Methodenartikel

Visualiseren van angiogenese door Multiphoton microscopie In Vivo in genetisch gemodificeerde 3D-PLGA/nHAp steiger voor Calvarial kritische bot Defect reparatie

DOI:

10.3791/55381

⸱

7 september 2017

 ,  ,  , 
1Center for Translational Medicine Research and Development, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 2Department of Orthopedic Surgery, Maastricht UMC+, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital RWTH, 4Research Laboratory for Biomedical Optics and Molecular Imaging, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren bloedvat vorming in vivo en in real-time in 3D steigers door multiphoton microscopie. Angiogenese in genetisch gemodificeerde steigers werd bestudeerd in een lymfkliertest calvarial kritische bot defect model. Meer nieuwe bloedvaten werden ontdekt in de behandelde groep dan in besturingselementen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De wederopbouw van kritisch formaat bot gebreken blijft een ernstig klinisch probleem vanwege slechte angiogenese binnen weefsel-engineered steigers tijdens reparatie, die leidt tot een gebrek aan voldoende bloedtoevoer en veroorzaakt necrose van de nieuwe weefsels. Snelle vascularisatie is een essentiële voorwaarde voor nieuwe weefsel overleving en integratie met bestaande weefsel van de gastheer. De DOVO generatie therapieën in de steigers is een van de belangrijkste stappen in het maken van bot regeneratie efficiënter, waardoor herstel van weefsel te groeien tot een steiger. Om dit probleem aan te pakken, wordt de genetische modificatie van een steiger biomaterial gebruikt voor het versnellen van de angiogenese en osteogenesis. Visualiseren en bijhouden in vivo is bloedvat vorming in real time en in driedimensionale (3D) steigers of nieuwe botweefsel echter nog steeds een belemmering voor weefselengineering van bot. Multiphoton microscopie (MPM) is een roman bio-imaging modaliteit die volumetrische gegevens uit biologische structuren in een hoge resolutie en minimaal-invasieve manier verwerven kan. Het doel van deze studie was om te visualiseren angiogenese met multiphoton microscopie in vivo in een genetisch gemodificeerde 3D-PLGA/nHAp steiger voor calvarial kritische bot defect reparatie. PLGA/nHAp steigers werden matiemaatschappij voor de duurzame levering van een groeifactor pdgf-b gen uitvoering van lentivirale vectoren (LV -pdgfb), ter vergemakkelijking van de angiogenese en ter verbetering van de regeneratie van bot. In een scaffold-geïmplanteerd calvarial kritische bot defect muismodel, de bloedvat gebieden (BVAs) in PHp steigers waren aanzienlijk hoger dan in de steigers van de PH. Bovendien, verhoogd de uitdrukking van de pdgf-b en angiogenese-gerelateerde genen, vWF en VEGFR2, dienovereenkomstig. MicroCT analyse aangegeven dat de nieuwe biomineralisatie in de PHp groep drastisch verbeterd in vergelijking met de andere fracties. Om onze kennis is dit de eerste keer multiphoton microscopie werd gebruikt in bot-weefselengineering te onderzoeken van de angiogenese in een 3D bio-afbreekbaar steiger in vivo en in real-time.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bot is een zeer gevacuoliseerd weefsel dat blijft gedurende de looptijd van een individuele1remodelleren. De snelle en effectieve bot regeneratie van groot bot gebreken als gevolg van trauma, nonunion, resections van de tumor, of craniofaciale misvormingen is een complex fysiologische proces. Traditionele therapeutische benaderingen gebruikt voor bot defect reparatie omvatten autograft en allograft implantatie, maar hun gebruik gepaard gaat met meerdere problemen en beperkingen, zoals beperkte beschikbaarheid, belangrijke donor site morbiditeit, een hoog risico van infectie, en host immuun afwijzing2,3. Kunstmatige Bottransplantaten bieden echter een efficiënt alternatief voor het verlichten van deze beperkingen. Ze kunnen worden gemaakt van biologisch afbreekbare materialen, zijn eenvoudig te fabriceren worden met een geschikt poriegrootte en kunnen genetisch gemodificeerde4,5.

