Methodenartikel

Snelle en Geraffineerde CD11b magnetische Isolatie van Primary Microglia met verbeterde zuiverheid en veelzijdigheid

9.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55364

⸱

13 april 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Sciences & Iowa Center for Advanced Neurotoxicology, Iowa State University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol microglia van postnatale muizen pups isolaat (dag 1) voor in vitro experimenten. Deze geïmproviseerde winmethode genereert zowel hoge opbrengst en zuiverheid, een significant voordeel boven alternatieve werkwijzen die breed experimenten met het oog op toelichting van microgliale biologie maakt.

Samenvatting

Microglia zijn de primaire responders centrale zenuwstelsel beledigingen; Echter, er nog veel onbekend over hun rol in het reguleren van inflammatoire processen. Microglia zijn mesodermale cellen die op dezelfde functie om macrofagen te onderzoeken inflammatoire stress. De klassieke (M1-type) en alternatieve (M2-type) activering van macrofagen zijn ook uitgebreid tot microglia in een poging om beter inzicht in de onderliggende wisselwerking deze fenotypen hebben neuroinflammatoire aandoeningen zoals Parkinson, Alzheimer en Huntington ziekten. In vitro experimenten met behulp van primaire microglia biedt snelle en betrouwbare resultaten die kunnen worden uitgebreid tot de in vivo omgeving. Hoewel dit een duidelijk voordeel in vivo experimenten, isoleren microglia terwijl toereikende opbrengst optimale zuiverheid is een uitdaging. Gemeenschappelijke methoden die momenteel in gebruik ofwel lijden hebben van lage herstel, lage zuiverheid, of beide. Hierin we demonstrate een verfijning van de kolomvrije CD11b magnetische scheidingswerkwijze die een hoge terugwinning van cellen en verhoogde zuiverheid helft van de tijd bereikt. Wij stellen dit geoptimaliseerd methode als een zeer bruikbaar model van de primaire microglia isolatie ten behoeve van het bestuderen van neuro-inflammatie en neurodegeneratie.

Inleiding

Microglia zijn Myb onafhankelijk macrofagen van mesodermale oorsprong, die onderscheiden van c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitorcellen in het bloed eilandjes van de dooierzak 1, 2. Zodra embryologische microglia het centrale zenuwstelsel (CNS) hebben gekoloniseerd, die overstappen van een amoeboid een vertakte vorm 3. Deze volwassen microglia worden geclassificeerd als surveillant omdat hun dynamische vertakkingen sonde het gezond hersenweefsel voor potentiële beledigingen 4. Hoewel microglia enkel bij tot ongeveer 10% van het CZS celpopulatie, gaf aan tegels onderling verzekert maximale aftasten van het parenchym 4, 5. Risico-geassocieerde moleculaire patronen (gedempt), zoals α-synucleïne 6, 7 en amyloid-β 8 of pathogen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) zoals lipopolysaccharide (LPS) 9, klassiek activeren microglia een ontstekingsreactie gekenmerkt door terugkeer naar de amoeboid actieve toestand en de productie van stikstofoxide, tumornecrosefactor-α (TNFa), interleukine 1β bevorderen (IL-1β), IL-6, IL-12, en de chemokine CC motief ligand 2 9, 10, 11. In neuro aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, waarbij pathogene α-synucleïne heeft verzameld, wordt een neurodegeneratieve cyclus gecreëerd uit de dood van dopaminergische neuronen, die meer geaggregeerd α-synucleïne vrij, verdere bevordering klassieke activering van microglia 7. Soortgelijke perifere macrofagen, microglia kunnen ook de mogelijkheid om afwisselend te activeren in aanwezigheid van de anti-inflammatoire cytokines IL-4 en IL-10, waardoor ze de krachtigeial van het bevorderen van neurale reparatie en verzachtende ontsteking 2, 11. Naast hun immunologische rol in het CZS, zijn microglia beschreven als essentieel regulatoren van neuronale circuits door snoeien synapsen tijdens de ontwikkeling. Bijvoorbeeld Cx3cr1- KO muizen hebben minder dicht microglia en verminderde pruning, wat leidt tot een overvloed aan dendritische onvolgroeide synapsen en elektrofysiologische patronen een onderontwikkelde CNS 12. Inzicht in deze complexe fysiologische en diverse functionele rol van microglia in de homeostase van het CZS is cruciaal voor het onderzoek naar therapeutica gericht neurodegeneratieve aandoeningen.

