Langdurige incubatie van Acute neuronaal weefsel voor elektrofysiologie en calcium-imaging

Samenvatting

Na verwijdering uit het lichaam, is neuronaal weefsel sterk beïnvloed door omgevingsfactoren, waardoor eventuele degradatie van het weefsel na 6-8 uur. Met behulp van een unieke incubatie werkwijze, die nauw bewaakt en regelt de extracellulaire omgeving van het weefsel, kan levensvatbaarheid van het weefsel aanzienlijk worden verlengd> 24 uur.

Samenvatting

Acute voorbereidingen zenuwweefsel, de hersenen plakjes en netvlies wholemount, kan meestal alleen worden gehandhaafd voor 6-8 uur na dissectie. Dit beperkt de experimentele tijd en verhoogt het aantal dieren die worden gebruikt per studie. Deze beperking specifiek effect protocollen zoals calcium imaging dat langdurige voorincubatie met bad toegepaste kleurstoffen vereisen. Exponentiële bacteriegroei binnen 3-4 uur na het snijden stevig gecorreleerd met een afname van de gezondheid weefsel. Deze studie beschrijft een werkwijze voor het beperken van de verspreiding van bacteriën in acute preparaten levensvatbare neuronale weefsels gedurende lange perioden (> 24 uur) zonder de noodzaak voor antibiotica, steriele procedures of weefselcultuur medium dat groeifactoren handhaven. Op door het extracellulaire fluïdum door UV-bestraling en het houden van het weefsel in een aangepaste houdkamer bij 15-16 ° C, het weefsel vertoont geen verschil in elektrofysiologische eigenschappen of calcium signaling door middel van intracellulaire calcium kleurstoffen bij> 24 uur postdissection. Deze methoden zullen niet alleen experimentele tijd te verlengen voor de gebruikers van acute neuronaal weefsel, maar het aantal benodigde dieren experimentele doelen beslag neemt, en een gouden standaard voor acute neuronaal weefsel incubatie stellen.

Inleiding

Elektrofysiologie en functionele beeldvorming (calcium, voltage gevoelige kleurstoffen) zijn twee van de meest gebruikte experimentele technieken in de neurowetenschappen. Brain slice voorbereidingen en netvlies wholemount, die hier zal worden behandeld, een middel van het onderzoeken van elektrofysiologische eigenschappen en synaptische connectiviteit zonder besmetting door verdoving of spierverslappers. Brain plakjes en retinale wholemount behouden hun structurele integriteit, in tegenstelling tot culturen of celhomogenaten, waardoor de studie van specifieke circuits en de hersenen netwerken ^1. Opnames van geïsoleerde weefsel voordelen ten opzichte van in vivo opnames bewegingen in verband met de hartslag en de ademhaling worden geëlimineerd. Bovendien maakt directe visualisatie specifieke klassen van cellen worden gericht en lokale behandeling met farmacologische gereedschappen ^{2, 3.}

Patch-clamp opnamen en calcium dye-loading in retinale wholemount wordt bemoeilijkt door het bestaan ​​van de Inner beperken Membrane (ILM), die de retinale ganglioncellen (RGC) laag bedekt en voorkomt dat directe toegang tot de cellen. Typisch wordt dit membraan weggeschraapt met een glazen pipet om rechtstreekse toepassing van een patch pipet en de vorming van een gigaohm zegel op een enkele cel toe. Daarnaast hebben bad toegepast calcium kleurstoffen niet ILM overschrijden en moeten ofwel geïnjecteerd onder dit membraan ^4, retrograad transport na injectie in de oogzenuw ⁵ geëlektroporeerde of door het weefsel ^6. Bovendien, als het gebruik van een knaagdier model van retinitis pigmentosa, de rd / rd muis, het ILM is dikker en ondoordringbaar. Hier maken we gebruik van een techniek om de ILM te verwijderen met enzymatische afbraak ^7, zowel alomtegenwoordige calcium dye-loading, en directe toegang tot retinale ganglion cellen voor patch-clamp recordi toestaanngs ^8.

Succesvolle opname van ofwel hersencoupes of retinale wholemount afhankelijk dissectie en incubatie van levensvatbare neuronaal weefsel. Kenmerkend wordt weefsel geëxtraheerd op de ochtend van het experiment en geïncubeerd in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) totdat het wordt gebruikt voor opnamen. Gewoonlijk weefsel blijft nog gedurende 6-8 uur, met significante afbraak na deze tijdskader. Zowel hersencoupes en wholemount retina preparaten meestal bij meer dan weefsel kan worden opgenomen binnen deze korte periode. Daarom wordt vaak weefsel die aan het einde van de dag en de dissectie opnieuw voltooid op opeenvolgende dagen. Dit betekent dat een ander dier wordt benut en ~ 2 uur over de instellingen en dissectie / kleuring herhaald. Het volgende protocol beschrijft een werkwijze voor het verlengen van de levensduur van neuronaal weefsel voor meer dan 24 uur, wat betekent dat minder dieren worden gebruikt, en meer experimentele tijd beschikbaar. Levensvatbaarheid van het weefsel wzoals beoordeeld door middel van het opnemen van elektrofysiologische eigenschappen en calcium dynamiek, en deze eigenschappen waren niet te onderscheiden tussen <4 uur en> 24 uur postdissection.

