende 1% w / v sucrose en 1,5% w / v agar (½ MS) in de resulterende ruimteOnder de deklaag tot de laatste volledig is gevuld (ongeveer 1 ml totaal volume) en laat de agar ingesteld worden (ongeveer 5 minuten).
   Opmerking: Farmacologische verbindingen kunnen via de agarplaat worden toegediend door passende concentraties toe te voegen aan het vloeibare medium voordat de plaat wordt gegoten. Dit werd succesvol getest op dexamethason ¹² , isoxaben, 2,6-dichloorbenzonitril (DCB), oryzalin en latrunculine B.

3 . De kamerinstelling voltooien

1. Air equilibreer PFD door een klein volume PFD in een buis ^{7 te} schudden. Voeg een kleine hoeveelheid (ongeveer 200 μL) lucht-geëquilibreerd PFD toe aan de put van de gelpakkering, maar vul de kamer niet volledig in. Deze PFD zal helpen om de invalling van luchtbellen onder de agarplaat te voorkomen, aangezien het in de kamer wordt geplaatst.
2. Verwijder de deklaag van de agarplaat (in stap 2.2 hierboven) en gebruik een scheermesje om een ​​deel van deGrote maat en vorm. Plaats het dan in de put van de gelketting ( Figuur 1F ). Er moet een tussenruimte van 2-4 mm aan de pakking zijn.
3. Vul de kamer volledig met luchtvergelijkde PFD.
4. Plaats een of meer A. thaliana zaailingen (tot 3 zaailingen voor beeldvorming over 2-3 dagen) op de agarplaat met de cotyledons en hypocotyl over de rand, die in PFD drijven ( Figuur 1G ).
5. Om zaailingen te verkrijgen, steriliseer zaden met 70% ethanol, plant op ½ MS medium aangevuld met 1% sucrose en 0,8% agar, stratify gedurende 2-4 dagen bij 4 ° C en groei op verticaal georiënteerde platen bij 22 ° C in een 16 H licht / 8 uur donker regime. Voor het imaging laterale wortels, groei planten voor 7-10 dagen voordat u overbrengt naar beeldkamers.
6. Om de kamer te sluiten moet u een deklip toepassen die overeenkomt met de optiek van het objectief, om het voorzichtig met de rand van een glasmicroscoop te duwen tot de dekselRust op beide glazen stroken ( figuur 1H ).
7. Bevestig de deklaag met strips van 1.25 cm brede micropore chirurgische tape, indien gewenst, halverwege de lengte ( zie figuur 1I ). Laat het monster ongeveer 30 minuten voor afbeelden oplossen. Dit minimaliseert de beweging van het monster tijdens het imago.
8. Beeldvorming uitvoeren met een rechtop microscoop om een ​​gecontroleerd substraat voor groei te behouden. Gebruik 20X / 0.7NA of 63X / 1.2NA CS2 doelstellingen.

Resultaten

Laterale wortels groeien op fysiologische tarieven in beeldkamers.

Laterale wortellengten van planten in beeldkamers werden elke uur gemeten ( Figuur 2A , links, Film 1, n = 23) en groeitempo's werden vergeleken met die van laterale wortels gegroeid op standaard Petri-platen die hetzelfde agargestofte medium bevatten ( Figuur 2A , rechts, film 2, n = 23). Groeitarieven kunnen aanzienlijk variëren tussen laterale wortels, waarbij de lengte van de wortel een bepalende factor is als gevolg van de steeds langere zones van groei en proliferatie ¹³ . Daarom werden sets van laterale wortels geselecteerd om wortels van verschillende initiële lengtes te vertegenwoordigen (variërend van 50 μm tot 1150 μm) in zowel de beeldkamer als de agarplaat. Gemiddelde zijwortellengte aan het begin van het experimentWas in elke set vergelijkbaar (439 en 442 μm voor respectievelijk beeldkamers en -platen). In het geanalyseerde tijdsinterval van 27 uur was de laterale wortelgroei ongeveer lineair, zowel in beeldkamers als op platen, met een gemiddelde groeitempo van 52 μm / h (R2 = 0,997) op platen en 51 μm / uur in beeldkamers R2 = 0,993) ( Figuur 2B ). Groeitempo's van afzonderlijke laterale wortels, die zeer variabel zijn zowel op platen als in beeldkamers ( Figuur 2C ), variërend van 17 μm / u tot 82 μm / uur in beeldkamers en van 13 μm / uur tot 87 μm / uur op platen. Terwijl de groeitempo over het algemeen met de lengte van de wortel toeneemt, groeiden de groeicijfers nog steeds aanzienlijk tussen wortels van gelijke lengte, maar de variantie was vergelijkbaar in beeldkamers en op platen.