Op dit moment zijn verschillende weefsel engineering steigers tewerkgesteld in de ontwikkeling van de bot weefsel-engineered6,7. Om bot reparatie en regeneratie effectiever, hebben gemanipuleerde biomaterialen gecombineerd met groeifactoren ontstaan en bereikt goede resultaten8,9. Helaas, de korte halfwaardetijd, gemakkelijk-aan-lose activiteit en supraphysiological dosering van groeifactoren voor therapeutische werkzaamheid beperken hun klinische toepassing10. Om deze problemen, is de levering van groeifactor genen in plaats van groeifactoren aangetoond als een effectieve aanpak te handhaven topicale voor de behandeling van ossaal gebreken en ziekten11,12. Virale vectoren zijn veelbelovende levering hulpmiddelen voor weefselregeneratie vanwege hun hoge efficiëntie13uitdrukken.

Onder de groeifactoren, werd bloedplaatjes afkomstige groei factor (PDGF-BB) geselecteerd in deze studie want het is niet alleen een mitogeen en chemoattractant voor mesenchymale en osteogenic cellen, maar ook een stimulans voor angiogenese14,15 . Vorige preklinische en klinische studies toonden aan dat PDGF-BB veilig en effectief bot reparatie van parodontale werden gebreken16,17 bevorderen kan. Recente studies is gebleken dat PDGF-BB angiogenese door motiverende endothelial cel migratie en proliferatie in vivo18,19 stimuleert. Bovendien, PDGF-BB kunt ook renderen mesenchymale stamcellen (MSCs) geschikt voor differentiatie in de endotheliale cellen20, en deze verdere hoogtepunten van de potentiële rol van MSCs in neovascularization. De vorming van DOVO van therapieën in steigers met PDGF-BB inducerende is daarom een belangrijke stap voor de reparatie van weefsel uitgegroeid tot steigers in bot weefselengineering.

Bot defect genezing is een dynamische weefsel morfogenetische proces dat gecoördineerde osteogenesis en angiogenese aan de reparatie posities21 vereist. Neoangiogenesis in de geïmplanteerde weefsels-engineered steigers is een essentiële voorwaarde voor het verstrekken van cellen met voedingsstoffen en zuurstof voor groei en overleving en metabolische afvalstoffen verwijderen. Veelgebruikte methoden imaging, berekend met inbegrip van X-ray micro-tomografie (microCT), magnetische resonantie beeldvorming (MRI), scanning elektronen microscopie (SEM), optische coherentie tomografie (OCT) en confocale laser scanning microscopie, worden toegepast in plaats van histopathologisch onderzoek te verkrijgen van de angiogenese informatie22,23. Deze methoden worden echter verschillende obstakels in het visualiseren en het meten van neovasculature in 3D steigers in bot weefselengineering geconfronteerd. Multiphoton microscopie (MPM) is een relatief nieuwe bio-imaging techniek, die het duidelijke voordeel heeft van gelijktijdig visualiseren van cellen, extracellulaire matrix, en vasculaire netwerken rond in vivo. Het bezit van een inherente driedimensionale beeldvorming capaciteit voor diepe weefsel penetratie en lage photodamage veroorzaakt. Vandaar, in het laatste decennium, MPM heeft opgedaan veel aandacht in biomedische studies24, met inbegrip van in de neurowetenschappen, immunologie en dynamiek van de cel van de stam. Het wordt echter nauwelijks gebruikt in orthopedisch onderzoek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

de dierenverzorgers was met inachtneming van de gids voor de verzorging en het gebruik van laboratorium dieren van de Chinese provincie Guangdong. Alle procedures werden uitgevoerd onder het toezicht en de goedkeuring van de ethische commissie voor dier onderzoek, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academie van Wetenschappen.

1. lentivirale (LV) productie

  1. kloon de pdgf-b-cDNA in een vector van lentivirale expressie (pLenti6/5-eGFP of LV-eGFP) op een aangepaste meerdere-klonen site stroomafwaarts van de promotor van de cytomegalovirus met Spe ik en Sal Ik beperkingsplaatsen voor de bouw van de pLenti6/5-PDGFB-eGFP plasmide (LV - pdgfb) 25.
  2. Lentivirale deeltjes (LV - pdgfb) van HEK - 293 FT cellen produceren door co transfecting met virus verpakking plasmiden (pLP1, pLP2 en pVSV-G) met behulp van de methode standaard calciumfosfaat met chloroquine (eindconcentratie: 25 µM) 25.
  3. na 48u van transfectie, oogst en filteren van 500 mL virus-bevattende supernatant met een filter (0,45 µm). Vervolgens het concentreren van de virale deeltjes door ultracentrifugatie bij 89.000 x g gedurende 2 h. resuspendeer in 200 µL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), aliquoot, en bewaren bij -80 ° C.
  4. Om te bepalen van de titer van lentivirus, HEK293T cellen met serieel verdunde lentivirale oplossing gedurende 24 uur uit te broeden en berekenen van de lentivirale titer, als eerder beschreven 25.

