Methodenartikel

Isoleren en analyseren van cellen van de pancreas mesenchym door flowcytometrie

DOI:

10.3791/55344

⸱

28 januari 2017

 ,  , 
1Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren van cellen in de pancreas micro uit embryonale, neonatale en volwassen muis weefsel, gericht op het isoleren van mesenchymale cellen. Deze methode maakt profilering cel genexpressie en secretie eiwitten om de extrinsieke signalen die pancreas ontwikkeling, functie en tumorigenese reguleren helderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De pancreas bestaat uit epitheliale cellen die nodig zijn voor voedselvertering en regulering van de bloedglucosespiegel. Cellen van de pancreas-micro-omgeving, waaronder endotheel-, neuronale en mesenchymale cellen, bleken de celdifferentiatie en proliferatie in de embryonale pancreas te reguleren. Bij volwassenen werd aangetoond dat de functie en massa van insulineproducerende cellen afhankelijk zijn van cellen in hun micro-omgeving, waaronder pericyten, immuun-, endotheel- en neuronale cellen. Ten slotte werd aangetoond dat veranderingen in de pancreas-micro-omgeving de pancreastumorigenese reguleren. De signalen die ten grondslag liggen aan deze processen zijn echter niet volledig gedefinieerd. Daarom is het karakteriseren van de verschillende celtypen die de pancreas-micro-omgeving vormen en het profileren van hun genexpressie cruciaal om de weefselontwikkeling en functie onder normale en ziekelijke toestanden te bepalen. Hier beschrijven we een methode die het mogelijk maakt om mesenchymale cellen te isoleren uit de pancreas van embryonale, neonatale en volwassen muizen. Deze methode maakt gebruik van de enzymatische vertering van muizenpancreasweefsel en de daaropvolgende fluoresceine-geactiveerde celsortering (FACS) of flow-cytometrische analyse van gelabelde cellen. Cellen kunnen worden gelabeld door immunokleuring voor oppervlaktemarkers of door de expressie van fluorescente eiwitten. Celisolatie kan de karakterisering van genen en eiwitten die worden geexpresseerd in cellen van het pancreasmesenchym vergemakkelijken. Dit protocol was succesvol in het isoleren en kweken van sterk verrijkte mesenchymale celpopulaties uit de embryonale, neonatale en volwassen muizenpancreas.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Energie homeostase en de vertering van voedsel bij zoogdieren afhankelijk zijn van de juiste functie van de alvleesklier. De volwassen pancreas omvat twee belangrijke cellulaire compartimenten: de exocriene en endocriene. Exocriene cellen, waaronder acinaire cellen die produceren en uitscheiden spijsverteringsenzymen en ductale cellen die deze enzymen transporteren naar de darm, omvatten meer dan 80% van de totale massa alvleesklier 1. Endocrine cellen, die insuline producerende beta-cellen en glucagon producerende a-cellen omvatten, zijn georganiseerd in de eilandjes van Langerhans die zijn ingebed in de exocriene weefsel en hormonen afscheiden bloedglucose niveaus 2 reguleren.

Alvleesklier cellen verwerven hun gedifferentieerde lot door middel van een sterk gereguleerde, multi-step proces 3. Er zijn aanwijzingen dat extrinsieke signalen door neurale, endotheliale en mesenchymale cellen begeleiden pancreas cel differentiatie en proliferatie in tHij embryo 3, 4, 5. Een voorbeeld is de eis van de aorta voor de specificatie van vroege pancreatische voorlopers 6. Later in ontwikkeling, werden endotheelcellen aangetoond dat een centrale rol spelen bij de ontwikkeling van zowel pancreatische endocriene en exocriene cellen en beta-celdifferentiatie 4, 6, 7 bevorderen. Mesenchymale cellen bleken de overleving en groei van gemeenschappelijke pancreatische voorlopercellen te ondersteunen, met name door de afscheiding van de groeifactor Fgf10 8, 9. We hebben verder aangetoond dat deze cellen ondersteunen de proliferatie van endocriene en exocriene precursoren, en gedifferentieerde cellen (waaronder acinaire en beta-cellen) in de embryonale pancreas 5. Onlangs, mesenchymale cellen werden verdergetoond regulering endocrine cellen differentiatie 10.