Zijwortels verspreiden zich in beeldkamers en kunnen met behulp van hoi worden afgebeeldGh numerieke diafragma doelstellingen.

Laterale wortels die de plasmamembraanmarkering NPSN12-YFP ¹⁴ co-expressie geven, en de microtubule markering UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) ¹⁵ werden met 1 uur intervallen door CLSM ¹⁰ gedetecteerd om microtubule gedrag te documenteren tijdens celproliferatie in beeldkamers ( Figuur 2D , film 3). In deze kamers waren laterale wortels zeer stabiel in hun positie op de x-, y- en z-assen, waardoor de verwerving van ononderbroken confocal stacks over meerdere uren werd verkregen. Meristematische cellen groeien voortdurend, zoals blijkt uit de vorming van preprophase bands ( Figuur 2D , groene pijlen), mitotische spindels ( Figuur 2D , witte pijlen) en phragmoplastieken ( Figuur 2D , blauwe pijlen). Net als bij zaailingen op Petri borden,Volledig verlengde wortelcellen in afbeeldingenchamers geïnitieerde wortelharen ( Figuur 2A , Figuur 2D , pijlkoppen), wat verder aangeeft dat de ontwikkeling volgens verwachting in de beeldkamers ging. Om een ​​brede gezichtsveld te geven, werden de afbeeldingen in Figuur 2D verkregen met een 20x / 0,7 NA doelstelling. Het was ook mogelijk om hoge resolutie beelden van laterale wortels te verkrijgen met behulp van een hoge numerieke diafragma 63x / 1,2 NA waterdichtingsdoelstelling ( Figuur 2E ).

Laterale wortelgroei wordt gedurende maximaal drie dagen in beeldkamers gehouden.

Om te onderzoeken hoe lang beeldkamers kunnen laterale wortelgroei bij fysiologische tarieven ondersteunen, werd de laterale wortellengte in beeldkamers (n = 27) en op platen (n = 33) gekwantificeerd op 0 uur, 24 uur, 48 uur en 72 uur. De wortels choSen waren korter dan 200 μm bij 0 uur, met een gemiddelde laterale wortel lengte van 117 μm in beeldkamers en 121 μm op platen. Aangezien kortere wortels gemiddeld langzamer worden ( Figuur 2C ), groeiden ze minder vaak over de rand van de agarplaat en waren ze makkelijker om te maken. De gemiddelde groei van alle laterale wortels was niet significant verschillend in beeldkameren ten opzichte van Petri-platen in de eerste 48 uur ( Figuur 3A ). De gemiddelde groei is echter aanzienlijk verminderd tussen 48 uur en 72 uur ( Figuur 3A ). Terwijl de groeitempo na 48 uur in het algemeen vertragen in beeldkamers, blijven de groeitempo's tussen individuen zeer variabel ( Figuur 3B , 3C ), wat betekent dat er een substantiële subset van laterale wortels is die in vergelijkbare mate op platen en in kamers groeit Over de volledige 72 uur groeiperiode. 23 van de 33 laterale wortels gegroeidOp platen (69,7%) bereiken een lengte binnen een standaardafwijking van de gemiddelde lengte op 72 uur (tussen 927 en 3,163 μm, figuur 3B , rood). 10 van 27 (37,0%) laterale wortels in beeldkamers bereiken een lengte binnen dit interval ( Figuur 3B , rood).

Imaging kamers kunnen gemakkelijk worden aangepast voor oudere laterale wortels, primaire wortels en hypocotylen .

