Hier presenteren we een protocol bij een semi-high throughput celmigratie analyse uit te voeren op een 96-well celcultuur plaat. Dit protocol is een snelle, eenvoudige en economische methode om consistente kras wonden op een cel monolaag te creëren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een inrichting voor het uitvoeren van celmigratie / wondgenezing in een 96-putjesplaat
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De celmigratie / verwonden assay is een veelgebruikte werkwijze om celmigratie en andere biologische processen zoals angiogenese en tumormetastase bestuderen. In deze assay worden cellen gekweekt tot een confluente monolaag te vormen en een mechanische wond door krassen met een inrichting. Vervolgens de migratie snelheid van de cellen naar het blootgelegde gebied kan worden gevolgd door beeldvorming. De 8-kanaals mechanische wounder is ontworpen om de meeste van de problemen bij de celmigratie assay pakken. Ten eerste kunnen onze wounder gemakkelijk worden gesteriliseerd door autoclaveren of gewone ontsmettingsmiddelen. In de tweede plaats, laat de individuele verstelbare pinnen zelfs contact op met de celkweek plaat zodat scherpe en reproduceerbare wonden kunnen worden gemaakt. Ten derde, de geleidingsstaven aan beide zijden van de wounder consistente verwonding positie in elk putje. Het gebruik van wegwerp plastic pipet tips voor het verwonden kunnen verder betere hantering van de wounder en cross-contaminat minimaliserenion. Concluderend kan onze mobiele wounder onderzoekers met gebruiksvriendelijke en reproduceerbare inrichting voor het uitvoeren van de celmigratie assay met behulp van de standaard 96-well kweekplaat.
Inleiding
Celmigratie speelt een belangrijke rol in de cellulaire processen zoals embryogenese, neurogenese, angiogenese, wondheling, mucosale reparatie, epitheliale-mesenchymale-overgangen in normale ontwikkeling en ziekte situatie 1. Het is een ingewikkeld proces waarbij de coördinatie van een groot aantal inter- en intra-cellulaire evenementen, waaronder signalering molecuul interacties, cel polarisatie, cytoskelet reorganisatie matrix remodeling, membraan uitsteeksel en dynamische cel-cel adhesie modulatie 2 gaat. Door het bestuderen van celmigratie, kan de ontdekking en validatie van chemicaliën of biomoleculen leidt tot cel....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Inleiding tot de onderdelen van de wounder (figuur 1)
- Bereid de penhouder door de vaststelling van het verwonden pinnen op gelijke afstanden. Houd de pipet tips en pas de hoogte tip door het bewegen van de verstelbare verwonding pinnen op en neer.
- Breng de verstelbare geleiding-balk verschillende merken 96 putjes en zorgen dat de verwonding gebied zich in een vaste positie.
- Bevestig de verstelbare verwonding pen vast door de zeskante schroef. Bevestig de leidende-bar in positie vast door de zeskante kop caps aan beide uiteinden.
2. De breedte van de penhouder instellen (figuur 2)
- Draai de....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Deze 8-kanaals mechanische wounder is geconstrueerd om een cel monolaag krabben om de celmigratie analyse uit te voeren. Het is een gebruiksvriendelijk apparaat dat cel krassen assays in 96-well platen in minder dan een minuut kan uitvoeren zonder speciale opleiding. Dit kan wounder wondgebieden introduceren op celmonolagen met een uniforme breedte van ongeveer 600 micrometer en met scherpe randen (figuren 5 en 6). De breedte van de wonden afhankelijk .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Onze cel wounder heeft een aantal unieke functies in het oplossen van de problemen van de traditionele celmigratie assays. De 8-kanaals mechanische cel wounder is gemaakt van hoogwaardig roestvrij staal (staal 304) met een lange levensduur die kan worden gesteriliseerd in een autoclaaf. Bijna alle commerciële merken van 96 putjes op de markt kan worden gebruikt met deze mechanische cel wounder vanwege de verstelbare geleidingsstaaf. Het ontwerp van de verstelbare geleiding balk zorgt er ook voor dat de scharrelruimte is.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag aan de heer Tam Po Leung, de heer Wong Chi Kin en de technische staf van de FNWI Workshop, Hong Kong Baptist University, om hun technische vaardigheden en advies te bedanken bij het maken van het prototype van deze wounder.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96-well cell culture plate | Nunc | 167008 | Ook andere merken van 96-well cell culture plate kunnen worden gebruikt |
| P10 pipette tips | Axygen | 301-03-051 | Korte P10 pipette tip is gemakkelijker om een duidelijke wond te maken |
| Wounder | R&P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | Voor celcultuur van humane umbilicale veneuze endotheelcellen. Gebruik geschikt kweekmedium en omstandigheden voor andere typen cellen. |
| Fetaal bovien serum | Gibco | 26140079 | Voor celcultuur van humane umbilicale veneuze endotheelcellen. Gebruik geschikt kweekmedium en omstandigheden voor andere typen cellen. |
| Penicilline/Streptomycine | Gibco | 15140122 | Voor celcultuur van humane umbilicale veneuze endotheelcellen. Gebruik geschikt kweekmedium en omstandigheden voor andere typen cellen. |
| Heparine natriumzout uit varkensdarm mucosa | Sigma | H3393 | Voor celcultuur van humane umbilicale veneuze endotheelcellen. Gebruik geschikt kweekmedium en omstandigheden voor andere typen cellen. |
| Gelatine uit runderhuid | Sigma | G9391 | Voor celcultuur van humane umbilicale veneuze endotheelcellen. Gebruik geschikt kweekmedium en omstandigheden voor andere typen cellen. |
Referenties
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 16 (....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