Bij volwassenen beta-celfunctie en massa werden naar afhankelijk cellen in hun micromilieu, zoals neuronale, immuun en endotheelcellen, pericyten en 11, 12, 13. Tijdens letsel, werden endotheelcellen aangetoond dat immuuncellen werven om de alvleesklier om beta-cel-replicatie 13 te promoten. Endotheelcellen werden verder aangetoond extracellulaire matrix (ECM) componenten tegen insuline expressie en beta-celfunctie 14 ondersteunen. We hebben onlangs aangetoond dat de eis van eilandje pericytes voor beta-celfunctie 11. Tenslotte cellen van de pancreas stroma bleken de progressie van pancreatische ductale adenocarcinoma (PDAC) 15, 16 te regelen. De identiteit van extrinsieke signalen dat de ontwikkeling van de pancreas, de functie en het ontstaan ​​van tumoren te begeleiden zijn grotendeels onbekend.

Identificeren signalen door cellen van de alvleesklier micro vereist karakteriseren van de genen en eiwitten die door deze cellen tot expressie. Dit is afhankelijk van het isoleren van deze cellen uit de alvleesklier om genexpressie en proteoomanalyse voeren en / of de instelling cellijnen. Hier stellen we een methode om mesenchymale cellen van de alvleesklier micro isoleren door gebruik weefsel enzymatische digestie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) van ofwel immunofluorescently gelabelde cellen of cellen die fluorescerende eiwitten. Dit protocol werd met succes uitgevoerd te isoleren en analyseren geel fluorescerend eiwit (YFP) -expressie mesenchymale cellen van de embryonale, neonatale en volwassen pancreas 5, 17.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Experimenten werden uitgevoerd volgens de protocollen van de Commissie voor Animal Onderzoek aan de Universiteit van Tel Aviv goedgekeurd.

1. Isolatie van pancreasweefsel van Muizen

  1. Voor volwassen muizen:
    1. Bereid de spijsvertering buffer: 0,4 mg / ml collagenase P en 0,1 ng / mL DNase I opgelost in Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS). Vers bereid 5 ml buffer per muis in 15 ml conische buizen en bewaar ze op ijs tot gebruik.
    2. Euthanaseren de muizen volgens de institutionele richtlijnen.
    3. Ontleden elke muis aan de alvleesklier te verwijderen (voor instructie, zie referentie 18); plaats het in een cultuur schotel met HBSS. Het is mogelijk om deze fase te voeren onder een stereomicroscoop en de spijsvertering efficiency te vergroten, het weefsel in 2-4 stuks.
    4. Plaats de pancreas weefsel in een buis met spijsvertering buffer (bereid in stap 1.1.1). Houd de buizen op ijs totdat alle muizen worden ontleed en de alvleesklier weefselsverzameld.
    5. Herhaal stap 1.1.2 - 1.1.4 met de resterende muizen.
  2. Voor embryo's en pasgeboren muizen:
    1. Bereid de spijsvertering buffer: 0,4 mg / ml collagenase P en 0,1 ng / mL DNase I opgelost in HBSS. Voor embryo's en pups op postnatale dag 7 (P7) of jonger, vers bereiden 1,5-2 ml buffer per muis in een 15-mL conische buis. Voor p7 of ouder pups, bereiden 3-4 ml buffer per muis in een 15-mL conische buis. Blijf op ijs tot gebruik.
    2. Euthanaseren de muizen volgens de institutionele richtlijnen. Voor embryo's, verwijder alle embryo's uit de baarmoeder van hun moeder en leg ze in een 10-mm cultuur schotel met PBS. Ontleden één embryo per keer.
    3. Leg de muis op zijn rug, met zijn hoofd naar weg van de onderzoeker. Met behulp van fijne tang, trek de buikhuid en open aan de middellijn van de buikholte bloot te stellen aan de muis diafragma 18.
    4. Met behulp van fijne tang, verwijder de lever frOM achter buikwand. Met een continue beweging naar de staart muis, schep de ingewanden (zoals de lever, maag, milt, darmkanaal, nier en pancreas) en plaats ze in een kweekschaal met HBSS.
    5. Onder een stereomicroscoop, verwijder de lever en nieren naar de alvleesklier bloot (figuur 1). Gebruik fijne tang, maak de alvleesklier van de maag, twaalfvingerige darm, en tenslotte uit de milt.
    6. Plaats de pancreas weefsel in een buis met spijsvertering buffer (bereid in stap 1.2.1). Voor p14 of ouder pups, snijd het weefsel in 2 stukken om de spijsvertering efficiëntie te verhogen. Houd de buizen op ijs totdat alle muizen worden ontleed en de alvleesklier weefsels verzameld.
    7. Herhaal stap 1.2.2 - 1.2.6 met de resterende muizen.

