Methodenartikel

Isolatie van circulerende tumorcellen in een orthotopische muismodel van colorectale kanker

DOI:

10.3791/55357

⸱

18 juli 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal, Thoracic and Vascular Surgery, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 2German Cancer Consortium (DKTK), 3German Cancer Research Center (DKFZ)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven de oprichting van orthotopische colorectale tumoren via injectie van tumorcellen of organoïden in de cecum van muizen en de daaropvolgende isolatie van circulerende tumorcellen (CTC's) uit dit model.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondanks de voordelen van makkelijke toepasselijkheid en kosteneffectiviteit, hebben subcutane muismodellen ernstige beperkingen en worden de tumorbiologie en tumorcel-verspreiding niet nauwkeurig gesimuleerd. Orthotopische muismodellen zijn geïntroduceerd om deze beperkingen te overwinnen; Dergelijke modellen zijn echter technisch veeleisend, vooral in holle organen zoals de dikke darm. Om uniforme tumoren te produceren die op betrouwbare wijze groeien en metastaseren, zijn gestandaardiseerde technieken van tumorcelbereiding en injectie kritisch.

We hebben een orthotopisch muismodel van colorectale kanker (CRC) ontwikkeld die zeer uniforme tumoren ontwikkelt en kan gebruikt worden voor tumorbiologie studies en therapeutische proeven. Tumorcellen uit primaire tumoren, 2-dimensionale (2D) cellijnen of 3-dimensionale (3D) organoïden worden geïnjecteerd in de cecum en, afhankelijk van het metastatische potentieel van de geïnjecteerde tumorcellen, vormen zeer metastatische tumoren. Daarnaast,CTC's kunnen regelmatig worden gevonden. Hier beschrijven we de techniek van tumorcelbereiding uit zowel 2D-cellijnen als 3D-organoïden, evenals primair tumorweefsel, de chirurgische en injectietechnieken, alsmede de isolatie van CTC's uit de tumorhoudende muizen en de huidige tips voor het oplossen van problemen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Colorectale kanker (CRC) is een van de meest voorkomende oorzaken van kanker dood in westerse landen. 1 Terwijl de primaire tumor vaak kan worden geresecteerd, verergert het voorkomen van verre metastasen de prognose dramatisch en leidt vaak tot de dood. 2 , 3 Het biologische correlaat van de metastase is circulerende tumorcellen (CTC's), die losmaken van de tumor, in de circulatie overleven, aan het epithelium in het doelorgaan vallen, het orgaan binnendringen en uiteindelijk uitgroeien tot nieuwe letsels. 4 Hoewel CTC's van prognostische relevantie bekend zijn, zijn 5 , 6 , 7 , 8 , 9 hun biologie slechts gedeeltelijk begrepen als gevolg van hun uiterste zeldzaamheid in CRC. 10

Muismodellen zijn een krachtige tOol om diverse aspecten van kankerbiologie te bestuderen. Klassieke subcutane tumormodellen worden geproduceerd door subcutane injectie van tumorcellen in ontvangermuizen, die immunocompetente kunnen zijn (indien syngeneuze muizen tumorcellen worden gebruikt) of immunodeficient. Subcutane tumormodellen zijn goedkoop en produceren data snel; Hun eindpunt tumor groei kan gemakkelijk en niet-invasieve gemeten worden. 88% van de nieuwe verbindingen die antitumoractiviteit in dergelijke modellen hebben aangetoond, falen echter in klinische studies. 11 Dit is mede te danken aan interspecies verschillen tussen mensen en muizen; Een groot deel van deze mislukking is echter te wijten aan de lage voorspellende waarde van subcutane muismodellen.