Op het gebied van Neuroimmunology, in vitro experimenten zijn zeer gewenst vanwege de grotere haalbaarheid van mechanistische studies, lagere onderhoudskosten en minder tijds- en arbeidsintensief. Furthermoopnieuw, het vermogen om celpopulaties te isoleren is van cruciaal belang om de functionaliteit van deze doelcellen af ​​te bakenen onder de voorgeschreven omstandigheden. Tal van microglia isolatie methoden bestaan, maar ze zijn beperkt door hun vermogen om relatief grote aantallen en zuiverheid te verkrijgen voor breed georiënteerde experimenten 13, 14, 15. Bijvoorbeeld, een cluster van differentiatie 11b (CD11b) is een gemeenschappelijk oppervlak marker monocyten, macrofagen en microglia 16. Door gebruik CD11b werd een werkwijze voor magnetische scheiding eerst beschreven als een kolom benadering die leverde ~ 99,5% zuiverheid ~ 1,6 x 10 6 microglia per hersenschade 17. Ons laboratorium onlangs een kolomvrije CD11b magnetische scheidingswerkwijze 15, die we in een polystyreen buis uitgevoerd door tagging CD11b met een monoklonaal antilichaam geconjugeerd aan fycoerythrine (PE). Een bispecifiek secondary antilichaam voor PE en dextran complexen met PE. Eenmaal gebonden worden met dextran beklede magnetische deeltjes geïntroduceerd, die binden aan het dextran einde van de antilichaamcomplex. Ten slotte wordt de polystyreen buis in een magneet voor microgliale isolatie. Deze benadering verdubbelde de opbrengst ~ 3,2 x 10 6 microglia per neonatale hersenen, maar ten koste van het verminderen zuiverheid ~ 97%.

Hierin tonen we een snelle en geraffineerde kolomvrije CD11b magnetische scheidingsprotocol (figuur 1). Deze verbeterde werkwijze blijft uitvoerbaar als onze oorspronkelijke kolomvrije methode, omdat de prijs van het CD11b magnetische scheidingskit hetzelfde. De doorlooptijd is gehalveerd, die cruciaal zijn voor het maximaliseren van celoverleving en opbrengst kan worden. Met name de bereikte zuiverheid van deze geoptimaliseerde methode ~> 99%, een duidelijke verbetering ten opzichte van de bereikte zuiverheid van de oorspronkelijke kolomvrije ontwikkeld door ons laboratorium 15. Belangrijker nog, CD 11-PEwordt niet gebruikt, waardoor de noodzaak om weg te incuberen tegen licht en die het gebruik van het rode kanaal voor fluorescentiemicroscopie. Tenslotte, zoals in het oorspronkelijke CD11b werkwijze kan een fractie van astrocytische hoge opbrengst en zuiverheid wordt verkregen met deze verbeterde werkwijze. Astrocyten de meest talrijke gliacellen in het centrale zenuwstelsel, wat leidt tot het idee dat hun homeostatic functies zijn onmisbaar in relatie tot de pathofysiologie 18. Deze gliale cellen spelen een rol bij verschillende fysiologische functies zoals het vormen van de bloed-hersenbarrière, die voedingsstoffen ondersteunen, handhaven neurotransmitter homeostase, vormen gliale litteken in reactie op verwonding, neurobescherming, leren en geheugen, en zenuwontsteking, als voorbeeld hun onderzoeks- potentieel gliale 19 biologie. Morfologie en functionaliteit van microglia en astrocyten zijn vastgesteld via confocale microscopie, Western blotting, kwantitatieve Real-time PCR (qRT-PCR), GRiess nitriet assay en de Luminex multiplex cytokine assay. De verfijning die door dit protocol biedt meer vertrouwen met betrekking tot de microglia of astrocytaire zuiverheid, ruimere toepassing van fluorescentiemicroscopie met de beschikbaarheid van het rode kanaal, en bespaart tijd, die van belang zijn voor in vitro experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het gebruik van de dieren en procedures protocol werden erkend en gecontroleerd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Iowa State University (Ames, IA, USA)