2. alvleesklier Spijsvertering

  1. Incubeer de buizen die de pancreas weefsel (in digestiebuffer) in een verwarmingsblok bij 37 ° C gedurende 30 min met agitation bij 700 rpm. Na 15 min handmatig de buizen schud met de inverterende hen 3-4 keer en weer terugplaatsen in het verwarmingsblok.
    NB: Bij gebruik van een verwarmingsblok zonder roeren mogelijkheden, keren de buizen elke 5-10 min. Zorg ervoor dat het weefsel goed verteerd. Zo niet, dan snijd het weefsel in kleinere stukken vóór incubatie of verhoog de agitatie.
  2. Om het weefsel spijsvertering te stoppen, plaatst de buizen op ijs en voeg 10 ml koud HBSS aan elke buis. Centrifugeer de buizen bij 4 ° C en 300 g gedurende 5 min en zuig de supernatant.
  3. Re-ophanging:
    1. Voor volwassen muizen en p14 of ouder pups, resuspendeer de pellet met 6 ml PBS en zeef het door een 70-um cel zeef bovenop een nieuwe 15-ml conische buis collectie polypropyleen. Om ervoor te zorgen maximale cel herstel, was de oorspronkelijke buis met een extra 6 ml PBS en zeef het door de cel zeef op de collectie buis.
    2. Voor embryo's en pups jonger than p14, resuspendeer de pellet met 2 ml PBS en zeef het door een 35-um cel zeef bovenop een 5-mL rondbodem polystyreen verzamelbuis (FACS buis). Ter controle maximale celopbrengst, Was de buis met een additionele 2 ml PBS en zeef het door de cel zeef op de verzamelbuis.
  4. Centrifugeer de buizen bij 4 ° C en 300 g gedurende 5 min en zuig de supernatant. Verwijder de vloeistof voorzichtig, zoals cellen die los zijn bevestigd aan de polystyreen buis.