Deze resultaten geven aan dat niet alleen eencellige eigenschappen intact en functioneel na verlengde incubatie, maar netwerkactiviteit, zoals beoordeeld door calcium-imaging en elektrofysiologische opnames, onveranderd> 24 uur postdissection. Bovendien tonen wij dat calcium kleurstoffen in cellen blijven gedurende langere tijd zonder enige nadelige effecten. De toepassing van dit protocol toont aan dat de functionele activiteit van neuronen in acute neuronaal weefsel kan worden gehandhaafd gedurende lange perioden, zodra de externe omgeving sterk gereguleerd. Zoals levensvatbaarheid van het weefsel varieert sterk tussen laboratoria door incubatie verschillende protocollen, deze methode wordt een gouden standaard voor het ideale parameters die moeten worden toegepast op de variabiliteit te verminderen in de gezondheid van acute neuRonal weefsel.

Protocol

De onderstaande protocol beschrijft de bereiding van C57BL / 6 en C3H / He (retinally ontaarden) muis neuronaal weefsel, maar soortgelijke technieken kunnen worden toegepast op andere soorten. Alle dieren waren gezond en behandeld met standaard condities van temperatuur, vochtigheid, 12 uur licht / donker-cyclus, vrije toegang tot voedsel en water, en zonder enige bedoeling van stress stimuli. Alle experimenten werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met Western Sydney University Dierverzorging en ethische commissie en op basis van het gebruik van dieren en richtlijnen zorg (Animal Research Authority # A9452, # A10396 en # A8967).

1. Brain Slice Voorbereiding

1. Verdoven het dier door inhalatie van isofluraan (5%) en onthoofden met een knaagdier guillotine. Verwijder de hersenen snel, zoals eerder beschreven ⁹ en plaats deze in ijskoude fysiologische oplossing (aCSF) bevattende (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCI, 1 _MgCl2, 1,25 NaH _{2PO 4,} 2 _CaCl2, 25_NaHCO3, 25 dextrose, en verzadigd met carbogeen _(95% O2 / 5% CO ₂ mengsel, 310 mOsm, pH 7,4).
2. Snijd de hersenen plakjes, in de regio van belang, 300 micrometer dik met een trillende microtoom.
3. Transfer plakken naar een custom-built incubatiesysteem die nauw bewaakt en controleert pH-waarden (pH 7,2-7,4), carbogen flow, en de temperatuur zoals eerder beschreven ^{10, 11.}
4. Stel aanvankelijke kamertemperatuur tot 35 ° C gedurende 15-30 min en vervolgens langzaam verlagen tot 15-16 ° C zoals getoond in figuur 1C. incubeer daarna segmenten in het incubatiesysteem totdat het nodig is, hetzij voor elektrofysiologie en beeldvorming.
   LET OP: Als plakjes worden om te worden gebruikt voor het calcium-imaging, volgt u onderstaande stappen voor het koelen van het weefsel onder de RT.