1. Teelt van Mixed glialculturen

  1. Onthoofden 1- 2 dagen oude pups snel 5,5 inch bedienen scharen, en plaats de koppen direct in een 50 ml buis op ijs. Merk op dat deze onthoofding is de wijze van euthanasie.
  2. In een laminaire luchtstroom kap, een kleine incisie in de schedel en hersenvliezen gebruik 4,5 inch rechte micro-ontleden schaar. Gaan knippen uit het caudale einde naar het einde rostrale (neus). Verkrijg onder de huid via de opening gevormd door onthoofding.
    1. Na de incisie schil een van de hemisferen opzij. gebruik dan een paar gebogen of verslaafd pincet om de gehele hersenen verwijderd.
  3. Dompel de hersenen (en) in een nieuwe buis van 50 ml met 0,25% trypsine-ethylenediaminetetraacetat acid (EDTA) gedurende 15 minuten in een 37 ° C waterbad. Gebruik 2 ml trypsine-EDTA per brein.
  4. Was de hersenen (en) met verse groeimedia (10% FBS DMEM / F12, 1% penicilline / streptomycine, 1% L-glutamine, 1% natriumpyruvaat en 1% niet-essentiële aminozuren) door het toevoegen en verwijderen van de media. Herhaal dit 4x.
  5. Voor elk brein plaat twee T-75 flessen met groeimedium. Daarom, voeg 2 ml kweekmedium per brein naar de buis. Het zal dus een equivalent van 1 ml van de gehomogeniseerde hersenen met 8-9 ml kweekmedium per T-75 kolf zijn.
  6. Homogeniseren van tritureren de hersenen (en) met pipetten van verschillende openingsafmetingen, zodat van groot naar klein. Wanneer het zichtbaar dat het hersenweefsel niet kleiner, overgang naar de volgende pipet. Aan het einde van het fijnwrijven dient de suspensie helder zijn, zonder zichtbare stukjes.
    1. Gebruik een pipet 25 ml, 5 ml pipet, en daarna een 10 ml pipet achtereenvolgens.
  7. Pass elk homogEnous hersenen suspensie door een 70 urn cel zeef om het in een celcultuur.
  8. Voor elke hersenen gehomogeniseerd, platen twee T-75 kolven die groeimedia, zoals beschreven in stap 1.5 (1 ml gehomogeniseerde hersenen met 8-9 ml kweekmedium per T-75 fles).
  9. Verander groeimedia na 6 d en te groeien tot isolatie op de 16 ste dag.