3. Bereiden gelabelde enkele cellen

  1. Buffer preparaten: Voor celisolatie door FACS sortering buffer bereid door het mengen van PBS (zonder calciumchloride en magnesiumchloride), 5% foetaal runderserum (FBS) en 5 mM EDTA. Voor flowcytometrie-analyse, voor te bereiden analyse buffer aan te vullen sorteren buffer met 0,05% natriumazide. Beide buffers kunnen maximaal 2 maanden worden bewaard bij 4-8 ° C.
  2. Resuspendeer cellen in het sorteren of analysisbuffer. Resuspendeer elk pancreas geïsoleerd uit embryo's en pups jonger dan P7 in 1 ml, van pups tussen de P8 en een maand oud in 1,5 ml, en uit muizen ouder dan een maand in 3 ml. Zeef de cellen door een 35-um cel zeef bovenop een ronde bodem polystyreen buis (FACS buis).
  3. Voor het kleuren van controles, neem 50- tot 100-ul monsters van de in de vorige stap (niet meer dan 5% van de totale steekproef volume) monsters en leg ze in nieuwe FACS buizen; omvat een buis voor elke fluorofoor gebruikt, zoals DAPI en fluorescerende eiwitten, alsmede een ongekleurd controle.
    OPMERKING: Bij transgene muizen met cellen die een fluorescent eiwit, of wanneer het aantal cellen beperkt is, een niet-transgeen weefsel als controle kleuring. Als cellen die een fluorescent eiwit worden gebruikt zonder verdere kleuring, ga dan naar stap 3.8.
  4. Spin-down de cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C en zuig de supernatant.
  5. voor blockoning, resuspendeer de cellen met blokkerende oplossing (100 ul selectie of analyse buffer aangevuld met 1 pl geit IgG) en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
  6. Celoppervlak markers vlek, bereiden van een mengsel dat alle gewenste fluorofoor geconjugeerde antilichamen in een volume van 100 ul per monster omvat. Bereid 2x antilichaam verdunningen bij selectie of analyse buffer (dwz verdunnen antilichaam dubbele de vereiste concentratie te verkrijgen, als een uiteindelijke verdunning van 1: 200 gewenst verdunnen antilichaam 1: 100). Zonder wassen van de blokkerende oplossing, voeg 100 ul van het mengsel om het monster cellen tot een uiteindelijke kleuring volume van 200 pl te bereiken. Incubeer 30-60 minuten op ijs en in het donker.
  7. Om de analyse of sorteren parameters (zie stap 4,3 en 5,2) ingesteld, bereid extra buizen die één van de antilichamen gebruikte (kleuring controle) bevatten. Bereid 2x antilichaam verdunningen in selectie of analyse buffer (zoals beschreven in stap 3.6). Zorg ervoor dat u een si omvattenngle kleuring control verdunning per fluorofoor gebruikt, en een ongekleurde control. Zonder wassen van de blokkerende oplossing, voeg 100 ul antilichaam mengsels aan de cellen (bereid in stap 3,3) tot een uiteindelijk kleuring volume van 200 pl te bereiken. Incubeer gedurende 30 - 60 minuten op ijs en in het donker.
  8. Wassen vullen elke buis met analyse of sorteren buffer om een ​​maximaal volume van 4 ml. Eventueel opnieuw stam van de cellen door een 35-um zeef cel (zoals beschreven in stap 3.2).
  9. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en verwijder het supernatant.
  10. Resuspendeer de monsters in de analyse of sorteren buffer. Resuspendeer de cellen geïsoleerd uit embryo's in 500 pl, van pups jonger dan één maand in 1 ml, 1-3 maanden oud in 2 ml en uit muizen ouder dan 3 maanden 3 ml. Kleuring controles kunnen worden geresuspendeerd in 300 pi buffer.
  11. Voeg 200 ng / ml DAPI om opnieuw gesuspendeerde cellen aan de dode cellen te identificeren. Zorg ervoor dat u een buis co omvattenntaining ongekleurde cellen zonder DAPI voor cytometer instellingen. Overgaan tot celsortering (stap 4) of analyse (stap 5).

4. Cell Sorting

  1. Voorbereidende werkzaamheden:
    1. Voor celsortering voorafgaand aan RNA-extractie, jas een 1,5-mL verzamelen buis met RNase inhibitor onmiddellijk vóór sortering. Daartoe voeg 1 ml sorteren buffer, die 0,01 U / ml RNase inhibitor, een steriele 1,5 ml verzamelbuis. Na 5 min, vortex de buis en verwijder de vloeistof.
    2. Voor celsortering vóór celkweek, voeg 3 ml steriele kweekmedia (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 20% FBS, 1% L-glutamine en 1% penicilline-streptomycine) in een steriele 15 ml verzamelbuis .
  2. Voordat u het laden van een buis in een FACS sorter, vortex deze kort om opnieuw op te schorten de cellen. Houd de resterende buizen op ijs.
  3. Begin met het analyseren van de kleuring controles om de sortering parameters bepalen (bv Spanning en compensatie) en sorteren poorten (bijv totale celpopulatie, levende DAPI-negatieve cellen en celpopulaties worden gesorteerd).
  4. Zodra de sortering parameters en poorten zijn ingesteld, laadt de monsters en initiëren celsortering in de collectie buizen.
    OPMERKING: sorteervoorwaarden zijn sterk afhankelijk van het instrument. We gebruiken een mondstuk breedte van 100 urn, een druk van 23,1 psi, en een maximale snelheid van 5 sorteren.
  5. Ga verder met RNA-extractie of het kweken van gesorteerde cellen.
    LET OP: Voor de RNA-extractie, centrifuge de cellen bij 2000 xg gedurende 5 minuten en verwijder de overtollige vloeistof alvorens verder te gaan met een standaard-extractie protocol. Voor het kweken van cellen, of de cellen werden gesorteerd onder niet-steriele omstandigheden, wassen tweemaal uit het vullen van de buis met kweekmedium en centrifugeren in bij 300 xg gedurende 7 minuten voor het kweken teneinde de verontreiniging te minimaliseren.