Een van de beperkingen van het oorspronkelijke beeldkamer was dat, terwijl de stijve agarplaat een of andere mechanische weerstand verzorgde, kwamen de gravitropisch groeiende wortels uiteindelijk door de agarplaat, waardoor de beeldkwaliteit werd verminderd ( Figuur 4B ) en de groei verder dan de werkafstand van de hoge NA Lenzen, zelfs de relatief lange werkafstand (0.3 mm) 63X / 1.3 NA CS2-doelstelling. Jonge laterale wortels missen het statoliet bevattendeColumella cellen die nodig zijn voor gravitropisme ^17, zodat zij aanvankelijk parallel groeiden met de deklaag in beeldkamers ( figuur 2E ). Naarmate ze langer groeien en columella en statolieten vormen, vertoont laterale wortels toenemende positieve gravitropisme, terwijl primaire wortels een sterke zwaartekrachtrespons uit ontkieming vertoonden. Dit beperkt tot enkele uren de periode waarover de primaire wortels kunnen worden afgebeeld en het beperkt de startlengte van laterale wortels die continu kunnen worden afgebeeld voor 48 uur of meer. Om deze beperking te overwinnen werd de kamer zodanig gemodificeerd dat de groei parallel gehouden wordt aan de deklaag door een cellulosecellofaanmembraan dat fungeert als een penetratiebarrière op het oppervlak van de agarplaat ( Figuur 4A ). Aanvankelijke pogingen die een 1,5% agarplaat gebruiken, veroorzaakten gereduceerde wortelgroei binnen de eerste 24 uur, mogelijk door mechanische stress. Lagere agarconcentraties in de plaat werden getest en getestD bleek dat in de kamers met een plaat die 0,8% agar en cellulose film bevatte, de jonge wortelgroeitempo's niet significant verschillen van de groeitempo's in conventionele kamers gedurende de eerste 48 uur. Voor 0-24 uur bedroeg de gemiddelde wortelgroei in cellulosecamers en conventionele kamers 242 μm en 262 μm (p = 0,78 Student t-Test) en gedurende 24-48 uur was respectievelijk 330 μm en 355 μm ¹ (p = 0,67 Student's t-Test); N = 12 en n = 11 respectievelijk. Deze regeling voorkomt effectief dat laterale wortels van de omtrek van de deklaag naar de agar groeien en ook de afbeeldingen van primaire wortels tot 48 uur toelaten ( figuur 4C ).

Om te testen of de afbeeldingskamers kunnen worden aangepast voor andere organen dan wortels, werden Arabidopsis hypocotyls gekozen. Hypocotylen zijn in hoofdzaak dikker dan wortels, dus in de conventionele beeldkamer, de bovenste cElls werden tegen de deklaag geperst, waardoor de vervorming werd veroorzaakt. Een alternatief ontwerp werd daarom ontwikkeld met behulp van holteslijpjes die een ovale depressie in hun midden bevatten ( Figuur 4D ). In deze configuratie werd een 1 mm dikke agarplaat (bereid zoals in 2.2 hierboven) gepositioneerd met een uiteinde dat met een paar mm naar de schuifholte stond ( Figuur 4D ). Hypocotylen werden boven de holte in de glijbaan gepositioneerd terwijl de wortel boven het horizontale deel was geplaatst. Dit zorgde ervoor dat de zaailing in de ruimte door de wortel werd bevestigd, maar de hypocotyl was niet geperst. Terwijl de groeitempo in kamers vergeleken met platen niet systematisch gekwantificeerd werd, vertoonden hypocotylen in beeldkamers de goed beschreven golf van longitudinale groei die de hypocotyl migreerde ( Figuur 4E , 4F ) ¹⁶ .

