Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een In Vitro Model van het menselijk bloed-hersenbarrière

Samenvatting

Hier beschrijven we een menselijk bloed-hersenbarrière model dat het mogelijk maakt om de transmigratie van lymfocyten in het centrale zenuwstelsel in vitro te onderzoeken.

Samenvatting

Extravasatie van lymfocyten in het centrale zenuwstelsel (CZS) is essentieel voor immuun surveillance. Ziekte-gerelateerde veranderingen van lymfocyten extravasatie kan resulteren in pathofysiologische veranderingen in het centrale zenuwstelsel. Aldus onderzoek lymfocytenmigratie in het CZS is belangrijk inflammatoire CNS-ziekten te begrijpen en nieuwe therapie benaderingen te ontwikkelen. Hier presenteren we een in vitro model van het menselijk bloed-hersenbarrière lymfocyten extravasatie bestuderen. Menselijk brein microvasculaire endotheelcellen (HBMEC) worden confluent gekweekt op een poreuze polyethyleentereftalaat Transwell voegen aan het endotheel van de bloed-hersenbarrière nabootsen. Barrièrefunctie wordt gevalideerd door zonula occludens immunohistochemie transendothele elektrische weerstand (TEER) metingen en analyse van Evans blauw permeatie. Dit model maakt het mogelijk onderzoek naar de diapedesis van zeldzame lymfocyten zoals CD56 ^heldere CD16 ^{dim / -} NK-cellen. Furthermerts, de werking van andere cellen, cytokines en chemokines, ziektegerelateerde veranderingen en verschillende behandelingsregimes op het trekkende capaciteit van lymfocyten kunnen worden bestudeerd. Tenslotte kan het effect van inflammatoire stimuli evenals verschillende behandelingsregimes op de endotheliale barrière te analyseren.

Inleiding

Lymfocytenmigratie uit het bloed naar de weefsels is cruciaal voor immuun surveillance. Een reeks van specifieke moleculaire interacties zorgt plaatsspecifieke extravasatie in kleine darm, huid, lymfeknopen, het centrale zenuwstelsel (CZS) en andere weefsels ^1. Veranderingen in lymfocytenmigratie betrokken zijn bij de pathofysiologie van een aantal wijdverbreide ziekten ^2. Migratie in de immuun-geprivilegieerde CNS wordt strak gereguleerd en dus veranderingen van deze werkwijze zijn betrokken bij CZS-gerelateerde ziekten zoals encefalomyelitis ^3, neuromyelitis optica, beroerte en multiple sclerosis (MS) ^{2, 4, 5, 6, 7.} Daarom is het belangrijk om lymfocyten extravasatie bestuderen om beter te begrijpen ziekte pathofysiologie en hulpmiddelen voor een te ontwikkelen melioration ziektelast ^{8, 9, 10, 11, 12.}

Lymfocyten migreren in het CNS via verschillende routes. Extravasatie tot postcapillaire venules in de subarachnoïdale ruimte via de bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière in de choroid plexus en over de bloed-hersenbarrière zijn beschreven ^{1, 13, 14, 15.} Migratie over de bloed-hersenbarrière wordt uitgevoerd door de interactie van lymfocyten aan endotheelcellen ^14. In tegenstelling tot endotheliale cellen in de periferie, endotheliale cellen van het CNS tot expressie grote hoeveelheden tight junction moleculen, waardoor strikte beperking van het aantal cellen en eiwitten die in staat de bloed-hersenbarrièrelass = "xref"> 16. Ontsteking leidt tot loskomen van nauwe overgangen en induceert de expressie van adhesiemoleculen; dus verbeteren lymfocytenmigratie in het CZS ^{1, 17, 18.}

Extravasatie via de bloed-hersenbarrière is een meerstaps werkwijze. Lymfocyten tether de endotheelcellen en rol langs het endotheel in een proces in hoofdzaak gemedieerd door selectinen ^{1, 15.} Vervolgens interacties tussen chemokinen uitgescheiden door het endothelium en de respectieve chemokinereceptoren tot expressie gebracht op lymfocyten conformatieveranderingen van integrinen, waardoor stevige adhesie aan endotheelcellen bevorderen ^1. Tenslotte lymfocyten ofwel kruipen langs de endotheliale barrière tegen de bloedstroom voordat transmigrerende in de perivasculaire ruimte of onmiddellijk en rechtstreeks verzendende kraamigrate op de plaats van stevige adhesie ^{1, 19, 20.} Al deze stappen lymfocyt extravasatie kan worden geanalyseerd in vitro gebruik van verschillende technieken ^21. Time-lapse video microscopie wordt gebruikt om de initiële tethering en rollen ¹⁵ te bestuderen. Hechting testen leveren gedetailleerde informatie over firma arrestatie belemmeringen ²² endotheel. Transmigratie assays zoals hier getoond laten analyse van immuuncel transmigratie ^{21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.}