5. Cel analyse door flowcytometrie

  1. voordat loading elke buis in de cytometer, vortex deze kort om opnieuw op te schorten de cellen. Houd de resterende buizen op ijs.
  2. Begin met het analyseren van de ongekleurde en single-gekleurde monsters om de analyse parameters (bijvoorbeeld spanning en compensatie) te bepalen.
  3. Zodra de analyse parameters worden ingesteld, laadt elk monster, met inbegrip van de kleuring controle, en de resultaten op te nemen. Analyseer de resultaten na flowcytometrie analyse software.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De pancreas mesenchym vereist jonge en volwassen. De hier beschreven methode maakt het isoleren van mesenchymale cellen van de embryonale, neonatale en volwassen pancreas. Mesenchymale cellen, maar geen andere celtypen, express geel fluorescerend eiwit (YFP) in de alvleesklier van Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP muizen 5, 11, 17, 19. Tijdens de ontwikkeling, Nkx3.2 (ook bekend als BapX1) wordt uitgedrukt door embryonale pancreas, maag en darmen mesenchym, en in een subset van skeletal somieten 19, 20, 21. Dit gen werd tot expressie gebracht in de alvleesklier mesenchym van E9.5 tot E11.5, waardoor genexpressie onder de controle van Nkx3.2 -Cre van E9.5 5, 19, 20. Op basis van deze kenmerken, kunnen cellen worden gezuiverd uit bulk pancreasweefsel middels flowcytometrie. Figuur 2 toont een stroom-cytometrie analyse van enkelvoudige cellen uit embryonale, neonatale en volwassen pancreas weefsels, geïsoleerd zoals hierin beschreven. Overwegende dat niet-transgene alvleesklier weefsels niet fluorescerende cellen bevatte, Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP pancreatische weefsel van alle geanalyseerde leeftijden bevat een duidelijke YFP-gelabelde celpopulatie (figuur 2, voorzien van poorten).

Volgens de methode beschreven, kunnen cellen die fluorescerende eiwitten ofwel gezuiverd of door flow cytometrie geanalyseerd, met of zonder extra immunokleuring worden. Bijvoorbeeld, na sortering op basis van fluorescentie labeling, mesenchymale cellen kunnen worden gekweekt op een cellijn (ten minste vijf passages), zoals getoond in figuur 3A. Opmerking t hij fibrocytic morfologie van de gekweekte cellen, typisch mesenchymale cellen. Bovendien was dit systeem gebruikt om genexpressie te analyseren met gesorteerde cellen. Hiertoe werd RNA geëxtraheerd uit gesorteerd mesenchymale cellen synthetiseren van cDNA en genexpressie werden geanalyseerd door qPCR. Een dergelijke analyse is gebleken dat gesorteerde cellen brengen de pan-mesenchymale marker vimentine (Figuur 3B). Ten slotte kan oppervlaktemerker expressie door pancreascellen worden geanalyseerd door flow-cytometrie. Bijvoorbeeld, geïsoleerd we cellen uit de pancreas weefsel van Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP volwassen muizen als hier beschreven en gekleurd ze met het celoppervlak glycoproteïne CD9, die werd gerapporteerd door fibroblasten 22 worden uitgedrukt. Zoals getoond in figuur 3C, alle fluorescent gelabelde cellen in het Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP alvleesklier uiten CD9.