Figuur 1 : Opstellen van een beeldkamer. Alle details worden beschreven in de tekst. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2 : Laterale wortels groeien onder fysiologische omstandigheden in beeldkamers. ( A ) Arabidopsis laterale wortelontwikkeling in een beeldkamer (links) en op een plaat (rechts) gedurende 25 uur (constant licht, horizontale incubatie, gelijktijdige beeldvorming). Schaalstaven = 200 μm. ( B ) Plot die laterale wortellengtes over 27 uur toont (gemeten in 1 u intervallen), van laterale wortels zoals getoond in ( A ). indiviOvaalwortels in grijs geplakt (n = 23 voor platen en beeldkamers), gemiddelde lengte als rode cirkels. Foutstaven = 1 SD. Rode lijn is lineair passend door middel van gemiddelde lengtes. ( C ) Plot die de gemiddelde groeitempo voor alle laterale wortels toont die in ( B ) getoond wordt ten opzichte van hun initiële lengte. ( D ) Maximale intensiteit projecties van 3D confocal stacks verkregen vanaf laterale wortels die NPSN12-YFP en RFP-TUB6 op opeenvolgende tijdspunten uitdrukken. Inset: Vergroting van doosgebied. Groene pijlen: preprophase bands; Witte pijlen: mitotische spindels; Blauwe pijlen: phragmoplasts; Pijlpunten: wortelharen. ( E ) Maximale intensiteitprojecties van beelden met hoge resolutie die zijn verkregen van een jonge laterale wortel van de transgenische lijn die in ( D ) wordt getoond, met behulp van een 63X / 1.2 NA-doelstelling en Nyquist-sampling (pixelafmetingen 77 nm x 77 nm) om 0 uur en 16 h; Sterretjes vinden identieke cellen op elk tijdstip; Pijl geeft een cel aan die tussen 0 en 16 uur verdeelt.Schaalstaven = 50 μm (AC); 20 μm (E). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3 : Langetermijnwortelontwikkeling in beeldkamers. ( A ) Plot met gemiddelde absolute wortelgroei in drie opeenvolgende 24 uur intervallen in beeldkamers in vergelijking met platen. Ns geeft p> 0,05 aan; *** geeft p <0,001 (student t-test) aan. N = 33 (platen) en n = 27 (afbeeldingskamers). ( B ) Plot die laterale wortellengten op opeenvolgende tijdspunten toont op alle wortels die in (A) worden gebruikt. Rood: alle laterale wortels met een eindlengte binnen 1 SD van het gemiddelde van alle laterale wortels die op platen worden gewekt (tussen 927 en 3163 μm). ( C ) Maximale inTrekprojecties van representatieve 3D-confocale stapels van de plasmamembraanmarker NPSN12-YFP in laterale wortels, verkregen op opeenvolgende tijdspunten gedurende 72 uur. Schaalstaven = 100 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4 : Imaging kamers kunnen worden aangepast voor andere plantenorganen. ( A - C ) Imaging kamer aanpassing voor primaire wortels. ( A ) Schematisch beeldvormingskamerontwerp. Dit is identiek aan het standaardontwerp ( figuur 1 ), afgezien van twee wijzigingen: de MS-mediumplaat bevat 0,8% agar in plaats van 1,5% agar, en een cellulosefilm (rood) wordt geplaatst tussen agar en plant om groei te voorkomenIn de agar ( B ) XY (bovenste) en XZ (onderste) maximale intensiteitprojecties van representatieve 3D-confocale stapels van de plasmamembraanmarker NPSN12-YFP in de primaire wortel van een 7 dagen oude zaailing die op 0 uur en 48 uur op een conventionele beeldvorming wordt afgebeeld kamer. Merk op dat de wortel in de agar groeit door zijn zwaartekrachtige reactie. ( C ) XY (bovenste) en XZ (onderste) maximale intensiteitprojecties van representatieve 3D-confocale stapels van de plasmamembraanmarker NPSN12-YFP in de primaire wortel van een zeven dagen oude zaailing die om 0 uur en 48 uur op de beeldvorming wordt afgebeeld Kamer met cellulose film Vóór aanbrengen werd de cellulosefilm gesteriliseerd in 80% ethanol en geweekt in vloeibaar ½ MS medium. Merk op dat de zwaartekrachtgroei van de wortel in de agar voorkomt. ( D - F ) Imaging kamer aanpassing voor hypocotylen. ( D ) Schematische weergave van een hypocotylbeeldvormingskamer. Een poly (dimethylsiloxaan) gom pakking (grijs) is vervaardigdRood op een holte tussen twee glazen stroken (geel). Een plaat van 1,5% agar van even dikte (beige) wordt op de glijbaan geplaatst, die gedeeltelijk in de holte komt. De kamer is gevuld met PFD (blauw). Zaailingen worden op de agarplaat geplaatst, zodat de hypocotyl het naar beneden aflopende gebied van de agarplaat in de holte bekleedt terwijl de wortel het horizontale deel van de agar is geplaatst. De kamer is afgesloten met een deksel. ( E ) Maximale intensiteitprojeksies van representatieve 3D-confocale stapels van de plasmamembraanmarker NPSN12-YFP in een hypocotyl van een tweedaagse oude zaailing op 48 uur in opeenvolgende tijdspunten. ( F ) Longitudinale groei in twee opeenvolgende tijdsintervallen van individuele cellen langs de basale naar apische as (relatieve posities bij 0 h langs de as getoond in E) van de hypocotyl die in ( E ) wordt getoond. Let op de eerder beschreven golf van groei die de hypocotyl ¹⁶ migreert. Schaalstaven = 100 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Film 1: Klik hier om deze film te downloaden.

Film 2: Klik hier om deze film te downloaden.

Film 3: Gelieve cLik hier om deze film te downloaden.