2. Fabricage van 3D-gedrukte PLGA/nHAp steigers en LV immobilisatie

  1. ontbinding van 20 g van PLGA (Poly D, L-lactide-co-glycolide) materiaal in 20 mL van 1,4-dioxaan tot een homogene oplossing vormen. Voeg 2 g nanosized HAp (nano-hydroxyapatide) poeder (nHAp) aan de oplossing; de PLGA: nHAp verhouding moet 10:1 (w/w).
  2. Roer krachtig de gemengde oplossing (roeren snelheid: 1.500 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 16 uur een magneetroerder met een uniforme pasta. Het fabriceren in poreuze PLGA/nHAp steigers met behulp van een 3D-printer met lage temperatuur met een geautomatiseerde mondstuk die deposito's van de plakken laag-voor-laag, beneden naar boven, volgens een vooraf ontworpen model 26; de grootte van de poriën van de steigers variëren van 200 tot 400 µm.
  3. Vacuüm freeze-dry de steigers voor 48u oplosmiddel zo volledig mogelijk te verwijderen. Geniet van de steigers in 75% ethanol oplossing voor 1 h voor sterilisatie en lyophilize om neutraal, aseptische steigers.
    Opmerking: De belangrijke parameters voor vacuüm vriesdrogen omvatten de condensatie temperatuur (° C) en vacuüm graad (Pa). Onder een vacuüm mate van 45 Pa, de PLGA/nHAp steigers werden vacuüm bij-78 ° C gedurende 48 h grondig verwijderen het oplosmiddel gevriesdroogd.
  4. Voeg toe 10 µL van LV deeltjes (4.5 x 10 5) aan elke PLGA/nHAp steigerwerk (4 x 4 x 2 mm) en Incubeer de steigers gedurende 2 uur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator dat adsorptie.
  5. Na immobilisatie, spoel de steigers tweemaal met PBS om niet-afhankelijke LV deeltjes te verwijderen. Module-freeze de LV deeltje beklede steigers in vloeibare stikstof, weer lyophilize en opslaan bij-80 ° C voor toekomstig gebruik.

3. In Vitro Kinetiek van LV Particle Release van steigers en LV transductie activiteit Assay

  1. Incubate 3D steigers (4 x 4 x 2 mm) vervoeren LV-groene TL proteïne (LV-eGFP, 4.5 x 10 5 LV deeltjes) in 1 mL van de volledige DMEM in 2,0 mL Cryogene flesjes bij 37 ° C met 5 dagen schudden.
  2. Neemt een 1 mL monster elke 12 h vanaf 12u tot 120 h na incubatie en vervangen van het medium. Op elk tijdstip, voeg 1 mL verse medium in plaats van 1 mL van incubatie medium.
  3. De verzamelde media gebruiken om te transduce HEK293T cellen door mede aan het broeden voor 48 h. maatregel het aantal bioactieve LV deeltjes door het bepalen van het aantal HEK293T van GFP-positieve door stroom cytometry 27 cellen.
    1. Voordat de transducing van de HEK293T cellen, verwijdert u het kweekmedium en spoel de cellen van de HEK293T twee keer met PBS. Voeg het verzamelde medium met lentivirus vrijgelaten uit de steigers aan de put (1 mL/putje) en cultuur met de cellen van de HEK293T gedurende 48 uur bij 37 ° C in een bevochtigde incubator.