tp_upload / 55344 / 55344fig1.jpg "/>
Figuur 1: embryonale en neonatale pancreasweefsel. Geïsoleerd gehele maagdarmkanaal, zoals de maag, milt, darm en alvleesklier, een E15.5 embryo (A) en een p4 pup (B). De pancreas weefsel wordt afgebakend met een blauwe lijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-1
Figuur 2: Mesenchymale cellen worden fluorescent gelabelde in Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP pancreas weefsel. Stroomcytometrie analyse van pancreatische cellen geïsoleerd uit niet-transgene (linker panelen) en Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP transgene (rechter panelen) muizen op verschillende leeftijden: embryonale (A), neonatale (B), en adult (C). Cellen werden geanalyseerd op zijwaartse verstrooiing (y-as) en gele fluorescentie (x-as). Gates (gemarkeerd met "D") gaf de aanwezigheid van een YFP + celpopulatie in transgene muizen maar niet in niet-transgene controles. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 3: Analyses van geïsoleerde cellen de alvleesklier. (A) Cellen gesorteerd van de pancreas weefsel van Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP neonatale muizen (zoals beschreven in figuur 2B) werden gekweekt op een cellijn. Gekweekte cellen werden afgebeeld op fluorescentie (groen, rechts en links panelen) en fase contrast (grijs; rechter paneel). (B) Bar diagram dat Vimentin1 (Vim1)expressie niveaus van YFP + gesorteerde cellen van de pancreas weefsel van Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP volwassen muizen (zoals beschreven in figuur 1C, groen) in vergelijking met ongesorteerde pancreas weefsel (zwart). RNA werd geëxtraheerd en genexpressie werd geanalyseerd door qPCR; expressie werd genormaliseerd naar cyclofiline. N = 4. *** P <0,001. Gegevens stellen het gemiddelde ± SD. (C) Flow-cytometrie analyse van verspreide pancreas cellen uit Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP volwassen muizen immuno-gekleurd met allofycocyanine (APC) geconjugeerd anti-CD9 antilichaam en geanalyseerd op APC (y-as) en gele fluorescentie (x-as). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren en cellen van de pancreas micro analyseren. Deze methode kan worden gebruikt om mesenchymale cellen te isoleren van embryonale en volwassen pancreas weefsel. Daarnaast hebben we met succes gebruikt dit protocol om endotheelcellen van volwassen en neonatale pancreas 5, 17 isoleren. Het kan echter niet geschikt voor het verkrijgen van een reproduceerbare eencellige suspensie van pancreatische epitheelcellen (alternatieve protocollen worden beschreven in de referenties 18, 23 en 24) zijn. Met deze methode fluorescent gelabelde cellen, hetzij expressie fluorescerende eiwitten of immunologisch gekleurd voor oppervlakte markers, kan worden gezuiverd door FACS of door flow cytometrie geanalyseerd. RNA kan worden geëxtraheerd uit gezuiverde cellen hun genexpressiepatroon profiel. Als alternatief kunnen gezuiverde cellen worden gekweekt om een ​​cellijn voor daaropvolgende proteomics analyse vast te stellen. Deze methode zal de karakterisatie van factoren e inschakelenxpressed door de alvleesklier micro-omgeving, die zijn organogenese, fysiologie en pathofysiologie regeren.

De pancreas mesenchym ondersteunt weefsel organogenese door het bevorderen van de verspreiding van precursoren en gedifferentieerde cellen 5, 9. Deze cellen werden getoond aan de expansie van menselijke embryonale stamcellen te ondersteunen (hESC) -afgeleide alvleesklier voorlopercellen 17, 25, 26. Daarom afbakening van de identiteit van embryonale mesenchymale factoren zou de huidige inspanningen om insuline producerende beta-cellen van hESCs en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) als een mogelijke behandeling van diabetes genereren vergemakkelijken. Muis genetisch onderzoek leidde tot de identificatie van groeifactoren, zoals Fgf10, die worden geproduceerd door de pancreas mesenchym epitheel expansie bevorderen tijdens de vroege stadia van ontwikkeling van de pancreas3, 9. Met als doel het identificeren van bijkomende factoren tot expressie gebracht in embryonale mesenchym, die we deze cellen met behulp van laser gevangen microdissectie, geëxtraheerd hun RNA en uitgevoerd genexpressieanalyse 26. Echter, naast het feit arbeidsintensief Deze werkwijze berust op het identificeren van cellen op basis van morfologische kenmerken die het gebruik ervan ontwikkelingsstadia vóór de vertakking van het epitheel in het omringende mesenchym (dwz E12.5) beperkt. Mesenchymale cellen te karakteriseren in latere ontwikkelingsstadia, gebruikten we de werkwijze hier 5, 17 beschreven.