Met het menselijke in vitro bloed-hersenbarrière model konden we onlangs laten zien dat een hogere migrAtory aantal CD56 ^heldere CD16 ^{dim / -} NK-cellen in vergelijking met hun CD56 ^dim CD16 ⁺ tegenhangers werd gereflecteerd door een overwicht van deze NK-cel subsets in de intrathecale ruimte ^21. Zo, onze experimentele opstelling lijkt geschikt zijn om de in vivo situatie na te bootsen zijn.

Protocol

1. Cell Culture of Human Brain microvasculaire endotheelcellen (HBMEC)

1. Coating van celkweek kolven
   1. De fibronectine te bereiden, voeg 10 ml PBS om een ​​15 ml centrifugebuis. Voeg 150 ul fibronectine en meng goed.
   2. Met het onderdeksel een celkweekkolf T-25 2 ml van de fibronectine-oplossing. Incubeer de celkweek kolf gedurende ten minste 3 uur bij 37 ° C in de incubator. Fibronectine gecoate kolven worden opgeslagen gedurende 2 weken bij 37 ° C / 5% _CO2.
2. Zaaien en celcultuur van HBMEC
   1. Aspireren fibronectine oplossing uit de bodem van de celkweek kolf. Voeg 7,2 x 10 ⁴ HBMEC / cm² gesuspendeerd in 6 ml ECM-b medium (= ECM-b aangevuld met 5% foetaal runderserum, 1% penicilline / streptomycine en 1% endothele celgroei supplement). Incubeer bij 37 ° C / 5% _CO2. Controleer celgroei dagelijks met behulp van een microscoop.
   2. Verander het medium om de 3 dagen.Oogst cellen of splitsen wanneer HBMEC verwachting ongeveer 80% confluentie. HBMEC worden gebruikt tussen passage 1 en 15 tot verlies van fysiologische eigenschap belet.
3. Harvest HBMEC.
   1. Bereid Accutase oplossing door mengen Accutase (1x) met PBS in een verhouding van 1: 1. Houd Accutase oplossing bij 37 ° C in een waterbad tot verder gebruik.
   2. Transfer ECM-b medium van de celkweek kolf met 15 ml centrifugebuis. HBMEC wassen door toevoeging van 5 ml PBS aan de bodem van de celkweek kolf. Zuig PBS en herhaal de wasstap nog twee keer.
   3. Voeg 2 ml voorverwarmde oplossing Accutase. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 min. Daarna HBMEC worden opnieuw geschorst door stevig de celkweek kolf meerdere malen te tikken. Cell detachement wordt bestuurd met behulp van een microscoop
   4. De ECM-b-medium eerder opgeslagen in een 15 ml buis naar het celkweekkolf zodra HBMEC beginnen los toegevoegd. Spoel de bodem van de kolf totdat de meeste HBMEC zijngeresuspendeerd.
   5. Breng de celsuspensie aan een 15 ml centrifugebuis. Centrifugeren bij 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer cellen in 1 ml ECM-b medium. Aantal cellen en verdun de celsuspensie tot een eindconcentratie van 3 x 10 ml per ⁵ HBMEC ECM-b medium bereiken.

2. Bereiding van de Cell Culture Inserts

1. Coating van celkweek inserts
   Belangrijke opmerking: Raak de membraan van de celkweek inserts.
   1. Voeg 100 ul fibronectine-oplossing (zie 1.1.1) aan elke celkweek insert (Figuur 1A) en één putje van een 96 putjes vlakke bodemplaat (optische controle putje). Incubeer gedurende ten minste 3 uur bij 37 ° C. Na incubatie aspiraat fibronectine oplossing.
   2. Voeg 100 ul HBMEC suspensie aan de celkweek inserts en de optische controleputje. Voeg 600 ul ECM-b medium naar het onderste compartiment van de celcultuur inserts. Incubeer gedurende 3-4 dagen bij 37 ° C / 5% _CO2 totdat integriteit van de barrière (figuur 1B) wordt bereikt, controleer celgroei door microscopische evaluatie van de HBMEC in de optische controlewell. Let op: de groei van de cel langer dan vier dagen wordt niet aanbevolen.
   3. Optioneel: bootsen ontstekingen Zuig het medium van het onderste compartiment en vervang deze ECM-b medium aangevuld met 500 U / ml IFN-γ / TNF-α 24 uur voor de migratieassay.