2. Isolatie van microgliacellen

  1. Na 16 dagen, verwijder het groeimedium uit de kolf en plaats deze in een verse 50 ml buis. Voeg 3 ml 0,25% trypsine-EDTA bij elke T-75 kolf. Schud de flessen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale schudinrichting.
    1. Centrifugeer de verwijderde groeimedia 0.4 xg gedurende 5 minuten en om de trypsine-EDTA reactie in de daaropvolgende stap te stoppen.
  2. Na schudden gedurende 5 minuten, voeg minimaal 4 ml groeimedia (vers of het gebruikte medium vanaf 2.1.1) aan de trypsine-EDTA reactie te stoppen.
  3. Vermaal om ervoor te zorgen dat alle cells zijn losgemaakt.
  4. Na wrijven, laat de cellen door een 70 urn cel zeef om het in een celkweek, uitvoeren van een celtelling en vervolgens Draai de cellen bij 0,4 x g gedurende 5 min.
  5. Per 100 x 10 6 cellen (ongeveer 15 x T-75 kolven), gebruik 1 ml aanbevolen media (2% FBS, DPBS (calcium- en magnesiumchloride-vrij), 1 mM EDTA) aan de celpellet opnieuw te suspenderen.
    Opmerking: Alle volgende stappen zijn toegesneden op een 1 ml scheiding.
  6. Neem een ​​5 ml polystyreen buis, voeg 1 ml Aanbevolen Media en markeer de meniscus. Voeg Aanbevolen Media tot 2,5 ml en markeer dit als goed. Gooi de aanbevolen media en breng de opnieuw gesuspendeerde cellen de 5 ml polystyreen buis.
  7. Voeg 50 ul van rattenserum voor elke 1 ml gesuspendeerde cellen. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Start het selecteren cocktail door mengen van 25 pl van component A en 25 pl component B. Deze componenten zijn eigendom.
  9. Voeg 501, l de selectie cocktail aan de cellen. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    LET OP: Voor zuiverder culturen, herhaalt u stap 2.9 (aanbevolen maar niet verplicht).
  10. Vortex microsferen gedurende 45 s. Voeg 80 ul van microbolletjes per 1 mL monster. Incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  11. Breng het volume op 2,5 ml in de polystyreen buis door toevoeging van de aanbevolen media.
  12. Zet de buis de magneet gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Pas de incubatie om de zuiverheid te verhogen. Giet langzaam het aanbevolen media in een 15 ml buis met de magneet nog in de polystyreen buis.
  13. Herhaal stap 2.12 drie keer. Aanvullende magnetische incubaties worden uitgevoerd om de zuiverheid te verhogen.
  14. Voeg 3 ml groei media en tel het aantal cellen met behulp van een cel teller.
  15. Plaat cellen dienovereenkomstig Poly-D-Lysine (PDL) beklede platen behandelingen. Behandel de cellen 48 uur na uitzetten inPDL beklede platen. Dit maakt het mogelijk de cellen om te herstellen van de stress van de scheiding.
    LET OP: Check de zuiverheid van de kweek gebruik immunocytochemie zoals hiervoor 15 beschreven.
  16. Plaat de negatieve fractie (verzameld in een 15 ml buis), die meestal bestaat uit astrocyten in T-75 kolven in groeimedium.
  17. Na tenminste 6 uur incubatie bij 37 ° C incubator, veranderen middellange en laten groeien O / N. Splits de astrocyten de volgende dag voor behandelingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Microglia geïsoleerd met behulp van CD11b positieve selectie kit II hebben een hoge zuiverheid

Primaire muis microglia werden geïsoleerd met behulp van de bovengenoemde protocol en uitgeplaat op poly-D-lysine beklede dekglaasjes de zuiverheid van isolatie te controleren. Tienduizend cellen per putje en immunocytochemische analyse werd uitgevoerd met geïoniseerd calciumbindende adaptermolecuul 1 (Iba1) als een marker van microglia...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Oudere microgliale isolatiemethoden hebben beperkte terugwinning die niet geschikt zijn voor verschillende eiwitten geanalyseerd door Western blot en RNA werden geanalyseerd aan qRT-PCR. De differentiële hechting en milde trypsinisatie methoden zijn twee algemene benaderingen lage opbrengsten microgliale 13, 14, 15. De kolommen gebaseerde benadering CD11b ook geringe hoeveelheid, maar realiseert grotere zuiverheid dan different...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) Subsidies: NS088206 en ES026892. De W. Eugene en Linda Lloyd leerstoel aan AGK en Deans hoogleraar aan AK worden hierbij ook erkend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
EasySep CD11b Separation Kit IIStemCell Technologies18970
EasySep MagnetStemCell Technologies18000
DMEM/F12 (1:1) (1x)Life Technologies11330057
Sodium PyruvateLife Technologies11360070
MEM Non-essential amino acids (100x)Life Technologies11140050
L-Glutamine (100x)Life Technologies25030081
EDTAFisher ScientificAM9260G
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma13H469
0.25% Trypsin-EDTAGibco by Life Technologies25200
Dulbecco's PBS (DPBS)Gibco by Life Technologies14190250

Referenties

  1. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  2. Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
  3. Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
  4. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  5. Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
  6. Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
  7. Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease. Neuroscience. 302, 89-102 (2015).
  8. Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84(2011).
  9. Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
  10. Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally? Neuroscience. 302, 59-73 (2015).
  11. Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
  12. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  13. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  14. Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
  15. Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
  16. Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
  17. Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
  18. Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
  19. Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
  20. Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
  21. Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Celseparatiemagnetische bolletjescelzuiverheidcelopbrengstflowcytometrieWestern blotimmunocytochemiecelkweek

Gerelateerde artikelen