4. In Vitro Beoordeling van migratie van beenmerg-afgeleide MSC (BMSC)

  1. voor de bepaling van de migratie, bereiden BMSCs tomaat fluorescente proteïne (BMSCs-T) en PDGF-BB eiwit (BMSCs-P) 28.
  2. De BMSC migratie assay uitvoeren met een Boyden kamer met behulp van een 24-well-plate en polycarbonaat filters met een poriegrootte van 8 µm.
    1. Plaats 0,5 mL BMSCs (5 x 10 4) transfected met LV tomaat fluorescente proteïne (BMSCs-T) in de bovenste holten uitdrukken. 0,5 ml van de BMSCs (2 x 10 5) transfected met LV PDGF-BB eiwit (BMSCs-P) in de lagere kamers uitdrukken.
  3. Opnemen van zes fracties in dit experiment en voeg 500 µL tot het onderste compartiment van elk putje.
    A. blanco controle, middellange serumvrij alleen
    B. FBS controle, middellange aangevuld met 10% FBS
    C. PDGF-BB control, 4 ng/mL PDGF-BB in serumvrij middellange
    D. PDGF-BB grijpen groep, PDGF-BB (4 ng/mL) en anti-PDGF-BB (4 ng/mL) polyclonal antilichaam in serumvrij middellange
    E. BMSC groep, 2 x 10 5 BMSCs in serumvrij middellange
    F. BMSCs-P-groep, 2 x 10 5 BMSCs-P in serum gratis middellange.
  4. Incubeer gedurende 48 h bij 5% CO 2 en 37 ° C in een bevochtigde incubator. Daarna de gemigreerde cellen aan de onderkant van de kamer te verwijderen en te verzamelen voor de kwantificering van het aantal BMSCs-T door stroom cytometry.
    1. Verwijderen gemigreerde cellen in de tweede kamer kant met behulp van een cel schraper en resuspendeer de gemigreerde cellen met 2 mL PBS. Het aantal gemigreerde BMSCs-T te kwantificeren door stroom cytometry 29.

5. Oprichting van een lymfkliertest Calvarial kritische bot Defect Model en steiger transplantatie

Opmerking: mannelijke BALB/c muizen (7 weken oud) werden gekocht van Guangdong medisch laboratorium dier centrum (Guangdong, China).

  1. Inschrijven totaal 42 mannelijke muizen voor het calvarial bot defect experimenteren. De muizen willekeurig te verdelen in drie groepen, met veertien in elke groep die ontvangen van de volgende behandelingen: groep A, geen implantaten; Groep B, PH steigers ingeplant (PLGA/nHAp); en groep C, PHp steigers ingeplant (PLGA/nHAp/LV-pdgfb).
  2. Anesthetize de dieren met de intraperitoneale toediening van natrium pentobarbital (50 mg/kg). Verwijder van bont met ontharende plakken en reinig de hoofdhuid met 75% alcohol oplossing alvorens de eerste snede. Herstellen van het hoofd van elke muis met een stereotactische instrument te houden nog steeds tijdens chirurgie.
  3. Maken van een eerste incisie met een scalpel en dan vergroten het with schaar maken een 1 cm lineaire huid incisie. Schraap het beenvlies uit het bot van de schedel te onthullen van het oppervlak van het bot van de schedel met behulp van een steriele wattenstaafje.
  4. Gebruiken een trephine burr te maken van een defect van de kritische-grootte 4 mm-diameter aan de linkerzijde van de snuituil- 30. Transplantatie van de steiger in het bot defect site.
    Opmerking: Kritische omvang gebreken (centrale effectenbewaarinstellingen) waren oorspronkelijk gedefinieerd als " de kleinst mogelijke tekengrootte intraosseous gewikkeld in een name bot en diersoorten die niet spontaan tijdens de levensduur van het dier genezen zal " In dit experiment, het defect van 4 mm-diameter een kritische omvang bot defect, is volgens de eerder studeren 31 , 32.
    5. Ophthalmic pincet
  5. gebruiken om het beenvlies terug kan zetten, zachtjes ter dekking van de chirurgische site. Suture de ingesneden huid met drie steken per cm.
  6. Uitvoeren vóór zorg. De pijnstillende buprenorfine (0,1 mg/kg) voor het verlichten van de pijn te beheren. Handhaven van de lichaamstemperatuur met een verwarming pad totdat het dier ontwaakt. Vervolgens, voederen van de dieren met het voedsel en water en opnemen van hun activiteit elke dag tot het einde van de test. Opmerking: Analgesia kan worden toegediend vóór de ingreep afhankelijk van uw lokale dierenverzorgers Comité richtsnoeren.