Orthotopische muismodellen, waarin de tumorcellen worden geïnjecteerd in het orgaan van herkomst en dus groeien in hun oorspronkelijke micro-omgeving, worden daarom steeds meer gebruikt bij kankeronderzoek. 11 , 12 , 13 , 14 Orthotopische modellen simuleren niet alleen lokale tumorgroei condities; Door de anatomisch correcte plaats van tumorgroei kunnen orthotopische muismodellen ook realistische simulatie van metastase mogelijk maken en worden daarom gebruikt om CTC biologie 8 , 15 , 16 of hun reactie op verschillende behandelingen in CRC te bestuderen. 13 , 17

Een belangrijk nadeel van orthotopische muismodellen is hun technische complexiteit. Afhankelijk van het orgaan waarin de cellen worden geïnjecteerd, is de leercurve tot de experimentator in staat om reproduceerbare tumoren te induceren, vrij lang. Dit geldt vooral voor colonectale kankermodellen, aangezien de tumorcellen in de darmmuur moeten worden geïnjecteerd, wat vaak resulteert in perforatie, tumorcellekkage of endoluminale tumorcelverlies. Dit isArtikel is bedoeld om de methode van celbereiding te beschrijven van primaire weefselmonsters, 2D-cellijnen en 3D-organoidcultuur en hun injectie in de cecum van muizen. De hier beschreven techniek leidt tot zeer gelijkmatige tumoren en, afhankelijk van de tumorbiologie van de cellijn die gebruikt wordt voor injectie, reproduceerbare vorming van verre metastasen en CTC's in de ontvanger muizen. 15

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier gepresenteerde dierproeven werden onafhankelijk beoordeeld en toegestaan ​​door een institutioneel en een overheidsdier voor dierenwelzijn en gebruik en werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Federatie van Laboratorium Diervoederverenigingen (FELASA). Alle mogelijke maatregelen werden genomen om het lijden te verminderen, met inbegrip van verdoving en analgesie of, indien nodig, vroegtijdige euthanasie.

1. Bereiding van cellen en organoïden

OPMERKING: Gebruik een volume van 20 μL met 100.000 cellen voor elke injectie. Gebruik basementmembraanmatrix (BMM) om lekkage te voorkomen en een gestandaardiseerde injectie te waarborgen. Om de reproduceerbare resultaten te waarborgen, moet u met regelmatige intervallen celleline authentication analyses uitvoeren ( bijvoorbeeld via STR profilering).