We gebruikten deze methode om oppervlakte marker expressie te analyseren door neonatale pancreas mesenchym 5. Bovendien werden mesenchymale cellen geïsoleerd uit embryonale en neonatale pancreas weefsel van Nkx3.2 -Cre; R26-EYFP muizen, op basishun fluorescerende labeling in deze muis lijn, en werden gekweekt cellijnen 17 vast te stellen. Het proteomische analyse van deze cellen toegestaan voor de identificatie van factoren afgescheiden door de alvleesklier mesenchym met het vermogen om hESC afgeleide pancreatische voorlopercellen 17 bevorderen. Verder hebben we gebruik gemaakt van deze cel isolatie methode om mesenchymale cellen te zuiveren van volwassen pancreas weefsels voor RNA-extractie en analyse van genexpressie 17. Daarom kan deze methode worden gebruikt om genen en eiwitten door de pancreas mesenchym uitgedrukt identificeren, met de mogelijkheid om pancreatische cel ontwikkeling te ondersteunen.

Pancreatische mesenchymale cellen werden verder aangetoond dat het een rol spelen pancreas tumorgenese. PDAC wordt gekenmerkt door de vorming van een fibroblast-rijke desmoplastisch stroma bestaat uit fibroblasten, immuuncellen en ECM 27. Terwijl de stroma werd gedacht dat de ontwikkeling van vele bevorderensoorten kanker, werd aangetoond dat progressie PDAC 15, 16, 28 beperken. Dit suggereert dat de onderdelen van de alvleesklier scheiden stroma factoren die tumorigenese te remmen. Bovendien veranderingen in stroma cellulaire samenstelling alsook in cel fenotype effect ervan ten grondslag liggen aan epitheliale cellen 15, 16, 28. De hier beschreven methode kan daarom helpen bij het karakteriseren van de verschillende soorten cellen die deel uitmaken van een PDAC stroma in vergelijking met gezonde pancreas weefsel. Het zou verder mogelijk de zuivering van de verschillende types stromale cellen om mogelijke veranderingen in de genexpressieprofielen te karakteriseren in PDAC progressie. Echter, als gevolg van veranderingen in de pancreas ECM samenstelling tijdens tumorigenese 27, aanpassingen van het weefsel verteringsparameters, zoals het opnemen van Additional types collagenase of verhogen van de incubatietijd, nodig zijn.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs danken Adi Sasson voor de technische assistentie en Helen Guez voor de kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door European Research Council starting grant nr. 336204.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Collagenase PRoche11213865001
DNaseSigma-AldrichD5025-15KUDe effectieve eenheden moeten minimaal 2.000 eenheden/mL eiwit zijn
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS)Sigma-AldrichH6648
Fetal Bovine Serum (FBS)Biological Industries04-127-1A
EDTABiological Industries01-862-1A
Sodium AzideSigma-AldrichS2002
Goat IgG serumSigma-AldrichG9023
DAPISigma-AldrichD9542
RNAse inhibitorInvitrogenN8080119
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Invitrogen11965092
L-GlutamineBiological Industries03-020-1B
Penicillin-streptomycinBiological Industries03-031-1B
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537Zonder Calcium Chloride en Magnesium Chloride
1.5 mL tubesSarstedt72 690
15 mL conical tubeCorning430052
Round Bottom Polystyrene 5 mL tubeCorning352008FACS tube. Zorg ervoor dat de buis compatibel is met de te gebruiken flow cytometer, aangezien er kleine verschillen zijn in de vereiste buizen tussen merken
5 mL tube with 35 μm cell strainer Snap CapCorning352235FACS tube
70 μm cell strainer Miltenyi Biotec130-098-462
Heating block with agitation EppendorfThermoMixer C
CentrifugeThermoFisherHeraeus Megafuge 40R
SteromicroscopeNikonSMZ 745
Cell sorterBD BiosciencesFACSAria IIu
flow cytometerBeckman CoulterGallios 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
  2. Cabrera, O., Berman, D. M., Kenyon, N. S., Ricordi, C., Berggren, P. -O., Caicedo, A. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
  3. Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Developmental biology. 326 (1), 4-35 (2009).