2. retinale Wholemount Voorbereiding en Inner grensmembraan Removal

1. Bereid retinale wholemounts onder zowel normalelaboratorium lichtomstandigheden of donker rood / infrarood licht.
2. Euthanaseren van dieren door cervicale dislocatie en meteen ophelderen ogen. Maak een kleine snede langs de ora serrata, en plaats in een van beide Ames media, of aCSF bevatten (mm): 125 NaCl, 25 _NaHCO3, 3 KCl, 2 _CaCl2, 1 _MgCl2, 10 glucose, 0,5 L-glutamine, en verzadigen met carbogeen _(95% O2 / 5% CO ₂ mengsel; ~ 300 mOsm; pH 7,4) bij kamertemperatuur.
3. Onmiddellijk verwijderen van het hoornvlies, de lens en het glasvocht door te snijden langs de ora serrata met een kleine schaar en het verwijderen van de lens en het glasvocht met een pincet. Plaats weefsel in het incubatiesysteem bij KT.
   OPMERKING: Retinale weefsel kan worden gehandhaafd in de oogschelp na langzame temperatuurverlaging tot 15-16 ° C, gedurende> 24 uur bij het incubatiesysteem totdat het nodig is.
4. Om het ILM te verwijderen, de overdracht van de eye-cup met het netvlies van een kleine glazen pot met 30 U / ml papaïne, 1 mM L-cystine, 0,5 mM EDTA en 0,005% DNase in Earl's-Balanced Salt Solution (BSS) bij 37 ° C gedurende 20 min. Toepassen _95% O2 / 5% CO ₂ aan de oplossing door het deksel maar niet bubble. Bij gebruik van weefsel van jonge dieren (<6 weken), vul de oplossing van halve sterkte.
   1. Stop enzymatische digestie, door het plaatsen van het weefsel in een ovomucoïde (10 mg / ml) en BSA (10 mg / ml) gedurende 10 min in Earl's BSS. Wassen weefsel grondig met aCSF vóór de overdracht naar het incubatiesysteem en vermindering temperatuur 15-16 ° C.
5. Handhaving van retinale weefsel in de eye-cup totdat het nodig is. Voor overdracht naar de microscoop, isoleren het netvlies van de oogschelp en in 4 stukken gesneden met een scheermesje. Als de gehele retina wordt vereist, maakt vier kleine sneden in de periferie van het netvlies om deze te plat.
   LET OP: Voor grafische experimenten, lading met calcium-kleurstoffen vóór de overdracht naar de incubatie-systeem, zie hieronder.

3. Handhaving van weefsel in de Incubator

1. Plaats weefsel in de belangrijkste kamer die probes voor pH- en temperatuurmetingen (Figuur 1A, B).
2. Circuleren aCSF via een tweede kamer (UVC kamer, gebouwd zoals eerder beschreven ¹²⁾ gescheiden van de hoofdkamer en blootgesteld aan 1,1 W UVC-licht (254 nm, 5W / 2P sterilisator UV lamp) om bacteriën zwevend in de oplossing uitstralen (fig 1A). Controle UVC licht timing via een programmeerbare timer met behulp van een willekeurige functie die ON draait soms variërend tussen 15 en 26 min elke 15-30 min om oververhitting van de aCSF voorkomen.
3. Stel het debiet in het UVC kamer naar 12 ml / min zoals eerder beschreven ^12. Bedek de UVC kamer met aluminiumfolie om UVC verlichting buiten de kamer, die neuronaal weefsel kunnen beschadigen te voorkomen.
   NB: Voor donker aangepaste netvlies weefsel, breng dan een op maat gemaakt deksel op de belangrijkste kamer aan het licht uit te sluiten.
4. Gebruik een peristaltische pomp Circulate de oplossing (aCSF) door de twee kamers en een Peltier thermo koude platenkoeler ofwel koelen of verhitten hoofdkamer de gewenste temperaturen in het traject van 0-50 ° C. Voor een optimale weefsel incubatie, gebruik 15-16 ° C op levensvatbaarheid op lange termijn.

4. Calcium Dye Loading

1. Selecteer calcium kleurstoffen op basis van de voorkeur van de individuele onderzoeker. Hier gebruiken we Fura-02:00, Fluo-08:00 of Fluo-04:00. Echter kan deze methode worden toegepast op andere kleurstoffen ook: los calcium kleurstoffen in DMSO om een 1 mM oplossing en 1% blokcopolymeren (bijvoorbeeld pluronzuur-127) tot een eindvolume van 50 ul en ultrasone trillingen gedurende 10 min.
2. oplossing aCSF voegen tot een eindconcentratie van 10 uM, 0,01% blokcopolymeren voor hersencoupes en 20 uM (retina), 0,02% blokcopolymeren het netvlies. In retina (papaïne behandelde) en hersenschijfjes van jonge dieren, belasting op het bad gedurende 45 minuten bij 37 ° C (Fura-2 AM) of bij kamertemperatuur (Fluo-04:00; Fluo-08:00).
   1. Voor volwassen dieren (> 12 weken) pipetteer de kleurstoffen (50 ui) direct op de hersencoupes en houdt het 75 min betere penetratie van de kleurstof toe in de diepe lagen.
   2. Om voldoende zuurstofvoorziening van de ondergedompelde plak tijdens kleurstof incubatie te verzekeren, bereiden een glas laadruimte met een gesloten deksel (ronde pot met een diameter van 2,5 cm, 3,5 cm hoog) met calcium kleurstoffen verdund in 2,5 ml aCSF. Zuurstof continu met _95% O2 / 5% _CO2. Doe niet bubble.
3. Na dye laden, wassen van het weefsel met aCSF en transfer naar het incubatiesysteem langzaam de temperatuur verlagen tot 15-16 ° C tot experimenteel gebruik.

