Sequentiële zout extracties uit te voeren voor de analyse van Bulk chromatine bindende eigenschappen van chromatine complexen wijzigen

Summary

Sequentiële zout winning van chromatine gebonden eiwitten is een nuttig instrument voor het bepalen van de bindende eigenschappen van grote eiwitcomplexen. Deze methode kan worden gebruikt om te evalueren van de rol van individuele subeenheden of domeinen in de algehele affiniteit van een eiwit complex om te bulk chromatine.

Abstract

Opheldering van de bindende eigenschappen van chromatine-targeting eiwitten kunnen zeer uitdagend vanwege de complexe aard van de chromatine en het heterogene karakter van de meeste zoogdieren chromatine-aanpassen complexen. Om deze hindernissen te overwinnen, hebben wij een sequentiële zout winning (SSE) assay voor het evalueren van de relatieve bindende verwantschappen van chromatine-gebonden complexen aangepast. Deze test gemakkelijk en eenvoudig kan worden gebruikt door niet-deskundigen om te evalueren van het relatieve verschil in bindende affiniteit van twee verwante complexen, de veranderingen in de affiniteit van een complex als een onderdeel verloren is gegaan of een per individueel domein wordt geïnactiveerd en de verandering in bindende affiniteit na veranderingen in het landschap van de chromatine. Door sequentieel schorsing opnieuw bulk chromatine in steeds grotere hoeveelheden zout, kunnen we de elutie van een bepaald eiwit van chromatine profile. Met behulp van deze profielen, zijn wij in staat om te bepalen hoe wijzigingen in een complex van chromatine-aanpassen of veranderingen in het milieu van de chromatine van invloed zijn op bindende interacties. SSE koppeling met andere tests in vitro en in vivo , we kunnen het vaststellen van de rollen van afzonderlijke domeinen en eiwitten op de functionaliteit van een complex in een verscheidenheid van chromatine omgevingen.

Introduction

Verordening van het DNA in eukaryote cellen is een ingewikkelde en geavanceerde systeem dat strak wordt beheerd door een assortiment van proteïnen toe die reacties op intracellulaire en extracellulaire stimuli coördineren. DNA is gewikkeld rond Histon octamers aan vorm nucleosomes, die losjes kunnen worden gedistribueerd langs DNA of gecomprimeerd in strakke spoelen¹. Deze structurele regeling van DNA en histonen staat bekend als de chromatine, die wordt geregeld door een netwerk van proteïnen toe die lezen, schrijven en wissen van bericht vertalende wijzigingen (PTM) op histonen². Sommige Histon PTMs, zoals acetylation, wijzigen de lading van het aminozuur dat ze worden afgezet, veranderen van de interacties tussen histonen en DNA². Histon PTMs dienen ook te werven transcriptionele regelgevers, chromatine remodelers, DNA schade reparatie machines en DNA replicatie machines voor specifieke gebieden van het genoom³.

De meeste methoden voor het bestuderen van de chromatine interacties sonde kleinschalige interacties of grote genoom-brede analyse te betrekken. In vitro studies van bindend gebruiken vaak individuele recombinante domeinen met Histon peptiden of DNA in assays zoals elektroforese mobiliteit shift assays (EMSA), isothermische titratie calorimetrie, fluorescentie polarisatie en peptide pulldowns. Omdat deze gehaltebepalingen typisch op een individuele eiwit-domein richten, zij vergemakkelijken het begrip van een klein stukje van de puzzel, maar niet toestaan ons te begrijpen van de coöperatieve aard van meerdere domeinen eiwitten, laat staan hun rol in meerdere eiwit complexen. Een andere laag van complexiteit wordt toegevoegd door de heterogene samenstelling van de meeste zoogdieren chromatine-aanpassen complexen. Deze heterogeniteit van eiwitten, maakt in combinatie met het dynamische karakter van het landschap van de chromatine, het uitdagend om te recapituleren de in vivo interacties van chromatine eiwitten binden aan chromatine in vitro.

