Het modelleren van de ontwikkeling van de menselijke hersenen is belemmerd door de ongekende complexiteit van neurologisch epitheelweefsel. Hier wordt een methode beschreven voor de robuuste generatie van hersenorganoïden om vroege gebeurtenissen van de menselijke hersenontwikkeling af te bakenen en om microcefalie in vitro te modelleren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Genereren van iPSC afgeleide Human Brain Organoids naar Early Neurodevelopmental Disorders Model
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De beperkte beschikbaarheid van geschikte in vitro modellen die betrouwbaar complexe menselijke hersenontwikkeling kunnen vertegenwoordigen, is een belangrijke bottleneck die de vertaling van fundamenteel hersenonderzoek naar klinische toepassing beperkt. Hoewel geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) de ethisch omstreden menselijke embryonale stamcellen hebben vervangen, blijven iPSC-gebaseerde neuronale differentiatiestudies beschrijvend op cellulair niveau, maar slagen ze er niet in om adequaat de details te bieden die zouden kunnen worden afgeleid van een complex, 3D menselijk hersenweefsel.
Deze lacune wordt nu opgevuld door de toepassing van iPSC-afgeleide, 3D hersenorganoïden, "Hersenen in een schaal", die veel kenmerken van complexe menselijke hersenontwikkeling modelleren. Hier wordt een methode beschreven voor het genereren van iPSC-afgeleide, 3D hersenorganoïden. De organoïden kunnen helpen bij het modelleren van autosomaal recessieve primaire microcefalie (MCPH), een zeldzame menselijke neurodevelopmentele stoornis. Een algemeen aanvaarde verklaring voor de hersenmisvorming in MCPH is een uitputting van de neurale stamcelpool tijdens de vroege stadia van de menselijke hersenontwikkeling, een ontwikkelingsdefect dat moeilijk te recreëren of te bewijzen is in vitro.
Om MCPH te bestuderen, hebben we iPSC's gegenereerd uit patiëntafkomstige fibroblasten die een mutatie dragen in het centrosomaal eiwit CPAP. Door de ventrikelzone van microcefalie 3D hersenorganoïden te analyseren, toonden we de voortijdige differentiatie van neurale progenitors. Deze 3D hersenorganoïden zijn een krachtig in vitro systeem dat instrumenteel zal zijn bij het modelleren van aangeboren hersenaandoeningen veroorzaakt door neurotoxische chemicaliën, neurotrofe virale infecties of erfelijke genetische mutaties.
Inleiding
Menselijke neurologische stoornissen, zoals microcefalie, kan slechts slecht worden bestudeerd in diermodellen vanwege het feit dat de menselijke hersenen een verlengd corticale oppervlak, een unieke eigenschap die verschilt van niet-humane dieren.
Dit aspect maakt de ontwikkeling van menselijke hersenen een complex proces dat niet voldoende kan worden onderzocht in een 2D in vitro celcultuur. Opkomst 3D kweektechnieken kan de vorming van weefselachtige organoids van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). De in vitro differentiatie van pluripotente stamcellen in een 3D suspensiekweek maakt de vorming van verschill....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Generatie van Brain Organoids (23 dagen)
- Initiatie van neuroectoderm (5 dagen)
OPMERKING: De volgende punten moeten worden overwogen vóór het begin van differentiatie. Herprogrammering methode (lentiviral-, sendai-virus, episomal- of microRNA-gebaseerde etc.) aan humane iPSCs verkrijgen idealiter hetzelfde voor alle patiënten en controle iPSC lijnen. Verschillende herprogrammering kits en instructies op basis van gepubliceerde protocollen beschikbaar 15, 16, 17, 18. De kwaliteit van het menseli....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het genereren van hersenen organoids vereist ten minste drie weken continue kweek (Figuur 1A). Om reproduceerbare resultaten te bereiken, raden wij aan dat de onderzoeker documenteert elke stap en, belangrijker nog, vermijdt eventuele wijzigingen met betrekking tot medium componenten, tijdstippen, en de behandeling cel. Hier geven we een samenvatting van hoe om te evalueren of kritische mijlpalen zijn bereikt om organoids van voldoende kwaliteit aan het eind van het expe.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
MCPH is een complexe menselijke neurologische aandoening die niet in dierlijke modellen kunnen worden gerecapituleerd in vivo of in eenvoudige menselijke celculturen benaderingen in vitro. De klinische manifestatie van MCPH begint te verschijnen tijdens het eerste trimester, toen de eerste neurogenese begint. Zo 3D hersenen organoids vertegenwoordigen een betrouwbaar experimenteel systeem om MCPH ontwikkelingsmodel. Bovendien 3D menselijke hersenen organoids een ideale benadering omdat i) zij maken de .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Fritz Thyssen Foundation (Az.10.14.2.152). We zijn dankbaar voor het weefsel inbedding faciliteit en de microscoop kernfaciliteit van CMMC. We zijn dankbaar voor de besprekingen en technische steun van de leden van het Laboratorium voor centrosome en cytoskelet Biology. Wij danken Li Ming Gooi voor het nalezen van het manuscript.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Geit anti-Muis IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488 |
| Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Geit anti-Konijn IgG (H+L) Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 647 |
| Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B konijn polyklonaal antilichaam |
| CELLSPIN systeem | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4',6-Diamidino-2-fenylindole dihydrochloride; meerdere leveranciers |
| DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; meerdere leveranciers |
| Inbeddingsmedium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; inbeddingsmedium; meerdere leveranciers |
| Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-gekwalificeerde matrix; belangrijk: hESC gekwalificeerd |
| Visgelatine | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatine van koudgewater vishuid; meerdere leveranciers; autoclaveer na toevoeging aan PBS om op te lossen en te steriliseren, bewaar bij 4 °C |
| Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine voor moleculaire biologie; meerdere leveranciers |
| Inoculatiestaaf met naald, wegwerpbaar (1 µL) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | meerdere leveranciers |
| Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | meerdere leveranciers |
| L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
| Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
| Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural inductiemedium (NIM); neuraaal differentiatiemedium |
| Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural basaal medium |
| MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM niet-essentiële aminozurenoplossing (100x) |
| MycoAlert Mycoplasma Detectie Kit | Lonza, Zwitserland | #LT07-218 | Mycoplasma detectiekit; meerdere leveranciers |
| Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin muis monoklonaal antilichaam (4D11) |
| Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, oplossing bewaren bij -20 °C; voorzichtigheid: draag bescherming voor huid en ogen en werk onder de kap |
| PBS-tabletten | Gibco, US | 18912014 | Zie instructies van de fabrikant; meerdere leveranciers |
| Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Meerdere leveranciers |
| Poly-L-lysine-oplossing (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Meerdere leveranciers |
| pVim | MBL | D076-3S | Phosfo-Vimentin (Ser55) mAb |
| Reagens A | Stem cell technologies | # 05872 | Opmerking bij Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzymvrij selectie- en passagereagens voor humane ES- en iPS-cellen); volg het protocol van de fabrikant; alternatieve producten van meerdere leveranciers beschikbaar |
| Reagens B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase-oplossing is een enzymatische oplossing voor dissociatie van enkele cellen; meerdere leveranciers; protocol 1.1.2 "enzymatische celdissociatieoplossing” |
| Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Meerdere leveranciers |
| SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Meerdere leveranciers |
| Spinnerkolf 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
| Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Meerdere leveranciers |
| Superfrost ultra plus microscoopglazen | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Glazetten moeten worden gelabeld met een "+" en positief geladen |
| Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
| Supplement 2 zonder Vitamine A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamine A; meerdere leveranciers |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Meerdere leveranciers |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Meerdere leveranciers |
| Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Meerdere leveranciers |
| TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (konijn polyklonaal) |
| TUNEL-assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometrisch TUNEL-systeem; meerdere leveranciers |
| Tween 20 voor moleculaire biologie | AppliChem | A4974,0500 | Meerdere leveranciers |
| waterdichte folie | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; meerdere leveranciers |
| Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-remmer (Y-27632 2HCL); meerdere leveranciers |
| β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); meerdere leveranciers |
Referenties
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Na....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