6. In Vivo Imaging gebrek angiogenese binnen the Bone met MPM

Opmerking: FITC-geconjugeerd 250 kD dextran (10 mg/mL) in een zoutoplossing werd intraveneus geïnjecteerd in muizen te verkrijgen van hoge-SNR (signaal-/ ruisverhouding) beelden van nieuwe bloedvaten volgens een eerdere studie 33. Let op: dit is een procedure overleving.

  1. monteren van het systeem van de multiphoton microscopie (MPM) voor twee-foton opgewonden fluorescentie (TPEF) en tweede-harmonische generatie signaal (SHG) imaging.
  2. Anaesthetize de dieren met een intraperitoneale injectie pentobarbital natrium (50 mg/kg) en de dieren op een verwarmingsplaat om hun lichaamstemperatuur bij 37 ° C gedurende de experimenten te immobiliseren. 3,0% Isofluraan gas in 100% zuurstof gebruiken om bevredigende anesthesie en analgesie tijdens de procedure. Intraperitoneally injecteren saline (200 µL/dier) ter voorkoming van uitdroging voor imaging.
  3. Tune de femtoseconde Ti-saffier-laser om 860 nm. Maken van een gebied van 512 x 512 µm bemonstering door het scannen van een paar galvo spiegels en gebruiken van NA1.0 water-immersie objectief naar focusthe excitatie lichtbundels in de steekproef en voor het verzamelen van de terugverstrooide TPEF/SHG signaal.
    Opmerking: De beeldvorming werd uitgevoerd op een home-build multiphoton microscopische imaging systeem (MPM). Tijdens imaging, een femtoseconde Ti-saffier-laser was afgestemd op 860 nm als de optimale excitatie golflengte. De laserstraal was raster gescand via een vliegtuig van de monster met behulp van een paar galvanometer spiegels. Na het passeren van een dichroïde spiegel van 685 nm, de straal was gericht op het model door een 20 X NA1.0-doelstelling. De geïnduceerde TPEF en SHG signalen waren verzameld door de dezelfde doelstelling. De signalen waren afgesplitst van de laser van excitatie door de dichroïde spiegel hierboven vermeld en gezuiverd door een 680 nm korte-pass filter. De TPEF en SHG signalen waren verzameld door een vezelbundel en geleid tot een spectrograph. De detector op de spectrograph was een lineaire reeks van fotomultiplicator buizen (PMTs). De combinatie van spectrograph en lineaire matrix PMTs bood de mogelijkheid om het signaal opnemen in 16 opeenvolgende spectrale banden, vanaf 400 nm tot 600 nm, 12,5-nm tussenpozen. Daarom werden de TPEF en SHG signalen gedetecteerd op hetzelfde moment en gescheiden in spectrale domeinen. Bovendien, voor 3D-beeldbewerking, een axiaal motor werd gebruikt om de beeldvorming diepte. Het gebied van elke afbeelding is ingesteld op 512 x 512 µm en de diepte-interval is ingesteld op 2 µm (controlegroep, 5 µm). Met name 5 sites op elk defect waren beeld om statistisch significante gegevens te verzamelen, en de geselecteerde imaging sites werden gelijkmatig en willekeurig verspreid langs de defect.
  4. Scan 5 sites op elk gebrek te verzamelen van statistisch significante gegevens voor het meten van de vorming van het schip.
    1. Gebruik scannen sites gelijkmatig en willekeurig verdeeld langs het gebrek. Voor de controlegroep, het gebied van (FOV) dekking bekijken, zowel het oorspronkelijke bot-gebied en de rand van het gebrek echter voor de PH en PHp groepen, hebben de FOV op de geïmplanteerde steiger.
    2. Maken van een 1-cm lineaire huid incisie met behulp van een scalpel en suture van de open huid aan de fixatie te onthullen van de transplantatie-site. Gebruik een spuit om een druppel water tussen de dompelen lens en transplantaties te vormen van een waterglas.
  5. Ophaal afbeelding wordt gestapeld elke 12 s meer dan een 2 h imaging periode. Weergeven en analyseren van de volumetrische gegevens met behulp van een aangepast programma MATLAB en kwantificeren van de bloedvat-gebieden met ImageJ software 34 , 35.