In vivo methoden hebben gemaakt vooruitgang; ze zijn echter vaak duur, tijdrovend en technisch uitdagende. Chromatine immunoprecipitation gevolgd door sequencing (ChIP-seq) is zeer nuttig voor de bepaling van de lokalisatie van eiwitten en histone modificaties in het genoom, maar het vereist aanzienlijke optimalisatie⁴. Eiwitten zijn vaak kruisverwijzende aan chromatine te behouden interacties; echter dit kunstmatige interacties kan produceren en epitoop maskeren⁵kan veroorzaken. Bovendien, de immunoprecipitations (IP) vereist zeer specifieke antilichamen en uitgebreide optimalisatie van DNA schuintrekken en IP-voorwaarden door ChIP-qPCR met behulp van een bekende bindende site, die vaak niet beschikbaar een priori is. Na optimalisatie van ChIP voorwaarden, verwerking van de monsters is kostbaar en vereist enkele weken tot maanden volgnummer te analyseren. Hoewel deze methode is van onschatbare waarde voor het identificeren van de lokalisatie van de chromatine eiwitten gebonden in het genoom, de kosten en tijd inzet maken het onbetaalbaar te gebruiken deze methode voor het genereren van hypothesen over hoe de kleine wijzigingen van invloed kunnen zijn op de internationale bindende eigenschappen .

In dit artikel beschrijven we hoe een sequentiële zout winning (SSE) assay te onderzoeken van globale bindende profielen van chromatine-gebonden eiwitten en onderscheiden hoe wijzigingen in een eiwit, complexe of global PTM profiel interacties kunnen veranderen kan worden gebruikt. Hoewel zout extracties een algemeen en in het algemeen gebruikte techniek zijn, we laten zien hoe deze sequentiële methode is zeer reproduceerbaar en veelzijdig. SSE laat ons toe om karakteriseren hoe een enkele subeenheid van een complex of zelfs een enkel domein draagt bij aan de algehele affiniteit van het complex voor bulk chromatine. SSE kan ook worden gebruikt om te bepalen als de binding van een eiwit wordt beïnvloed door veranderingen in de chromatine landschap, bieden interessante hypothesen voor het targeten van Histon mark die kunnen worden bevestigd met behulp van de ChIP-seq en andere genoom-brede studies.

We oorspronkelijk aangepast deze methode van Wu et al., te onderzoeken van de functie van Polybromo1 (PBRM1) in de binding van de PBAF chromatine remodeler^6,7. Met behulp van deze techniek, we bepaald de rol van PBRM1 voor de chromatine binding binnen de PBAF chromatine remodeling complexe en vervolgens bepaald de relatieve bijdrage van de zes afzonderlijke bromodomains aan deze functie⁷.

Hier beschrijven we hoe het optimaliseren van deze methode om te verkennen van de binding van de chromatine in verschillende soorten cellen, om te beoordelen van de affiniteit van de relatieve binding van soortgelijke chromatine wijzigen complexen, te onderzoeken van de verplaatsing van een eiwit van chromatine door een chemische inhibitor, en om te bepalen van de effecten van chromatine bindend na veranderingen in het landschap van de chromatine.

Protocol

1. voorbereidingen

1. bereiden 100 mL hypotone oplossing Buffer A: 0,3 M sacharose, 60 mM KCl, 60 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA, en 0,5% NP-40. Bewaren bij 4 ° c.
   Opmerking: Sommige cellijnen, zoals HEK293T, vereisen minder strenge lysing voorwaarden. Als kernen lyse gemakkelijk, gebruik bewerkt Buffer A: 25 mM HEPES pH 7,6, 25 mM KCl, 5 mM MgCl ₂, 0.05 mM EDTA, 0,1% NP-40 en 10% glycerol.
2. Bereiden een 250 mL stockoplossing van 2 x mRIPA-oplossing: 100 mM Tris pH 8.0, 2% NP-40, en 0,5% natrium deoxycholate.
3. Bereiden een 100 mL stockoplossing van 5 M NaCl.
4. 50 mL 1 x mRIPA-oplossing voor elk van de zes concentraties van zout met behulp van de 2 x mRIPA en 5 M NaCl oplossingen, bereiden: 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM en 500 mM NaCl. Voordat u het experiment start, cool alle oplossingen op ice.
5. Groeien cellijnen gewenste omstandigheden.
   Opmerking: Bij het bepalen van de effecten van een eiwit neerhalend, SSE voor de vechtpartij lijn moet worden vergeleken met wildtype cellen. Deze SSE moet naast elkaar worden uitgevoerd. Voor voorbeelden met behulp van chemische inhibitoren of prikkels, verwijzen naar secties 3-5.

