Na verwijdering uit het lichaam, is neuronaal weefsel sterk beïnvloed door omgevingsfactoren, waardoor eventuele degradatie van het weefsel na 6-8 uur. Met behulp van een unieke incubatie werkwijze, die nauw bewaakt en regelt de extracellulaire omgeving van het weefsel, kan levensvatbaarheid van het weefsel aanzienlijk worden verlengd> 24 uur.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Langdurige incubatie van Acute neuronaal weefsel voor elektrofysiologie en calcium-imaging
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Acute voorbereidingen zenuwweefsel, de hersenen plakjes en netvlies wholemount, kan meestal alleen worden gehandhaafd voor 6-8 uur na dissectie. Dit beperkt de experimentele tijd en verhoogt het aantal dieren die worden gebruikt per studie. Deze beperking specifiek effect protocollen zoals calcium imaging dat langdurige voorincubatie met bad toegepaste kleurstoffen vereisen. Exponentiële bacteriegroei binnen 3-4 uur na het snijden stevig gecorreleerd met een afname van de gezondheid weefsel. Deze studie beschrijft een werkwijze voor het beperken van de verspreiding van bacteriën in acute preparaten levensvatbare neuronale weefsels gedurende lange perioden (> 24 uur) zonder de noodzaak voor antibiotica, steriele procedures of weefselcultuur medium dat groeifactoren handhaven. Op door het extracellulaire fluïdum door UV-bestraling en het houden van het weefsel in een aangepaste houdkamer bij 15-16 ° C, het weefsel vertoont geen verschil in elektrofysiologische eigenschappen of calcium signaling door middel van intracellulaire calcium kleurstoffen bij> 24 uur postdissection. Deze methoden zullen niet alleen experimentele tijd te verlengen voor de gebruikers van acute neuronaal weefsel, maar het aantal benodigde dieren experimentele doelen beslag neemt, en een gouden standaard voor acute neuronaal weefsel incubatie stellen.
Inleiding
Elektrofysiologie en functionele beeldvorming (calcium, voltage gevoelige kleurstoffen) zijn twee van de meest gebruikte experimentele technieken in de neurowetenschappen. Brain slice voorbereidingen en netvlies wholemount, die hier zal worden behandeld, een middel van het onderzoeken van elektrofysiologische eigenschappen en synaptische connectiviteit zonder besmetting door verdoving of spierverslappers. Brain plakjes en retinale wholemount behouden hun structurele integriteit, in tegenstelling tot culturen of celhomogenaten, waardoor de studie van specifieke circuits en de hersenen netwerken 1. Opnames van geïsoleerde weefsel voordelen ten o....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De onderstaande protocol beschrijft de bereiding van C57BL / 6 en C3H / He (retinally ontaarden) muis neuronaal weefsel, maar soortgelijke technieken kunnen worden toegepast op andere soorten. Alle dieren waren gezond en behandeld met standaard condities van temperatuur, vochtigheid, 12 uur licht / donker-cyclus, vrije toegang tot voedsel en water, en zonder enige bedoeling van stress stimuli. Alle experimenten werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met Western Sydney University Dierverzorging en ethische commissie en op basis van het gebruik van dieren en richtlijnen zorg (Animal Research Authority # A9452, # A10396 en # A8967).
1. Brain Slice Voo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Strakke regulatie van de bacteriële verontreiniging en de temperatuur van de aCSF tijdens incubatie essentieel om neuronaal weefsel haalbaarheid ervan. Dit kan worden geoptimaliseerd door bestraling met UVC-licht en de temperatuur van de aCSF op 15-16 ° C (figuur 1). Bovendien is de aCSF parameters stempel (APS Figuur 1C) verschaft de experimentator een verslag van de omgevingsomstandigheden (pH en temp.) Biedt dus een gouden standaard voor parameters al.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit artikel beschrijft een incubatie methode om de levensvatbaarheid van zenuwweefsel acute verlengen beeldvorming en elektrofysiologische experimenten, waarbij het aantal dieren nodig experimentele doelen voltooien verminderen. Twee belangrijke processen regelen de verslechtering van neuronaal weefsel in de tijd: i) verhoogde bacteriën niveaus, en de daarmee gepaard gaande toename van bacterieel endotoxine vrijgegeven, en ii) excitotoxiciteit die de traumatische snijden procedure 10 volgt. Als a.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Yossi Buskila en Paul Breen verklaren dat ze mede-eigenaren zijn van PAYO Scientific Pty Ltd, een bedrijf dat gespecialiseerd is in het bouwen van incubatiesystemen voor acuut zenuwweefsel. Alle andere auteurs rapporteren geen financiële belangen of mogelijke belangenconflicten met betrekking tot de huidige studie.
Dankbetuigingen
We danken Colin Symons en James Wright voor technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door een seed funding grant (WSU) aan Y.B. en het innovatiebureau van Western Sydney University. M.C. wordt ondersteund door een ARC fellowship (DECRA).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich VETEC | V800372 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| N-Methyl-D-glucamine | Sigma Aldrich | M2004 | |
| D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 223506 | |
| Papain Dissociation System | Worthington | LK003150 | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Pluronic F-127 Low UV absorbance* | Life technologies | P-6867 | 20% solution in DMSO |
| Fura-2 AM | Anaspec | 84017 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F23917 | |
| Fluo-8 AM | Abcam | Ab142773 | |
| Vibrating blade microtome | Leica Biosystem | VT1200 S | Uitgerust met Leica’s Vibrocheck™ meetapparaat |
| Antivibration table | Kinetic Systems Vibraplane | Vibraplane 9100/9200 | |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Microscope Objective | Olympus | XLUMPlanFLN 20x/1.00w | 20X |
| Microscope Objective | Olympus | LUMPlanFLN 60x/1.00w | 60X |
| CCD Camera | Andor | Ixon + | |
| High speed wavelength switcher | Sutter instrument | Lambda DG-4 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | |
| Data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | Axon Digidata® System |
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instrument Co | BF150-86-10 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Recording/perfusion chamber | Warner Instruments | RC-40LP | Low Profile Open Bath Chambers |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.2 | |
| Andor iQ Live Cell Imaging Software | Andor | Andor iQ3 | |
| Braincubator | Payo Scientific | BR26021976 | www.braincubator.com.au |
| Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler | TE Technology | CP-121 | |
| Temperature Controller | TE Technology | TC-36-25 RS232 |
Referenties
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).
- Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
- Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
