Hier presenteren we een protocol bij een semi-high throughput celmigratie analyse uit te voeren op een 96-well celcultuur plaat. Dit protocol is een snelle, eenvoudige en economische methode om consistente kras wonden op een cel monolaag te creëren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een inrichting voor het uitvoeren van celmigratie / wondgenezing in een 96-putjesplaat
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De celmigratie / verwonden assay is een veelgebruikte werkwijze om celmigratie en andere biologische processen zoals angiogenese en tumormetastase bestuderen. In deze assay worden cellen gekweekt tot een confluente monolaag te vormen en een mechanische wond door krassen met een inrichting. Vervolgens de migratie snelheid van de cellen naar het blootgelegde gebied kan worden gevolgd door beeldvorming. De 8-kanaals mechanische wounder is ontworpen om de meeste van de problemen bij de celmigratie assay pakken. Ten eerste kunnen onze wounder gemakkelijk worden gesteriliseerd door autoclaveren of gewone ontsmettingsmiddelen. In de tweede plaats, laat de individuele verstelbare pinnen zelfs contact op met de celkweek plaat zodat scherpe en reproduceerbare wonden kunnen worden gemaakt. Ten derde, de geleidingsstaven aan beide zijden van de wounder consistente verwonding positie in elk putje. Het gebruik van wegwerp plastic pipet tips voor het verwonden kunnen verder betere hantering van de wounder en cross-contaminat minimaliserenion. Concluderend kan onze mobiele wounder onderzoekers met gebruiksvriendelijke en reproduceerbare inrichting voor het uitvoeren van de celmigratie assay met behulp van de standaard 96-well kweekplaat.
Inleiding
Celmigratie speelt een belangrijke rol in de cellulaire processen zoals embryogenese, neurogenese, angiogenese, wondheling, mucosale reparatie, epitheliale-mesenchymale-overgangen in normale ontwikkeling en ziekte situatie 1. Het is een ingewikkeld proces waarbij de coördinatie van een groot aantal inter- en intra-cellulaire evenementen, waaronder signalering molecuul interacties, cel polarisatie, cytoskelet reorganisatie matrix remodeling, membraan uitsteeksel en dynamische cel-cel adhesie modulatie 2 gaat. Door het bestuderen van celmigratie, kan de ontdekking en validatie van chemicaliën of biomoleculen leidt tot cel beweging en de bijbehorende biochemische pathways worden bepaald. Deze fundamentele werkwijze kan met voordeel worden gebruikt als indicatie voor diverse toepassingen, zoals behandeling van ziekten en drug targeting.
Het verwonden assay is een van de celmigratie assays 3. Hier wordt eenindividueel monster van cellen wordt deels mechanisch verwijderd worden om een ontbloot waar cellen migreren naar het gebied te dekken te produceren. Het percentage herstel op een bepaald tijdstip wordt gecontroleerd. Bij het hanteren groot aantal monsters, kan kwesties zoals de experimentele kosten en kruisbesmetting binnen monsters problematisch zijn. Hoewel vele commerciële instrumenten en testen beschikbaar voor het bestuderen celmigratie 4, 5, 6, velen vereist kostbare en geavanceerde apparatuur en verbeteringen zijn nog steeds nodig. Om deze redenen is een 8-kanaals mechanische cel wounder (figuur 1) ontwikkeld.
De 8-kanaals mechanische cel wounder heeft een aantal unieke kenmerken opgenomen in het oplossen van de bovengenoemde problemen. Het biedt de flexibiliteit om cel migratie uit te voeren / verwonden assays in de 96-well cultuur plaat formaat. De verstelbare guIding bar ontwerp zorgt ervoor dat de kras gebied is in de centrale positie van elk putje. Ook kan de hoogte van de geleidingsstaven worden aangepast zodat de wounder geldt voor verschillende merken van kweekplaten. Tot slot, de verstelbare verwonding pin ontwerp maakt een gelijkmatige contact van de pipetpunten met de cultuur plaat oppervlak om gelijktijdige en reproduceerbare verwonden 7, 8 te bereiken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Inleiding tot de onderdelen van de wounder (figuur 1)
- Bereid de penhouder door de vaststelling van het verwonden pinnen op gelijke afstanden. Houd de pipet tips en pas de hoogte tip door het bewegen van de verstelbare verwonding pinnen op en neer.
- Breng de verstelbare geleiding-balk verschillende merken 96 putjes en zorgen dat de verwonding gebied zich in een vaste positie.
- Bevestig de verstelbare verwonding pen vast door de zeskante schroef. Bevestig de leidende-bar in positie vast door de zeskante kop caps aan beide uiteinden.
2. De breedte van de penhouder instellen (figuur 2)
- Draai de zeskante kop caps met de M5 inbussleutel.
- Plaats een geschikt aantal stelringen aan beide zijden van de penhouder, zodat de geleidingsstaven sluiten perfect aan de breedte van de 96-well kweekplaat.
LET OP: Corning en Iwaki platen vereist 1 paar grote ringen en 1 paar kleine ringen. Falcon en Nunc plAtes nodig 1 paar grote ringen. - Draai de zeskante kop caps om de leidende bar op te lossen.
3. Instellen van de Guiding Bars (figuur 3)
- Monteer de verwonden pinnen met een steriele 10-ul plastic pipetpunten.
- Draai de zeskante kop caps met de M5 inbussleutel.
