Zebravis netvlies regeneratie is meestal onderzocht met behulp van vaste netvliezen. Echter, dynamische processen zoals interkinetic nucleaire migratie optreden tijdens de regeneratieve respons en vereisen voor live-cell imaging om de onderliggende mechanismen te onderzoeken. We beschrijven hier de cultuur en beeldvorming voorwaarden te controleren Interkinetic Nuclear Migratie (INM) in real-time met behulp van multiphoton microscopie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Cultuur van volwassen transgene zebravis Retina Explantaten voor Live-cell imaging van Multiphoton Microscopy
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een endogeen regeneratie programma is geïnitieerd door Müller glia in de volwassen zebravissen (Danio rerio) retina volgende neuronale schade en de dood. De Müller glia opnieuw in te voeren de celcyclus en produceren van neuronale voorlopercellen die volgende rondes van celdelingen ondergaan en differentiëren in de verloren neuronale celtypen. Zowel Müller glia en neuronale voorlopercellen celkernen repliceren hun DNA en ondergaat mitose in verschillende locaties van het netvlies, dat wil zeggen ze migreren tussen de basale Inner kernlaag (INL) en de buitenste nucleaire laag (ONL), respectievelijk in een werkwijze genaamd Interkinetic Nuclear Migratie (INM). INM is voornamelijk bestudeerd in de ontwikkelende retina. Om de dynamiek van INM in de volwassen zebravissen netvlies regenereren in detail te onderzoeken, is voor live-cell imaging van fluorescent-gelabelde Müller glia / neuronale voorlopercellen nodig. Hier bieden we de voorwaarden te isoleren en cultuur dorsale netvliezenvan Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebravis die werden blootgesteld aan een constante intens licht voor 35 uur. We tonen ook dat deze retinale culturen levensvatbaar live-cell imaging experimenten, continu verwerven z-stack beelden over de dikte van het netvlies explantaat tot 8 h en multifoton microscopie het migrerende gedrag van GFAP controleren: nGFP -positieve cellen . Daarnaast beschrijven we de gegevens om na de beeldvorming uit te voeren om de snelheid van apicale en basale INM bepalen. Om samen te vatten, hebben we voorwaarden aan de dynamiek van INM in een naaktmodel van neuronale regeneratie te bestuderen. Dit zal ons begrip van deze cruciale cellulaire proces te bevorderen en ons toelaten om de mechanismen die INM controle te bepalen.
Inleiding
In tegenstelling tot mensen, de zebravis (Danio rerio) vertonen een robuuste regeneratie reactie op de celdood van retinale neuronen 1, 2, 3, 4. Tumor necrosis factor α, een signaalmolecuul dat vrijkomt uit stervende retinale neuronen induceert Müller glia die in de basale Inner kernlaag (INL) van het netvlies, te prolifereren 5 en produceren neuronale progenitorcellen die blijven prolifereren vóór differentiëren in de neuronale cel soorten die stierven 2,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: zebravis zijn gerezen en onderhouden in de Notre Dame zebravis faciliteit in de Freimann Life Sciences Center. De in dit manuscript beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Universiteit van Notre Dame Animal Care en gebruik Comite en zijn in overeenstemming met de verklaring voor het gebruik van dieren in een visioen onderzoek door de Vereniging voor Onderzoek in Vision en Oogheelkunde.
1. Oplossingen
- Bereid 70% ethanol aan de weefselkweek kap en alle apparatuur / reagentia die worden overgebracht in de weefselkweek kap steriliseren.
- Voeg 2 ml 2-fenoxyethanol tot 1 L van het systeem water (1: 500 2-feno....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De isolatie van het netvlies volgens de procedure in het schema weergegeven in figuur 1 maakt het kweken van een afgeplatte dorsale netvlies tegen licht beschadigde adult Tg [GFAP: nGFP] mi2004 zebravis gedurende ten minste 24 uur in een 5% CO 2 / lucht-omgeving. Deze flat-gemonteerde netvlies explantaten kan worden gebruikt om het focale vliegtuigen bij diepe weefsel niveaus. Een voorbeeld is Müller glia / neuronale voorlopercellen celkern.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Studies die de mechanismen die de regeneratie van beschadigde volwassen zebravissen netvlies overwegend gebruikte immunocytochemische werkwijzen 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. Voorwaarden worden vastgesteld om cultuur netvlies explantaten en live-cell imaging voeren op verschijnselen, zoals INM.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij waarderen de steun van William Archer en de Notre Dame Integrated Imaging Facility. Speciale dank zijn gericht op de Freimann Life Sciences technici voor hun voortdurende hulp en hun zorg en verzorging van de zebravis. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Eye Institute van de NIH om DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) en het Centrum voor zebravis Research, Universiteit van Notre Dame, de Notre Dame, IN.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dumont forceps #5 | World precision instruments | 14098 | |
| Dumont forceps #5, 45° angle | World precision instruments | 14101 | |
| McPherson-Vannas schaar | World precision instruments | 501233 | |
| Fluordishes | World precision instruments | FD35-100 | |
| Stereomicroscoop | Nikon | SMZ-1B | gelijkaardige soort dissectie stereomicroscoop zal werken |
| Biologische veiligheidskast klasse type A2 | Labconco | gelijkwaardig type zal werken | |
| weefselkweekincubator | Thermoscientific | HEPA-klasse 100 | gelijkwaardig type zal werken |
| Sylvania fluorescentielampen OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0,2 µm poriegrootte Acrodisc spuitfilter | VWR | 4192 | |
| 10 mL Luer-lok spuit | VWR | BD309604 | |
| 60 mL Luer-lok spuit | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3 | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2 | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS zonder Ca2+/Mg2+, zonder fenolrood, Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM zonder fenolrood, Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| Paarden serum, hitte-geïnactiveerd | ThermoScientific | 26050-070 | |
| penicilline/streptomycine | VWR | 16777-164 | |
| Ultrapuur lage smeltpunt agarose | ThermoScientific | 16520-100 | |
| ethanol, absoluut | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-fenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| Corning Cell-Tak cel- en weefselkleefstof | VWR | 354240 | |
| brekingsindex vloeistof | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 multifoton microscoop uitgerust met een MaiTai infraroodlaser | Nikon | gelijkwaardig systeem zal werken | |
| 40X Apo langeafstands waterimmersie objectief (N.A. 1.15) | |||
| milieukamer uitgerust met insert voor 35 mm petrischalen | Okolab | gelijkwaardig systeem zal werken | |
| NIS analysesoftware | Nikon |
Referenties
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Kassen, S. C., et al. Time....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