  1. Bereiding van primaire cel suspensies van vers weefsel
    OPMERKING: Werk altijd onder steriele omstandigheden. Onmiddelijke overdracht van de versGeresecteerd weefsel van de operatiekamer naar het laboratorium op ijs is nodig om de levensvatbaarheid van de cellen te waarborgen.
    Het welzijn van de patiënt en de optimale behandeling moeten altijd de eerste prioriteit zijn. Daarom moeten weefselmonsters voor onderzoek worden verkregen op een manier die geen interferentie met de daaropvolgende pathologische opbouw en opstelling van de gereserveerde tumor. In de meeste gevallen is het daarom redelijk om de monsters te hebben voor onderzoek verkregen door een getrainde patholoog om ervoor te zorgen dat de pathologische diagnose niet wordt verstoord.
    1. Onmiddellijk na steriele verwijdering van het geresecteerde monster (ideaal ~ 1 cm 3 ), plaats het weefselmonster in een 50 ml buis, vooraf gevuld met 20-30 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Bewaar de buis op ijs en breng onmiddellijk naar het laboratorium.
    2. Leg het weefsel in een Petri-schotel en doe het tweemaal met veel PBS om het resterende bloed te verwijderen.
    3. Snijd het weefsel in kleine stukken (~ 2-4 mm) met een scaLpel ( bijv . Met een # 20 of # 36 blad).
    4. Gebruik de dissociator volgens de instructies van de fabrikant om het tumorweefsel verder te dissociëren naar een enkelcelsuspensie. Alternatieven, gebruik andere protocollen van enzymatische tumorvertering.
    5. Tel de cellen van de resulterende enkelcelsuspensie ( bijv . In een coulterteller of een hemocytometer).
    6. Centrifuge (5 minuten bij 1.500 xg) en was de cel suspensie tweemaal met PBS.
    7. Resusteer de cellen in BMM bij een concentratie van 5 x 10 6 cellen / ml en houd ze op ijs.
  2. Bereiding van cellijnen voor injectie
    1. Groei alle cellijnen van de colorectale kanker onder de normale cultuuromstandigheden (37 ° C, 5% CO 2 ) en bereiding op de dag van de operatie.
    2. Oog de cellen volgens de standaardcellen voor culturele cellen, tel de cellen ( bijv . In een coulterteller of een hemocytometer) en bereken de reqOngewenste hoeveelheid voor alle injecties afhankelijk van het aantal geïnjecteerde dieren.
    3. Bereid 3-5x van het daadwerkelijk benodigde volume om rekening te houden met pipetteringsverliezen en het dode volume van de injectiespuit.
    4. Centrifuge (5 minuten bij 1.500 g) en was de cel suspensie tweemaal met PBS.
    5. Resusteer de cellen in BMM bij een concentratie van 5 x 10 6 cellen / ml en houd ze op ijs.
  3. Organoïde bereiding
    OPMERKING: Alle 3D organoïdeculturen worden gekweekt onder standaard cultuuromstandigheden (37 ° C, 5% CO 2 ). Gedetailleerde protocollen voor organo-cultuur zijn eerder gepubliceerd. 18 , 19 , 20 In vergelijking met conventionele cellijnen adviseren we een volume van 20 μL BMM met 100.000 cellen per injectie. De organoïden worden op de dag van de operatie opgesteld als volgt:
    1. Bereid het volgende medium voor (in de volgende verwijzingAls DMEM / F12 +++): Geavanceerde Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutamine (200 mM) + 1% Penicilline / Streptomycine.
    2. Pre-fill 15 ml buizen met 1 ml DMEM / F12 +++.
    3. Sorg de organoïden zorgvuldig uit het oppervlak van de kweekplaat en verplaats de inhoud van 3 tot 5 putjes in een 15 ml buis.
    4. Pak de organoïden zorgvuldig in kleinere stukken door ze op en neer te pipetteren met een verlengde glazen pipet.
    5. Voeg 5 ml DMEM / F12 +++ aan de buis toe, gevolgd door centrifugeren bij 1000 xg gedurende 5 minuten.
    6. Verwijder na het centrifugeren de supernatant, resuspendeer de pellet in 600 μl enzymatische dissociatiebuffer en draag de suspensie over naar een putje van een 6-putjesplaat.
    7. Incubeer gedurende 1-5 minuten bij 37 ° C en pipet de suspensie op en neer met zorg om de organoïden op te lossen.
      OPMERKING: Controleer de spijsvertering via microscoop; Het is compleet als alle celclusters zijn gedistribueerdD naar enkele cellen.
    8. Na succesvolle spijsvertering, voeg 1,4 ml DMEM / F12 +++ toe om de spijsvertering te stoppen. Vervolgens alle putjes van verteerde organoïden overbrengen naar een 50 ml buis.
    9. Tel de cellen en bereken de benodigde hoeveelheid voor alle injecties.
    10. Bereid 3 - 5x van het daadwerkelijk benodigde volume om rekening te houden met pipetteringsverliezen en het dode volume van de injectiespuit
    11. Centrifuge (5 minuten bij 1.500 xg) en was de cel suspensie tweemaal met PBS.
    12. Resuspendeerde de cellen in BMM tot een concentratie van 5 x 10 6 cellen / ml en houd ze op ijs.