2. Fundamentele sequentiële zout winning

1. oogst 8 miljoen cellen van elk voorwaarde en was tweemaal met telkens 5 mL van ijs koud PBS.
   Opmerking: Het is cruciaal voor het gelijke aantal cellen dat gelijkwaardige eiwit concentraties. Het exacte aantal cellen mogelijk moet worden geoptimaliseerd voor individuele cellijnen of bepaalde eiwitten. Het is belangrijk om niet te veel, zoals de toename van de concentratie van het eiwit voorkomt observatie van de elutie-curve, die afhankelijk zijn van evenwicht bindend is. Echter, met te weinig cellen er mogelijk niet voldoende eiwit te sporen van de curve en de chromatine pellet is moeilijker te isoleren en kunnen verloren gaan tussen breuken.
2. Resuspendeer de cellen in 1 mL Buffer A + proteaseinhibitors, Pipetteer in 1,5 mL micro centrifuge buizen, en draaien boven over bodem bij 4 ° c gedurende 10 minuten
3. Isoleren de kernen door centrifugeren bij 6000 x g gedurende 5 min bij 4 ºC.
   Opmerking: Na deze stap de nucleaire envelop moet wel intact. Als de nucleaire envelop intact is, zal de pellet resuspendeer volledig; echter, wanneer de envelop is lysed en de chromatine wordt losgelaten, de pellet zal niet opnieuw opschorten. Als de nucleaire envelop na een incubatieperiode van Buffer A niet intact is, gebruikt u bewerkt Buffer A.
4. Voeg toe 200 µL van mRIPA 0 mM NaCl + protease remmers aan elke kernen pellet voordat de pellet opnieuw wordt verbroken. Meng elk monster door 15 keer pipetteren met een pipet 1 mL. De pellet moet resuspendeer gemakkelijk, echter de kernen zal lyse zoals het is afgepipetteerde en het monster wordt dik en kleverig en moeilijk te Pipetteer.
   1. Om de opstelling de pellet in de tip, tikt u op het einde van de pipet tip tegen de bodem van de centrifugebuis. De pellet zal niet volledig oplossen zodra het DNA wordt vrijgelaten uit de kernen, maar pipetteren het omhoog breken zal
5. Wanneer alle de monsters hebben zijn gehomogeniseerd, incubeer alle monsters op het ijs gedurende 3 minuten
   Opmerking: De incubatietijd moet worden geoptimaliseerd afhankelijk van de proteïne van belang.
6. Isoleren chromatine pellet door centrifugeren van de monsters gedurende 3 minuten bij 6500 x g bij 4 ºC.
7. Overdracht supernatant aan een schone 1,5 mL centrifuge buis. Dit zal de Fractie 0 mM. Deze 0 mM mRIPA oplossing kan fungeren als een wassen stap naar lysis van de kernen en verwijder eventuele losse eiwitten niet geassocieerd met chromatine.
8. Voeg toe 200 µL van mRIPA 100 mM NaCl + protease remmers aan elke chromatine pellet voordat de pellet opnieuw wordt verbroken. De chromatine pellet breken door de pellet op en neer 15 keer pipetteren.
   Opmerking: Het is van cruciaal belang overeenstemming te zijn met het aantal keren de pellet in afgepipetteerde.
9. Incubate op ijs gedurende 3 minuten. Deze incubatietijd-stap kunt alle monsters te bereiken van een staat van evenwicht, die met name belangrijk is wanneer er meerdere monsters.
10. Centrifuge bij 6500 x g gedurende 3 minuten bij 4 ° c en overdracht supernatant aan een tube schoon 1,5 mL.
11. 2.6-2.10 Herhaal voor de resterende zout concentraties.
    Opmerking: Na 400 mM NaCl, mRIPA de pellet moet duidelijk en gloopy en zal niet blijven op de bodem van de buis. De pellet kan worden geplaatst in het deksel van de centrifugebuis terwijl het supernatant geïsoleerd.
12. Toevoegen 70 µL van 4 x eiwit laden kleurstof naar elke breuk en laden 30 µL van elke fractie op een SDS acrylamide gel voor westelijke vlekkenanalyse.
    Opmerking: Om te bepalen van het profiel van de binding van het eiwit, het is van cruciaal belang voor het laden van gelijkwaardige hoeveelheid lysate, in plaats van laden gelijk eiwit concentraties.
13. Een standaard westelijke vlek uitvoeren door op een membraan over te brengen en het gebruik van primaire antilichamen voor proteïnen van belang.
14. Naar het kwantificeren van het eiwit geëlueerd van de chromatine, Incubeer de vlek in infrarood fluorescentie IRDye secundaire antilichamen en afbeelding vlek met een imager. Terwijl andere soorten ontwikkeling kunnen worden gebruikt, we raden fluorescentie of infrarood imaging, aangezien er meer kwantitatieve aard.
15. Gebruik ImageJ of soortgelijke software voor de berekening van de intensiteit van het eiwit bij elke zoutconcentratie geëlueerd. Door de intensiteit van de band tegen de zoutconcentratie graphing, het patroon van de elutie van uw proteïne van belang kan worden bepaald.