3. Quality Control met Evans Blue op de Dag van de transmigratie Assay

1. Bereiding van Evans Blue oplossing
   1. PBS / B27-oplossing mengsel 10 mL PBS bereid met 200 ul B27 supplement met een 15 ml centrifugebuis. Evans Blue verdunde voorraadoplossing (20 mg / ml PBS) 1: 1000 met PBS / B27.
2. Evans blue permeabiliteitstest
   1. Zuig het medium uit het onderste compartiment gevolgd door het bovenste compartimentéén celkweek insert met een confluente monolaag HBMEC. Voeg 100 ul Evans Blue oplossing voor de celkweek insert.
   2. Voeg 600 ul PBS / B27 naar het onderste compartiment en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C / 5% _CO2. Verwijder voorzichtig de celkweek insert behulp van een tang.
3. Evans blauw meting
   1. Verwijder PBS / B27 uit het onderste compartiment en breng 100 ui elk van twee putjes van een zwarte polystyreen met 96 putjes met vlakke bodemplaat. Inzetplaat in een Tecan Infinite M200 Pro plaatlezer en bepaalt een optimale Z-positie.
   2. Maat excitatie Evans Blue gebruik respectieve instellingen (bijvoorbeeld: excitatie: 620 nm, emissie: 680 nm, excitatiebandbreedte: 9 nm, emissie bandbreedte van 20 nm, 175x vergroting, 25 flitsen, integratietijd: 20 ps).
   3. Bepalen HBMEC barrièrefunctie vergelijk verzamelde gegevens met een standaardcurve afbeelding van Evans Blue permeatie door HBMEC op verschillende tijdstippen na zaading cellen (Figuur 1B, rechts).

4. Migratie Assay

1. Bereiding van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC).
   1. Voeg 10 ml RPMI in een 15 ml centrifugebuis en voeg 200 ul B27 supplement. PBMC tellen en centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 minuten. Resuspendeer PBMC tot een eindconcentratie van 5 x 10 ⁶ cellen / ml RPMI / B27.
2. Set-up van de migratieassay
   1. Aspireren medium uit het onderste compartiment gevolgd door het bovenste compartiment van celkweek inserts samenvloeiende monolagen HBMEC (Figuur 1A). Per donor voeg 100 ul PBMC suspensie elk voor celkweek inserts alsook op één putje van een plaat met 24 putjes per (in vitro controle).
   2. Voeg 600 pl RPMI / B27 naar het onderste compartiment van de celkweek inserts en 500 pi aan de PBMC van de in vitro controle en incubeer 6 uur bij 37 ° C / 5% _CO2.
3. Oogsten van gemigreerde PBMC
   1. Haal de celkweek insert met behulp van een tang en voorzichtig de bodem met 400 pi PBS te spoelen zonder het aanraken van het membraan. Gooi de celkweek insert.
   2. Voeg 20 ul stroom count FluoroSpheres (ongeveer 1000 kralen / ul) aan het onderste compartiment van de celkweek te voegen en om de in vitro controle en meng goed. Breng 1 ml PBMC verkregen suspensie stroomcytometrie buizen.