2. Orthotopische muismodel

  1. Voorbereiding van ontvanger dieren voor operatie
    OPMERKING: Gebruik 6-8 week oude NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) muizen als ontvangers. 21 NSG behoren tot de meest immunocompromised muizen, die volwassen B, T en NK cellen ontbreken, samen met meerdere andere immunefects. 21 Ze groeien betrouwbaar tumoren, zelfs als lage cijfers worden geïnjecteerd en zeer gevoelig zijn voor verre metastasen. NSG muizen zijn uitstekende fokkers en kunnen worden bewaard in conventionele specifieke pathogeenvrije (SPF) eenheden.
    1. Voor de eerste incisie injecteer 0,05 mg / kg buprenorfine subcutaan.
    2. Gebruik sevofluraan bij 3-3,5 vol% voor algemene verdoving. Een verlies van de teenvliesreflex geeft voldoende narkose aan.
    3. Bedek de ogen van de verdoofde muizen met oftalmische zalf om uitdroging van de hoornvlies te vermijden.
    4. Houd de muizen in een rugliggende positie op een kleine tafel.
    5. Scheer de buik met een elektrische scheerapparaat (afzettende crème kan alternatief worden gebruikt) en desinfecteren met ten minste 3 keer clorhexidine / jodium en 70% alcohol.
    6. Bedek het chirurgische veld met steriele gordijnen.
      OPMERKING: Het gebruik van perioperatieve antibiotica is facultatief en onderworpen aan institutionele richtlijnen.
  2. Midline laparotomie en blootstelling van de cecum
    1. Gebruik een schaar (scalpels kunnen alternatief worden gebruikt) om een ​​kleine middenlijninsnijding (3 - 5 mm) van de huid op de onderbuik te maken. Pak de buikspiermuskulatuur op met pincet en zorg het voorzichtig met een schaar, zodat de buikholte wordt geopend.
    2. Identificeer en zorgvuldig exterieur de cecum met atraumatische tang. Plaats het blinde uiteinde van de cecum op de buik die craniaal wijst.
    3. Eens exterieur, houd de cecum vochtig met behulp van warme zoutoplossingen te allen tijde.
  3. Orthotopische injectie, sluiting van de buik en postoperatieve herstel
    1. Voor intracale injectie, gebruik een standaard 1 ml spuit met een 30 G canule. Monteer deze spuit op een microinjectiepomp, die op zijn beurt wordt gemonteerd op een micromanipulator.
    2. Grijp het punt van de cecum zorgvuldig met atraumatische pincet en verzacht het zachtjes door het naar beneden te buigenD met een tweede reeks tangjes bevochtigd met warme zoutoplossing.
    3. Plaats de canule direct boven de cecum.
    4. Voer de volgende stappen uit onder visuele controle met een binoculaire chirurgische microscoop.
    5. Pak de cecum voorzichtig met twee atraumatische tangen aan beide uiteinden van het buitenste gedeelte van de cecum, steek het licht uit en trek het langzaam over de canule, die parallel en recht boven is geplaatst. Het is van cruciaal belang de gehele darmmuur niet te perforeren (waardoor de cellen in het lumen worden ingezet), evenals de serosa niet te perforeren boven het beginpunt van de penetratie, omdat dit lekkage en peritoneale verspreiding zou veroorzaken.
      1. Verplaats de darm naar de canule, niet de canule naar de darm. Houd de darm vast tussen twee tangen. De handen van de chirurg moeten op een oppervlak rusten om tremor te verminderen.
    6. Spuit de cellen tussen de serosa (gezien als zeer dun, doorschijnend voering boven deE intramurale bloedvaten) en de muscularis. De canule moet dus visueel boven de bloedvaten en onder het dunne doorschijnende membraan worden geplaatst.
    7. Gebruik een voetschakelaar om de injectie te starten om tremor te verminderen terwijl de canula in de darmwand ligt.
    8. Zodra de canule in positie is, start de injectie. Gebruik een duur van 20 s, wat resulteert in 1 μL / s instelling op de besturing van de pomp.
      OPMERKING: De injectie in of nabij een beschadigd bloedvat leidt tot directe intravasculaire verspreiding en verre metastase en moet daarom vermeden worden.
    9. Na de injectie af te maken, verwijder de canule zorgvuldig door deze naar achteren te trekken.
    10. Plaats een droge zwabber onder de cecum en doe de cecum grondig met gedestilleerd water om lekcellen te lichten en voorkom kunstmatige peritoneale verspreiding.
  4. Sluiting van de buik en postoperatieve herstel
    1. Na rTerugzetten, de cecum voorzichtig terugzetten naar de buikholte.
    2. Sluit de buikwand met 6-0 snel absorbeerbare lopende hechtingen.
    3. Sluit de huid met chirurgische wondklemmen.
    4. Plaats de muis op een verwarmingscartridge die ingesteld is op 38 ° C tot het volledig is hersteld van de verdoving.
    5. Let op de postoperatieve conditie van de muizen voor de volgende 48 uur. In geval van nood behandel u elke 12 uur met 0,05 mg / kg buprenorfine.
    6. Monitor de muizen ten minste eenmaal per dag voor tekenen van nood als gevolg van tumorgroei.

3. Isolatie van circulerende tumorcellen uit hele bloedmonsters

OPMERKING: Verkrijg bloed door transcutane hartsporing op verdovende muizen, gevolgd door euthanasie. Ideaal gezien worden 1000 μL bloed getrokken in een spuit die wordt gevuld met 100 μl van een anticoagulant (Ethyleendiamintetraazijnzuur (EDTA) of heparine). Gebruik een anti-humaan-EpCAM (epitheliale celadhesieMolecuul) antilichaam om de CTC's te identificeren. Dit werkt zeer goed als menselijke epitheliale cellijnen worden gebruikt in het muismodel. Voor andere apparaten kunnen verschillende antilichamen nodig zijn.