- Houd de wounder en dompel het verwonden kunnen in een kolom van een 96-well kweekplaat.
- De hoogte van de geleidingsstaven totdat alle tips nauwelijks de bodem van de putjes raken.
- Draai de zeskante kop caps. Zorg ervoor dat de wounder nu perfect past op de cultuur plaat en dat de pennen zijn goed gepositioneerd in het midden van de putten.
4. Kalibratie van de Pins
- Houd de wounder loodrecht op een vlakke ondergrond steriel (dwz petrischaal) en draai de zeskantschroeven met de M3 inbussleutel.
- Tik op de wounder totdat alle tips gelijkmatig de vlakke steriel oppervlak raken.
- Draai de zeskante schroeven opnieuw om de pennen vergrendelen.
- Controleer de gelijkheid van elke tip door de wounder zachtjes tikken op het platte steriel oppervlak.
Krassen 5. Cel monolaag (figuur 4)
- Seed menselijke navelstreng vasculaire endotheliale cellen op een 0,1% gelatine gecoate 96-well celkweek plaat. Kweekcellen in Medium 199 aangevuld met 20% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 1% penicilline / streptomycine en 0,09 g / l heparine. Handhaaf cellen in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 ° C overnacht vóór gebruik. De cellen moeten 100% samenvloeiing bereiken voordat verwonden.
- Plaats de verwonding tips op de meest linkse (of meest rechtse) zijde van elk putje in dezelfde kolom van de kweekplaat. Schuif de wounder over naar de andere kant van de put; zorg ervoor dat de verwonding tips zijn de bodem van de put te raken.
- Herhaal de krabben (Stap 5.2) voor alle kolommen.
- Na verwonding, verwerp tHij medium in elk putje en te vervangen door vers medium met het testen van verbindingen.
6. Data Acquisition en beeldanalyse
- Afbeelding doorgaans gunstig met de mechanische gewikkeld op de cel monolaag met een laag vermogen microscoop met digitale camera (bijvoorbeeld 10X objectief) onmiddellijk na verwonding (t = 0 h).
- Voeg testverbindingen indien gewenst en incubeer gedurende de gewenste tijdsduur. Het imago van de hele goed met de wond gebied opnieuw nadat de gewenste incubatietijd (t = Ah).
- Met behulp van beeldanalyse-software zoals ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ij/ ), het meten van de gewonde gebied op de afbeelding met de losse hand.
- Bereken het percentage wondsluiting:
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze 8-kanaals mechanische wounder is geconstrueerd om een cel monolaag krabben om de celmigratie analyse uit te voeren. Het is een gebruiksvriendelijk apparaat dat cel krassen assays in 96-well platen in minder dan een minuut kan uitvoeren zonder speciale opleiding. Dit kan wounder wondgebieden introduceren op celmonolagen met een uniforme breedte van ongeveer 600 micrometer en met scherpe randen (figuren 5 en 6). De breedte van de wonden afhankelijk ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Onze cel wounder heeft een aantal unieke functies in het oplossen van de problemen van de traditionele celmigratie assays. De 8-kanaals mechanische cel wounder is gemaakt van hoogwaardig roestvrij staal (staal 304) met een lange levensduur die kan worden gesteriliseerd in een autoclaaf. Bijna alle commerciële merken van 96 putjes op de markt kan worden gebruikt met deze mechanische cel wounder vanwege de verstelbare geleidingsstaaf. Het ontwerp van de verstelbare geleiding balk zorgt er ook voor dat de scharrelruimte is...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag aan de heer Tam Po Leung, de heer Wong Chi Kin en de technische staf van de FNWI Workshop, Hong Kong Baptist University, om hun technische vaardigheden en advies te bedanken bij het maken van het prototype van deze wounder.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96-well cell culture plate | Nunc | 167008 | Ook andere merken van 96-well cell culture plate kunnen worden gebruikt |
| P10 pipette tips | Axygen | 301-03-051 | Korte P10 pipette tip is gemakkelijker om een duidelijke wond te maken |
| Wounder | R&P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | Voor celcultuur van humane umbilicale veneuze endotheelcellen. Gebruik geschikt kweekmedium en omstandigheden voor andere typen cellen. |
| Fetaal bovien serum | Gibco | 26140079 | Voor celcultuur van humane umbilicale veneuze endotheelcellen. Gebruik geschikt kweekmedium en omstandigheden voor andere typen cellen. |
| Penicilline/Streptomycine | Gibco | 15140122 | Voor celcultuur van humane umbilicale veneuze endotheelcellen. Gebruik geschikt kweekmedium en omstandigheden voor andere typen cellen. |
| Heparine natriumzout uit varkensdarm mucosa | Sigma | H3393 | Voor celcultuur van humane umbilicale veneuze endotheelcellen. Gebruik geschikt kweekmedium en omstandigheden voor andere typen cellen. |
| Gelatine uit runderhuid | Sigma | G9391 | Voor celcultuur van humane umbilicale veneuze endotheelcellen. Gebruik geschikt kweekmedium en omstandigheden voor andere typen cellen. |
Referenties
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
- Sholley, M. M., Gimbrone, M. A. Jr, Cotran, R. S. Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures. Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).
- Gotlieb, A. I., Spector, W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci Rep. 18 (5), 9980(2015).
- Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21(2004).
- Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury. Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).
- Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates. J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
- Yue, P. Y., et al. Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro. Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).
- Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a. Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