3. Sequentiële zout winning in aanwezigheid van een " Reader " remmer

1. oogst van twee sets cellen (4 miljoen) en het isoleren van de kernen zoals in een standaard SSE.
2. Resuspendeer beide sets in 200 µL van mRIPA 0 mM NaCl en incubeer gedurende 3 minuten. Dit zal zorgen voor de verwijdering van alle gratis eiwit in de kernen.
3. Voeg toe 200 µL mRIPA 0 mM NaCl tot elke pellet. De Inhibitor van de omwenteling (2 µL van 1 mM (+) JQ1) met één monster en DMSO toevoegt aan de besturingsset.
4. Schudden de pellet door pipetteren 15 keer en incubeer op ijs gedurende 5 minuten
5. Centrifuge bij 6500 x g gedurende 3 minuten bij 4 ° c en overdracht supernatant aan een tube schoon 1,5 mL.
6. 3.3-4 Herhaal voor alle concentraties die het zout en het uitvoeren van een standaard westelijke vlek.

4. Sequentiële zout winning in aanwezigheid van een " schrijver " remmer

1. behandelen van cellen met de Inhibitor van de omwenteling (10 µM SAHA) of DMSO voor 3 h.
2. 4 miljoen cellen voor elke behandeling oogst.
3. Uitvoeren van een standaard SSE voor de monsters met de remmer toegevoegd aan alle de buffers.

5. Sequentiële zout winning volgende DNA schade

1. cellen met 1 µM Doxorubicine voor 1 h. behandelen
2. Wijzigen van de media op de cellen en laten herstellen voor 3 h.
3. Oogst van 8 miljoen cellen en het uitvoeren van de fundamentele SSE.

6. Niet-opeenvolgende zout winning

1. oogst van 12 miljoen cellen en wassen met PBS.
2. Kloof cellen zodat er 2 miljoen cellen per micro centrifugebuis.
3. Resuspendeer in 500 µL van Buffer A en incubeer gedurende 10 minuten
4. Isoleren van de kernen door centrifugeren op 6000 x g.
5. Resuspendeer pellets in een 200 µL van elk van de mRIPA buffers + NaCl.
6. Elk monster Meng door 15 keer pipetteren met een uiteinde van de pipet 1 mL.
7. Incubate op ijs gedurende 3 minuten
8. Isoleren van de chromatine door centrifugeren bij 6500 x g en breng de bovendrijvende vloeistof voor de reiniging van buizen. Voeg 70 µL van het laden van de kleurstof en 30 µL draaien op een SDS-pagina gel voor westelijke vlekkenanalyse.