  4. Villasenor, A., Cleaver, O. Crosstalk between the developing pancreas and its blood vessels: An evolving dialog. Seminars in cell & developmental biology. , 1-8 (2012).
  5. Landsman, L., Nijagal, A., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), e1001143(2011).
  6. Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
  7. Pierreux, C. E., Cordi, S., et al. Epithelial: Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas. Developmental biology. 347 (1), 216-227 (2010).
  8. Golosow, N., Grobstein, C. Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis. Developmental biology. 4, 242-255 (1962).
  9. Bhushan, A., Itoh, N., et al. Fgf10 is essential for maintaining the proliferative capacity of epithelial progenitor cells during early pancreatic organogenesis. Development. 128 (24), 5109-5117 (2001).
  10. Larsen, B. M., Hrycaj, S. M., Newman, M., Li, Y., Wellik, D. M. Mesenchymal Hox6 function is required for mouse pancreatic endocrine cell differentiation. Development. 142 (22), 3859-3868 (2015).
  11. Sasson, A., Rachi, E., et al. Islet pericytes are required for beta-cell maturity. Diabetes. 65 (10), 3008-3014 (2016).
  12. Stanley, S. A., Kelly, L., et al. Bidirectional electromagnetic control of the hypothalamus regulates feeding and metabolism. Nature. 531 (7596), 647-650 (2016).
  13. Brissova, M., Aamodt, K., et al. Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes β cell regeneration. Cell metabolism. 19 (3), 498-511 (2014).
  14. Nikolova, G., Jabs, N., et al. The vascular basement membrane: a niche for insulin gene expression and Beta cell proliferation. Developmental cell. 10 (3), 397-405 (2006).
  15. Rhim, A. D., Oberstein, P. E., et al. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer cell. 25 (6), 735-747 (2014).
  16. Özdemir, B. C., Pentcheva-Hoang, T., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer cell. 25 (6), 719-734 (2014).
  17. Russ, H. A., Landsman, L., et al. Dynamic Proteomic Analysis of Pancreatic Mesenchyme Reveals Novel Factors That Enhance Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Cell Differentiation. Stem cells international. 2016, 6183562(2016).
  18. Gout, J., Pommier, R. M., et al. Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells. Journal of Visualized Experiments. (78), e50514(2013).
  19. Verzi, M. P., Stanfel, M. N., et al. Role of the homeodomain transcription factor Bapx1 in mouse distal stomach development. Gastroenterology. 136 (5), 1701-1710 (2009).
  20. Tribioli, C., Frasch, M., Lufkin, T. Bapx1: an evolutionary conserved homologue of the Drosophila bagpipe homeobox gene is expressed in splanchnic mesoderm and the embryonic skeleton. Mech Dev. 65 (1-2), 145-162 (1997).
  21. Hecksher-Sorensen, J., Watson, R., et al. The splanchnic mesodermal plate directs spleen and pancreatic laterality, and is regulated by Bapx1/Nkx3.2. Development. 131 (19), 4665-4675 (2004).
  22. Walmsley, G. G., Rinkevich, Y., Hu, M. S. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift In Vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. , (2014).
  23. Morris, J. P., Greer, R., et al. Dicer regulates differentiation and viability during mouse pancreatic cancer initiation. PloS one. 9 (5), 95486(2014).
  24. Miyatsuka, T., Matsuoka, T. -A., et al. Chronological analysis with fluorescent timer reveals unique features of newly generated β-cells. Diabetes. 63 (10), 3388-3393 (2014).
  25. Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
  26. Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
  27. Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
  28. Raz, Y., Erez, N. An inflammatory vicious cycle: Fibroblasts and immune cell recruitment in cancer. Experimental cell research. 319 (11), 1596-1603 (2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Celisolatieweefseldigestiefluorescerende eiwittenoppervlaktemarkersRNA extractiecel sorterenmesenchymale cellenpancreasweefsel

Gerelateerde artikelen