5. Flowcytometrie

1. monstervoorbereiding
   1. Centrifugeer PBMC bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   2. Bereid antilichaamoplossing door toevoeging fluorochroom geconjugeerde antilichamen aan 100 pl flowcytometrie buffer (PBS / 1% BSA / 2 mM EDTA) per monster. Voor de onder 1 pi CD4-FITC gepresenteerde resultaten, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 ul CD56-PC7, 1 pl CD8-A700 en 1 ul CD16-A750 werden gebruikt per monster.
   3. Re-schorten PBMC in 100 pi van de antilichaamoplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
   4. Voeg 250 ul flowcytometrie buffer en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten.
2. sample overname
   1. Resuspendeer PBMC in de vereiste hoeveelheid (afhankelijk van de gebruikte flowcytometer) van flowcytometrie buffer.
   2. Verwerven gekleurd PBMC met een flow cytometer met een actieve detector van 525 tot 700 nm golflengte stroming count FluoroSpheres detecteren (excitatie 488 nm, emissie 525-700 nm).
      (De volgende stappen zijn een voorbeeld wanneer een Gallios flowcytometer bediend Kaluza G software wordt gebruikt. (1) Start de computer (2) Wanneer het besturingssysteem volledig is geladen, start de flowcytometer door op de "cytometer op" knop . (3) Laad de respectievelijke overname protocol door op "open protocol" te drukken. (4) Kies de gewenste protocol en selecteer "open". (5) Dubbele het protocol voor elk monster door het klikken met de rechtermuisknop op de protocol zichtbaar in de virtuele carrousel en een links-klik op het veld "duplicate". (6) Label elke monster in het monster lijst. (7) Breng de monsters op de aangegeven plaatsen van de carrousel en start de acquisitie.)
3. monsteranalyse
   1. Open resulterende flowcytometrie gegevens met behulp van de betreffende software. Bepaal aantal subpopulaties van belang voor transmigrated PBMC en cellen uit in vitro controleputjes en stromen telling FluoroSpheres met de respectievelijke analysesoftware.
      (Een voorbeeld van de gating strategie wordt gegeven in de resultaten gedeelte (Figuur 1 C: Aan de transmigratie van NK-cel subsets analyseren eerst selecteren lymfocyten in een zijwaartse verstrooiing kanaal (SSC) versus voorwaartse verstrooiing kanaal (FSC) diagram Lymfocyten zijn. vervolgens verschijnt een CD3 versus CD56 plot en CD56 ⁺ CD3 ^-. NK cellen gekozen Ter onderscheiding van NK-cel subsets worden NK cellen weergegeveneen CD56 versus CD16 plot en CD56 ^heldere CD16 ^{dim / -} evenals CD56 ^dim CD16 ⁺ NK-cellen zijn geselecteerd. Daarnaast zijn stroom telling FluoroSpheres gekozen uit een FSC-SSC versus grafiek en vervolgens weergegeven in een grafiek van een kanaal met een emissie van 525 tot 700 nm versus tijd hun aantal te bepalen.)
   2. Het totale aantal cellen van elk monster te berekenen, normaliseren het gedetecteerde aantal cellen met behulp stroming count FluoroSpheres:
      
   3. Bepalen percentage gemigreerde cellen als verhouding tussen het totale gemigreerde cellen en totale cellen in het in vitro controle.

Resultaten

Representatieve resultaten tonen transmigratie van NK-cellen en T-cel subsets met het menselijk bloed-hersenbarrière model (Figuur 1A) getoond. De integriteit van de monolaag HBMEC werd bevestigd door kleuring van de nauwe overgang molecuul ZO-1, transendothele elektrische weerstand (TEER) metingen en Evans Blue permeatie (Figuur 1B). Na 3-4 dagen kweek HBMEC sprak de nauwe overgang molecuul ZO-1 (Figuur 1B, links). Bovendien HBMEC gegro...

Discussie

Hier presenteren we een techniek om de transmigratie van lymfocyten over het menselijk bloed-hersenbarrière te onderzoeken. In vitro analyse van lymfocyt migratie naar het CZS is belangrijk basisprocessen van lymfocyten extravasatie mogelijke ziektegerelateerde veranderingen en nieuwe therapeutische benaderingen bestuderen.

Verschillende modificaties van de bloed-hersenbarrière model mogelijk. Bijvoorbeeld kunnen cellen van het bovenste compartiment worden geanalyseerd om de samenst...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
PBS	Gibco	14190-094	zonder CaCl2 of MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL	Sigma	F1141-5MG	uit runderplasma
T-25 cellcultuurkolf	Greiner BioOne	690160
HBMEC	ScienCell	1000
	Pelobiotech	PB-H-6023
Accutase	Sigma	A6964-100ML
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
Penicilline/Streptomycine	ScienCell	1001-b
Endotheliaal cel groei supplement	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	doorzichtig, 6,5 mm diameter, 3,0 µm poriegrootte
96-wells platte bodem plaat	Corning	3596
Evans blue	Sigma	E2129-10G	voorraadoplossing: 1 g/50 mL PBS
B27	Gibco	17504-044	50x geconcentreerd
Infinite M200Pro	Tecan
96-wells zwarte platte bodem plaat	Greiner BioOne	675086
48-wells plaat	Corning	3526
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Flow Count Fluorospheres	Beckman Coulter	7547053
Na-EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	A2153
Gallios 10-kleur flow cytometer	Beckman Coulter
Kaluza 1.5a	Beckman Coulter
TNF-α	Peprotech	300-01A
IFN-γ	Peprotech	300-02
CD3-PerCP/Cy5.5	Biolegend	300430	klon UCHT1
CD56-PC7	Beckman Coulter	A21692	klon N901
CD16-A750	Beckman Coulter	A66330	klon 3G8
CD4-FITC	Biolegend	300506	klon RPA-T4
CD8-A700	Beckman Coulter	A66332	klon B9.11