7. Gen expressie analyse van de pdgf-b en angiogenese-gerelateerde genen door RT-qPCR

Opmerking: PCR werd uitgevoerd volgens de gebruikelijke stappen: 95 ° C gedurende 30 s, 40 cycli van 95 ° C voor 5 s en 60 ° C gedurende 30 s. Post-PCR smelten curven bevestigd de specificiteit voor single-target-amplificatie, en de verandering van de vouw van het gen van belang ten opzichte van de β-actine werd bepaald. De reactie voor elk monster driemaal werd getest.

  1. Oogst geïmplanteerd steigers en weefsels van de experimentele muizen op 2, 4 en 8 weken na operatie 36; controle van monsters van de groep (n = 4), genomen op dezelfde tijd punten, moet uit de aangrenzende botweefsel.
    Opmerking: Op elk tijdstip (2, 4 en 8 weken), euthanized de muizen met CO 2 inademing. Ontleden de snuituil, vervolgens verwijderen en oogst van de geïmplanteerde steigers van de snuituil.
  2. Gebruiken een commerciële reagens uitpakken van de totaal RNA van elk monster volgens de fabrikant ' s-protocol. De omgekeerde transcriptie Kit gebruiken om te keren-transcriberen het RNA in cDNA na de fabrikant ' s-protocol.
  3. Uitvoeren kwantitatieve PCR in real time met behulp van de SYBR Green Detection System; de inleidingen zijn vermeld in tabel 1.
Primer(5'–3')
gen voorwaarts omgekeerde
pdgfb CATCCGCTCCTTTGATGATCTT GTGCTCGGGTCATGTTCAAGT
vWF CTCTTTGGGGACGACTTCATC TCCCGAGAATGGAGAAGGAAC
VEGFR2 GAAATGACACTGGAGCCTACA AG TCCATGCTGGTCACTAACAGAA G
β-actine GTATCCATGAAATAAGTGGTTAC AGG GCAGTACATAATTTACACAGAAG CAAT

tabel 1: Pimer Sets.

8. MicroCT analyse van bot regeneratie

  1. euthanaseren muizen met CO 2 inademing bij 8 weken na operatie. In een goed geventileerde omgeving, zachtjes plaats elke muis in een kooi schoon muis en CO 2 gas pomp in de kooi om de muizen voordat de euthanasie anaesthetize.
  2. Ontleden de schedel voor beeldvorming van de microCT van het bot defect regio. De volgende gebruiker scanparameters in de experimenten: 9 µm resolutie, Al 0,5 mm filter, 50 kV spanning en 142 µA huidige.
  3. Reconstruct alle imaging gegevens met behulp van commerciële software verstrekt door het bedrijf. Kalibreren van de scans die met behulp van de kalibratiefunctie van een software CTAn.
    BEMERKING: Plaats een Hounsfield-eenheid (HU) onder de muizen in elke scan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cilindrische poreuze PLGA/nHAp steigers 0.6 mm in hoogte en diameter van 4 mm werden vervaardigd met een 3D-printer. De morphologies van de steigers werden geanalyseerd via scanning elektronen microscopie en microCT. Figuur 1A toont de foto van de geïmplanteerde steiger. MicroCT scannen onthulde dat meer dan 85% van de poriën had maten variërend van 200 tot 400 µm (figuur 1B). SEM imaging aangetoond dat het oppervlak van de steiger had een ruwe microtopog...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bot is een zeer gevacuoliseerd weefsel met een unieke capaciteit om voortdurend te genezen en remodelleren gedurende de levensduur van een individuele1. Het niveau van de vascularisatie is belangrijk voor osteogenesis en defect reparatie. Lage vascularisatie beperkt de brede klinische toepassing van weefsel-engineered bot. Bouw van een zeer gevacuoliseerd weefsel-engineered bone volgens de theorie van biomimetics is een hulpprogramma voor het repareren van grote segment bot gebreken geworden. Vers...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door het Shenzhen Peacock programma, China (nr. 110811003586331), de Shenzhen Basic Research Program (nr. JCYJ20150401150223631, nr. JCYJ20150401145529020 en nr. JCYJ20160331190714896), het Guangdong openbaar onderzoek en capaciteitsopbouw Special Program (nr. 2015A020212030), de nationale natuurlijke Science Foundation van China (nr. 81501893), de nationale Major Basic Research Program van China (2013CB945503), en de SIAT innovatie programma voor uitstekende jonge onderzoekers (Y5G010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA)SigmaP1941L/G verhouding 75:25, MW 66000-107000
Hydroxyapatiet nanodeeltjesSigma702153Gemiddelde diameter < 200 nm
Chloroquine difosfaat zoutSigmaC6628
FITC-geconjugeerd 250-kD dextranSigmaFD250S
1,4-dioxaanlingfeng, Shanghai0,45 micrometer
Stericup filtersMerck Millipore CorporationSLHV033RB
PDGF-BB CdnaSino Biological, IncMZ50801-G
Anti-PDGF-BB muis polyklonaal antilichaam BioVision, Inc5489-30T
PDGF-BB recombinant eiwit4489-50
Calcium-fosfaat transfectie oplossingPromega CorporationE1200
L-DMEMHycloneSH30021.01
DPBSHycloneSH30028.01
Penicilline-Streptomycine, VloeibaarThermo Fisher Scientific15140122
FBSThermo Fisher Scientific10099-141
Transwell Corning3422
Mannelijke BALB/c muizenGuangdong Medical Laboratory Animal Center 
natrium pentobarbital Merck1063180500
multifotonen microscopieEen zelfgemaakte oplossing in Shenzhen Institutes of Advanced Technology om twee-fotonen geëxciteerde fluorescentie (TPEF) en tweede harmonische generatie signaal (SHG) te detecteren.
isofluraanKeyuan, Shandong401750169
TRIzol reagensInvitrogen15596018
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)TakaraRR420B
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)TakaraRR036B
Hematoxyline en eosineBeyotimeC0105
ParaffineLeica RM2235
Ultracentrifuge OPtima L-100XPBeckman CoulterL-100XP
Laag-temperatuur printer Tsinghua universityEen zelfgemaakte in Tsinghua university
LightCycler 480 instrument Roche5815916001
microCTBruker1176
commerciële softwareBruker
Buprenorfine