  1. CTC verrijking:
    1. Voorvervul 15 ml buizen met 5 ml dichtheidsgradiëntmedium en plaats het bloed zorgvuldig in de 15 ml buis.
    2. Centrifuge (30 minuten bij 300 xg zonder rem) en verwijder de bovenste supernatant zorgvuldig.
    3. Giet de rest in een nieuwe 15 ml buis en centrifugeer (15 min, 300 xg met rem).
    4. Herstel de interfase die de mononucleaire cellen bevat (verwijder de rest) en doe de cellen tweemaal met PBS.
    5. Resulteer de pellet in 200 μl PBS / 1% EDTA en voeg 4 μL EpCAM antilichaam toe. Incubeer 20 minuten op ijs in het donker.
  2. Screening en plukken
    1. Bereid de volgende buffer voor (in het volgende aangeduid als plukbuffer): PBS + 10% foetaal kalfserum (FCS) + 1% Penicilline / STreptomycine (1%) + 0,8% EDTA.
    2. Gebruik een PAP-pen om een ​​cirkel van ongeveer 1 cm in een 6 cm steriele Petri-schaal te trekken (voorkomt dat de vloeistof in de schotel verspreidt), en pipet 700 μL plukbuffer in deze cirkel.
    3. Voeg 50 μL cel suspensie toe aan de 700 μL plukbuffer binnen de cirkel. Controleer de dichtheid van cellen met de microscoop. Verdeel het monster in verschillende gerechten als het te dicht is.
    4. Wacht tot de cellen zich neerzetten (~ 5 min).
    5. Scherm de druppel cel suspensie voor gekleurde (= EpCAM-positieve) cellen.
    6. Zodra een cel is gevonden, kies de cel met de micromanipulator en zet het in 50 μL buffer, afhankelijk van de beoogde stroomafwaartse analyse ( bijv . RNA-extractiebuffer of cultuurmedium).
    7. Afhankelijk van de beoogde stroomafwaartse analyses isoleren EpCAM-negatieve cellen en / of medium als negatieve controles.
    8. Ga door met downstream analyses ( bijvoorbeeld celcultuur, PCR).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De succesvolle en reproduceerbare generatie van colorectale tumoren in dit model hangt kritisch af van de nauwkeurige injectie van de cellen zonder spleten of lekkage. Als dit bereikt wordt, is dit model extreem betrouwbaar en resulteert het zeer zelden in kunstmatige peritoneale verspreiding. De groeikinetiek van de tumoren, evenals hun verspreidingspatronen, is afhankelijk van de biologie van de gebruikte organoïden en cellen. 15 Terwijl HCT116-cellen op betrouw...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondanks hun preclinisch bewezen activiteit in subcutane muismodellen, falen de grote meerderheid van de nieuwe verbindingen in klinische proeven en bereiken ze nooit de kliniek. 11 Deze duidelijke tekort aan subcutane muismodellen om de biologie en groeipatronen van tumoren nauwkeurig te simuleren heeft geleid tot de ontwikkeling van orthotopische muismodellen op basis van de injectie van tumorcellen direct in het oorspronkelijke orgaan.