Results

In deze paper tonen we de voordelen en toepassingen van de veelgebruikte sequentiële zout (SSE) extractiemethode die we vanuit de literatuur⁶hebben aangepast. In Figuur 1vergelijken we de reproduceerbaarheid van SSE met niet-sequentieel extraheren van eiwitten door het detecteren van de patronen van de elutie van ARID1a en PBRM1. We zien steeds dat ARID1a, een subeenheid van BAF, GC voornamelijk op 200 mM NaCl en PBRM1, een exclusieve ...

Discussion

Karakterisatie van eiwitten en chromatine interacties via zout extracties is een gemeenschappelijke methode die heeft gewerkt voor decennia^14,15; echter, het is niet systematisch geoptimaliseerd voor te onthullen zijn volle nut. We laten zien hoe deze sequentiële methode biedt een snelle en goedkope manier te onderscheiden van wijzigingen in de chromatine bindend wanneer het eiwit of het milieu wordt gewijzigd. SSE is zeer flexibel en optimaliseerbare, en nog bel...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS)	Avantor/Macron	7581-06
Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	8360-04
Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	6858-04
Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline	Sigma-Aldrich	T1503-1kg
EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS)	Avantor/Macron	4931-02
NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082	Amresco	E109-100ML
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630-080
Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	5958-04
GLYCEROL, 1L	Amresco	0854-1L
DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g	Amresco	0613-100G
Eppendorf Research plus pipette	Fisher Scientific	13-690-032
Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge	Eppendorf	5424 R
Secondary mouse IgG HRP-linked	Cell Signaling	7076
Secondary rabbit IgG HRP-linked	Cell Signaling	7074
BMI-1 antibody	Millipore
PBRM1 antibody	Bethyl	A301-591A
ARID1a antibody	Santa Cruz	sc-32761
BRD4 antibody	Bethyl	A301-9852a
(+) JQ1	Cayman Chemical Company	11187
SAHA	Cayman Chemical Company	10009929
Doxorubicin	AK Scientific	25316-40-9
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Macron	4948-02
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
Mini Gel Tank	ThermoFisher	A25977
Albumin, Bovine (BSA)	Amresco	0332-100g	Gebruikt in als een 5% oplossing in PBS-T als blokkerende oplossing voor Western blots
Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x)	Life Technologies	B0001
Bolt LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	B0007
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 tot 250 kDa	ThermoFisher	26619
Methyl Alcohol, Anhydrous	Macron	3041-10
Trypsin kEDTA, 1X	Cellgro	25-053-CI
SODIUM AZIDE, 250g UN1687	Amresco	0639-250G
SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325	Amresco	0227-500G
Glycine, voor elektroforese, >=99%	Sigma-Aldrich	G8898-1kg
BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene	VWR	20170-333
1000 µL Pipet Tips	VWR	83007-382
NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12%	Invitrogen	NW04125BOX
Leupeptin Hemisulfate, 5 MG	RPI Research Products	22035-0.005	Gebruikt voor Protease remmer oplossing.
APROTININ, 10 MG	RPI Research Products	20550-0.01	Gebruikt voor Protease remmer oplossing.
PEPSTATIN A, 5 MG	RPI Research Products	30100-0.005	Gebruikt voor Protease remmer oplossing.
OVCA429 cellen	Gift van Karen Cowden Dahl. Ph.D.
HEK293T	ATCC	CRL-3216
HeLa cellen	ATCC	CCL-2
McCoy's 5A media	Corning Mediatech	10-050-CV
DMEM	Corning Mediatech	10-013-CV
Minimum Essential Medium (MEM), Poeder	Corning Mediatech	50-011-PC
MEM NEAA (100X) niet-essentiële aminozuur	Gibco	11140-050
FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Bron	Omega Scientific	FB-11
Penicillin-Streptomycin Solution	Life Technologies	15140-122
Glutamax	Life Technologies	35050-061
sodium pyruvate	Life Technologies	11360070
VWR Power Source	VWR	13-690-032