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
  2. Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue engineering approaches for bone repair: concepts and evidence. Injury. 42 (6), 609-613 (2011).
  3. Chiarello, E., et al. allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery. Aging Clin Exp Res. 25, S101-S103 (2013).
  4. Elangovan, S., et al. The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor. Biomaterials. 35 (2), 737-747 (2014).
  5. Bouyer, M., et al. Surface delivery of tunable doses of BMP-2 from an adaptable polymeric scaffold induces volumetric bone regeneration. Biomaterials. 104, 168-181 (2016).
  6. Rezwan, K., et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
  7. Burg, K. J., Porter, S., Kellam, J. F. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials. 21 (23), 2347-2359 (2000).
  8. Xiao, Y., et al. Modifications of collagen-based biomaterials with immobilized growth factors or peptides. Methods. 84, 44-52 (2015).
  9. Chen, G., Lv, Y. Immobilization and Application of Electrospun Nanofiber Scaffold-based Growth Factor in Bone Tissue Engineering. Curr Pharm Des. 21 (15), 1967-1978 (2015).
  10. Kofron, M. D., Li, X., Laurencin, C. T. Protein- and gene-based tissue engineering in bone repair. Curr Opin Biotechnol. 15 (5), 399-405 (2004).
  11. Chen, F. M., et al. New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies. J Control Release. 149 (2), 92-110 (2011).
  12. Winn, S. R., et al. Gene therapy approaches for modulating bone regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 42 (1-2), 121-138 (2000).
  13. Chang, P. C., et al. Adenovirus Encoding Human Platelet-Derived Growth Factor-B Delivered to Alveolar Bone Defects Exhibits Safety and Biodistribution Profiles Favorable for Clinical Use. Hum Gene Ther. 20 (5), 486-496 (2009).
  14. Phipps, M. C., Xu, Y. Y., Bellis, S. L. Delivery of Platelet-Derived Growth Factor as a Chemotactic Factor for Mesenchymal Stem Cells by Bone-Mimetic Electrospun Scaffolds. Plos One. 7 (7), (2012).
  15. Gehmert, S., et al. Angiogenesis: The role of PDGF-BB on Adiopse-tissue derived Stem Cells (ASCs). Clin Hemorheol and Microcirc. 48 (1-3), 5-13 (2011).
  16. Chang, P. C., et al. PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration. Gene Ther. 17 (1), 95-104 (2010).
  17. Javed, F., et al. Significance of the platelet-derived growth factor in periodontal tissue regeneration. Arch Oral Biol. 56 (12), 1476-1484 (2011).
  18. Murali, R., et al. Biomimetic hybrid porous scaffolds immobilized with platelet derived growth factor-BB promote cellularization and vascularization in tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 104 (2), 388-396 (2016).
  19. Andrae, J., Gallini, R., Betsholtz, C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 22 (10), 1276-1312 (2008).
  20. Wosnitza, M., et al. Plasticity of human adipose stem cells to perform adipogenic and endothelial differentiation. Differentiation. 75 (1), 12-23 (2007).
  21. Hankenson, K. D., et al. Angiogenesis in bone regeneration. Injury. 42 (6), 556-561 (2011).