Orthotopische muismodellen kun...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (WE 3548 / 4-1) en Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cell culture Media and Components
Advanced DMEM F12Invitrogen12634010DMEM/ F12 +++ medium
HEPES (1 M)Life Technologies GmbH15630056DMEM/ F12 +++ medium
Glutamax-I Supplement (200 mM)Life Technologies GmbH35050038DMEM/ F12 +++ medium
Penicillin/Streptomycin (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122DMEM/ F12 +++ medium
DMEMLife Technologies GmbH61965026basis medium van 2D cel lijnen (DMEM/10% FCS)
Fetal Calf Serum (FCS)BIOCHROM AGS 0115basis medium van 2D cel lijnen (DMEM/10% FCS)
TrypLE Express enzymatische dissociatie bufferLife Technologies GmbH12604021
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free)CORNING B.V. Life Sciences356231
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineLife Technologies GmbH14190169
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red)Life Technologies GmbH25200072
6-/48-well platen met dekselCORNING3516/3548
cel cultuur flacon 75 cm², 250 mLVWR International GmbH734-2066
cel cultuur flacon 150 cm², 600 mLCorning B.V. Life Sciences355001
Eppendorf buisjes 1,5 mL / 2 mLSarstedt AG & Co.72.706.400/ 72.695.400
15 mL, 50 mL centrifuge buisjesGreiner-Bio-One GmbH188271/227270
TC10 Telling Slides (voor TC20 Telling Machine)Bio-Rad Laboratories GmbH1450016
Pasteur pipetten (glas, 150 mm)Fisher Scientific GmbH11546963/ FB50251dun getrokken door gebruik van een bunsenbrander
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235voor primaire tumor weefsel bereiding
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec130-090-753voor primaire tumor weefsel bereiding
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237voor primaire tumor weefsel bereiding
Human Tumor Dissociation KitMiltenyi Biotec130-095-929voor primaire tumor weefsel bereiding
Falcon 70 µm Cell StrainerCorning B.V. Life Sciences352350voor primaire tumor weefsel bereiding
NaamBedrijfCatalogus nummerOpmerkingen
Chirurgische apparatuur
SevofluraanAbbVie Germany GmbH & Co. KG-
Medische zuurstofAir Liquide Medical GmbH-
BuprenorfineTemgesic-
Bepanthen - oogzalfBayer Vital GmbH10047757
Normale zoutoplossing 0.9% (E154)Serumwerk Bernburg AG10013
Aqua ad injectabiliaBraun235144
1 mL spuit (zonder dood volume) - Injekt-F SOLOBraun/neoLab194291661
30G injectienaaldBECTON DICKINSON304000
cellulose tamponsLohmann & Rauscher Deutschland13356
Micro-Adson ForcepsFST - Fine Science Tools11018-12
Iris Scissor - ToughCutFST - Fine Science Tools14058-11
Olsen-Hegar Needle HolderFST - Fine Science Tools12002-12
AutoClip KitFST - Fine Science Tools12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (chirurgische hechting)Johnson & Johnson Medical GmbHZ1012H
Table Top Research Anesthesia Machine met O2 Flush en een Sevofluraan VerdamperParkland ScientificV3000PS/PK
UltraMicro Pomp met Micro4 ControllerWorld Precision InstrumentsUMP3-4apparatuur voor zeer gecontroleerde orthotopische injectie
Voetschakelaar voor SYS-Micro4 ControllerWorld Precision Instruments15867apparatuur voor zeer gecontroleerde orthotopische injectie
Drie-as handmatige micromanipulatorWorld Precision InstrumentsM325apparatuur voor zeer gecontroleerde orthotopische injectie
Magnetische standaard voor micromanipulatorWorld Precision InstrumentsM10apparatuur voor zeer gecontroleerde orthotopische injectie
Stalen basisplaat voor M10 magnetische standaardWorld Precision Instruments5479apparatuur voor zeer gecontroleerde orthotopische injectie
Hot Plate 062Labotect13854
Isis - Haar scheerapparaatAESCULAP - Braun-
Binoculaire chirurgische microscoopParkland ScientificVS-2Z
NaamBedrijfCatalogus nummerOpmerkingen
CTC isolatie
EDTARoth8040.1
Dichtheidsgradiënt medium – FicollStemCell - Lymphoprep7801
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antilichaam klon 9C4BioLegend324210
Alexa Fluor 488 anti-muis CD326 (EpCAM) Antilichaam klon G8.8BioLegend118210
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², VentG

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
  2. Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
  3. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
  4. Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
  5. Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
  6. Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).
  7. Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).
  8. Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).
  9. Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).
  10. Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  11. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  12. Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
  13. Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
  14. Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4 (11), e1042201(2015).
  15. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
  16. Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
  17. van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  19. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  21. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  22. Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82(2013).
  23. Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484(2007).
  25. Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).
  26. Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).
  27. Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7 (351), ra107(2014).
  28. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
  29. Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).
  30. Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).
  31. Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Injectie van tumorcellencaecale injectiedichtheidsgradi ntcentrifugatieCTC isolatiechirurgische techniektumormetastase

Gerelateerde artikelen