5. Elektrofysiologische Recordings en Imaging

1. Plaats weefsel in een ondergedompelde opname kamer onder een microscoop, en perfuseren zuurstofrijk aCSF met een stroomsnelheid van 4-5 ml / min of bij kamertemperatuur (~ 22 ° C) of fysiologische temperatuur (~ 35 ° C). Hold het weefsel op zijn plaats met een custom made '' harp '', gemaakt van nylon of gouddraad uitgerekt en gelijmd in een U-vormig stuk goud of platina draad.
2. Voor elektrofysiologie:
   1. Bereid opname pipetten van 1,5 mm (1,19 mm ID) borosilicaatglas met behulp van een micropipet trekker tot een uiteindelijke weerstand van 5-6 MQ bereiken.
   2. Vul de pipet met 3-4 pi van interne oplossing zoals eerder beschreven ¹³ en visualiseren cellen onder infrarood Differentieel Interferentie Contrast (DIC-IR) met een CCD camera. De intracellulaire oplossing moet zorgvuldig worden aangepast aan elk experiment experimentele resultaten te bereiken.
   3. Positie pipet, met behoud positieve druk aangebracht via een afzuigopening op de pipet houder, op het membraan van een cel met een micromanipulator. Aangezien de ILM heeft van het netvlies is verwijderd, is geen voorafgaande membraan afschrapen vereist. Zodra de pipet op de cel, zachtjes negatiefdruk om de pipet een gigaohm afdichting te bereiken. scheuren dan de celmembraan met een korte hoeveelheid negatieve druk.
   4. Helen cel stroom- of spanning-clamp middels standaardtechnieken zoals passend.
3. Calcium-beeldvorming:
   1. Voor ratiometrische beeldvorming van Fura-2, maken gebruik van een ultra-high speed golflengte switcher om excitatie golflengten van 340 nm en 380 nm te bieden. Pass uitgestraalde licht van afzonderlijke cellen door middel van een emissie filter van 510 ± 20 nm, en vast te leggen met een hoge gevoeligheid, high-speed digitale camera.
   2. Voor een enkele golflengte excitatie van Fluo-4, filter excitatie licht door een 460-490 nm band pass filter en het uitgezonden licht door een 515-550 nm banddoorlaatfilter. Voor de snelste en meest gevoelige opname gebruik maken van een high speed digitale camera zodanig. Acquire afbeeldingen.
   3. Meet veranderingen in fluorescentie als functie van de tijd, hetzij op een enkele golflengte (Fluo-4) of met de golflengte verhoudingWerkwijze (Fura-2), zoals eerder beschreven ^{8, 14.}

Resultaten

Strakke regulatie van de bacteriële verontreiniging en de temperatuur van de aCSF tijdens incubatie essentieel om neuronaal weefsel haalbaarheid ervan. Dit kan worden geoptimaliseerd door bestraling met UVC-licht en de temperatuur van de aCSF op 15-16 ° C (figuur 1). Bovendien is de aCSF parameters stempel (APS Figuur 1C) verschaft de experimentator een verslag van de omgevingsomstandigheden (pH en temp.) Biedt dus een gouden standaard voor parameters al...

Discussie

Dit artikel beschrijft een incubatie methode om de levensvatbaarheid van zenuwweefsel acute verlengen beeldvorming en elektrofysiologische experimenten, waarbij het aantal dieren nodig experimentele doelen voltooien verminderen. Twee belangrijke processen regelen de verslechtering van neuronaal weefsel in de tijd: i) verhoogde bacteriën niveaus, en de daarmee gepaard gaande toename van bacterieel endotoxine vrijgegeven, en ii) excitotoxiciteit die de traumatische snijden procedure ¹⁰ volgt. Als a...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Sodium Chloride	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333
N-Methyl-D-glucamine	Sigma Aldrich	M2004
D-glucose	Sigma Aldrich	G5767
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S2554
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M9272
Calcium chloride	Sigma Aldrich	223506
Papain Dissociation System	Worthington	LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma Aldrich	276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance*	Life technologies	P-6867	20% solution in DMSO
Fura-2 AM	Anaspec	84017
Fluo-4 AM	Life Technologies	F23917
Fluo-8 AM	Abcam	Ab142773
Vibrating blade microtome	Leica Biosystem	VT1200 S	Uitgerust met Leica’s Vibrocheck™ meetapparaat
Antivibration table	Kinetic Systems Vibraplane	Vibraplane 9100/9200
Fixed Stage Upright Microscope	Olympus	BX51WI
Microscope Objective	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X
Microscope Objective	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
CCD Camera	Andor	Ixon +
High speed wavelength switcher	Sutter instrument	Lambda DG-4
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B
Data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® System
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instrument Co	BF150-86-10
Microelectrode puller	Sutter Instrument Co	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamber	Warner Instruments	RC-40LP	Low Profile Open Bath Chambers
Software	Molecular Devices	pClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler	TE Technology	CP-121
Temperature Controller	TE Technology	TC-36-25 RS232