  22. Schmidt, C., et al. Rapid three-dimensional quantification of VEGF-induced scaffold neovascularisation by microcomputed tomography. Biomaterials. 30 (30), 5959-5968 (2009).
  23. Perng, C. K., et al. In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides. J Surg Res. 168 (1), 9-15 (2011).
  24. Sun, Y., et al. Imaging tissue engineering scaffolds using multiphoton microscopy. Microsc Res Tech. 71 (2), 140-145 (2008).
  25. Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PLoS One. 6 (1), e16348(2011).
  26. Yeo, M. G., Kim, G. H. Preparation and Characterization of 3D Composite Scaffolds Based on Rapid-Prototyped PCL/β-TCP Struts and Electrospun PCL Coated with Collagen and HA for Bone Regeneration. Chem Mater. 24 (5), 903-913 (2012).
  27. Mao, Y., et al. Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells. Int J Med Sci. 12 (5), 407-415 (2015).
  28. Li, J., et al. Investigation of angiogenesis in bioactive 3-dimensional poly (D,L-lactide-co-glycolide)/nano-hydroxyapatite scaffolds by in vivo multiphoton microscopy in murine calvarial critical bone defect. Acta Biomater. 42, 389-399 (2016).
  29. Abbasi, H., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of goat undifferentiated spermatogonia. Anim Reprod Sci. 163, 10-17 (2015).
  30. Pigossi, S. C., et al. Bacterial cellulose-hydroxyapatite composites with osteogenic growth peptide (OGP) or pentapeptide OGP on bone regeneration in critical-size calvarial defect model. J Biomed Mater Res A. , (2015).
  31. Bos, G. D., et al. The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts. J Bone Joint Surg Am. 65 (1), 89-96 (1983).
  32. Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials. J Craniofac Surg. 1 (1), 60-68 (1990).
  33. Hollanders, K., et al. Bevacizumab Revisited: Its Use in Different Mouse Models of Ocular Pathologies. Curr Eye Res. 40 (6), 611-621 (2015).
  34. Gao, L. QSIM: quantitative structured illumination microscopy image processing in ImageJ. Biomed Eng Online. 14, 4(2015).
  35. Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Opt Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  36. Lohmann, P., et al. Bone regeneration induced by a 3D architectured hydrogel in a rat critical-size calvarial defect. Biomaterials. 113, 158-169 (2016).
  37. Lv, J., et al. Enhanced angiogenesis and osteogenesis in critical bone defects by the controlled release of BMP-2 and VEGF: implantation of electron beam melting-fabricated porous Ti6Al4V scaffolds incorporating growth factor-doped fibrin glue. Biomed Mater. 10 (3), (2015).
  38. Guldberg, R. E., et al. 3D imaging of tissue integration with porous biomaterials. Biomaterials. 29 (28), 3757-3761 (2008).
  39. Boehler, R. M., et al. A PLG/HAp composite scaffold for lentivirus delivery. Biomaterials. 34 (21), 5431-5438 (2013).
  40. Heo, S. J., et al. Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process. J Biomed Mater Res A. 89 (1), 108-116 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Multiphoton MicroscopyAngiogenesis VisualizationPLGA nHAp ScaffoldCalvarial Bone DefectLentiviral Vector DeliveryIn Vivo ImagingBlood Vessel AreaFlow Cytometry AnalysisMicroCT Bone FormationGenetic Scaffold Modification

Gerelateerde artikelen