Discussie

De methode die hier wordt gepresenteerd is een simpele strategie voor confocal beeldvorming met hoge resolutie voor twee tot drie dagen. Bij perioden tot 48 uur werden geen nadelige effecten van het beeldvormingssysteem op de laterale wortelontwikkeling waargenomen. Na 48 uur begon de gemiddelde laterale wortelgroei te vertragen, hoewel een aanzienlijke subset van de wortels (37%) bleef groeien tegen tarieven die vergelijkbaar waren met de gemiddelde wortelgroei op platen. Daarom, door het imago van een voldoende groot aantal wortels, kunnen wortels wier groei vertraagt ​​na 48 uur uitgesloten worden. Systematische tests van de beeldkamers werden niet uitgevoerd voor perioden langer dan 72 uur, maar alternatieve strategieën worden aanbevolen als verlengde beeldvormingstijden gewenst zijn. Imagingkamers kunnen voortdurend op het microscoopstadium worden gelaten, indien passende milieuomstandigheden worden verstrekt, of naar een groeifaciliteit worden verwijderd en periodiek teruggestuurd naar de microscoop. Hierdoor kunnen talloze kamers parallel worden weergegeven.

Een voordeel van de hier beschreven kamers is dat zijwortels in hun positie zijn bevestigd en kunnen worden afgebeeld met behulp van hoge resolutie waterdempende lenzen. De ruimtelijke stabiliteit hangt kritisch af van de agarconcentratie die in de ondersteunende agarplaat gebruikt wordt. Aanvankelijk werden een aantal verschillende concentraties van 0,8% agar tot 2% agar getest, waarbij bleek dat hoge concentraties in dit bereik stabiel wortels in de ruimte vastzetten, maar de wortelgroei vertraagde sneller en sommige wortels vertoonden tekenen van mechanische stress, inclusief verminderde celverlenging. Daarentegen leverden de lage agarconcentraties niet de benodigde ondersteuning en wortels drijven in x, y en z tijdens de beeldvorming. De optimale 1,5% agarplaat regelt de positie van het monster zonder nadelige mechanische effecten. Onder deze omstandigheden, na het afrekenen in de eerste 30 minuten of zo, zijn de wortels stabiel over vele uren, waardoor de overname van data overnacht wordt. Tijdens de aanschaf van 4D-gegevens waren z-stapelbereiken typisch bRacketed met een extra 5-10 μm, maar dit was voornamelijk geschikt voor buiten-vlakke groei van laterale wortels in plaats van z-drift of wobble. Hoewel de standaard agar concentratie wat weerstand biedt tegen penetratie, zullen de gravitropisch groeiende wortels uiteindelijk de agar binnendringen. Door een kleine wijziging van de beeldkamer kan de wortelgroei echter evenwijdig aan de deklip worden gehouden, waardoor oudere laterale wortels en primaire wortels kunnen worden afgebeeld. Bovendien kan de basisbeeldkamer gemakkelijk worden aangepast voor hypocotylen. Hypocotylen zijn meer vrij drijvend in dit systeem, zodat de z-as-beugel voor beeldverwerving gewoonlijk is verhoogd tot ongeveer 20 μm. In deze studie werd een regop microscoop doorheen gebruikt, waardoor de substraateigenschappen mogelijk werden gecontroleerd. De afbeeldingscamer kan aangepast zijn aan omgekeerde microscoopconfiguraties, maar de tijdsafhankelijke invloed van de stijve deklip op onderscheidende organen moet geëvalueerd worden.

Littlejohn en collega's hebben erop gewezen dat PFD zelf niet biologische molecules gemakkelijk oplosbaar maakt, wat betekent dat het niet direct kan worden gebruikt voor de afgifte van farmacologische verbindingen ⁷ . Dit probleem werd overwonnen door zulke verbindingen te leveren door middel van de plaat van gestolde groeimedium waarop de agarplaat rust. Terwijl perfusiesystemen de gekozen methode blijven voor uitwasproeven, is de beeldkamer met succes gebruikt voor de toediening van dexamethason ¹² en andere verbindingen. Een opmerking, terwijl dit artikel in voorbereiding was, heeft Wagenheim en collega's ¹⁸ een kamer beschreven voor het imaging van laterale wortelontwikkeling met behulp van lichte-bladmicroscopie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Perfluorodecalin	F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK	FLUTEC PP6
Poly(dimethylsiloxane) gum	Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA	Item # 132700	Carolina Observation Gel
Cavity Microscope Slides	VWR International Ltd, Lutterworth, UK	10118-600	Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice
Cyanoacrylate glue	Loctite	604753	Any 'super-glue' suitable for glass will probably suffice
Cellulosic cellophane membrane	AA Packaging Limited, Preston, UK		325P cellulose film; 80 mm disc