Analyse van de beëindiging van de transcriptie gebruik van BrUTP-streng-specifieke transcriptie Run-on (TRO) Approach

Samenvatting

We beschrijven een basisexperimentele benadering voor analyse van de terminatie van transcriptie door RNA-polymerase II in vivo met behulp van BrUTP door de strengspecifieke transcriptie run-on (TRO) benadering in knoppende gist. Dit protocol kan worden uitgebreid om de transcriptieterminatie door andere RNA-polymerasen te bestuderen, zowel in gist als in hogere eukaryoten.

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een protocol voor het detecteren transcriptieterminatie defect in vivo. De streng-specifieke TRO protocol gebruikt BrUTP beschreven is een krachtige experimentele benadering voor het analyseren van de transcriptie beëindiging defect onder fysiologische omstandigheden. Als de traditionele TRO assay is gebaseerd op de aanwezigheid van een transcriptioneel actieve polymerase voorbij het 3 'uiteinde van het gen als een indicator van een transcriptie terminatie defect ^1. Het overwint twee grote problemen met de traditionele TRO test. Ten eerste kan het detecteren of het polymerase lezen door het terminatiesignaal is die transcriptie geïnitieerd van de promoter-proximale regio, of simpelweg vertegenwoordigt een pervasively transcriberen polymerase die aspecifiek geïnitieerd ergens in het lichaam of het 3' uiteinde van het gen. Ten tweede kan onderscheiden of het transcriptioneel actieve polymerase-signaal buiten hetterminatorgebied werkelijk de readthrough sense mRNA transcriberen polymerase of een terminator geïnitieerde niet-coderende antisense RNA signaal. Kort samengevat, het protocol omvat permeabilisatie de exponentieel groeiende gistcellen, waardoor de transcripten die in vivo gestart te rekken in aanwezigheid van de BrUTP nucleotide zuiveren BrUTP gelabelde RNA met de affiniteit benadering reverse transcriberen het gezuiverde ontluikende RNA en amplificatie van het cDNA met behulp strengs specifieke primers aan weerszijden van de promoter en terminator gebieden van het gen ^2.

Inleiding

De eukaryotische transcriptie cyclus bestaat uit drie belangrijke stappen; initiatie, verlenging en beëindiging. De beëindiging van de transcriptie door RNA-polymerase II bestaat uit twee afzonderlijke, onderling afhankelijke stappen ^3. De eerste stap is splitsing en afgifte polyadenylatie van mRNA uit de matrijs en wordt onmiddellijk gevolgd door de tweede stap, gekenmerkt door losmaken van polymerase van de sjabloon. Juiste afsluiting is cruciaal voor de recycling van de polymerase bij aanvang / her-initiatie van transcriptie, het voorkomen interferentie met de transcriptie van downstream genen, en het bijhouden van afwijkende transcriptie controle door het beperken transcriptie van doordringende niet-coderende RNA ^{4, 5.} Ondanks recente vooruitgang beëindiging veruit de minst begrepen stap van het RNA polymerase II de transcriptie cyclus. Een betrouwbare beëindiging test is essentieel voor het bestuderen van het mechanisme underlying beëindiging van transcriptie door RNA polymerase II in vivo.

Een aantal experimentele benaderingen worden gebruikt om de beëindiging defect in een actief transcriberen gen onder fysiologische ziektebeelden. Deze omvatten Northern blot, beëindiging factor chip (Chromatine Immunoprecipitatie) en de traditionele TRO test. Elk van deze technieken heeft voordelen als nadelen. De traditionele TRO assay gebruikt om de meest betrouwbare en gevoelige benadering voor de detectie van een transcriptie terminatie defect in vivo ¹ zijn. Deze test lokaliseert het transcriptioneel actieve polymerase moleculen op verschillende gebieden van een gen in de cel. Onder normale omstandigheden het assay toont gekoppelde transcriptie polymerase moleculen strikt verdeeld tussen de promoter en terminator van het gen (Figuur 1A). Na beëindiging defecte echter het polymerase in staat is de beëindiging uitgelezen signaalen wordt gedetecteerd in het gebied stroomafwaarts van het 3'-uiteinde van het gen (Figuur 1B).

Een transcriptieterminatiesequentie defect manifesteert in aanwezigheid van een sense-transcriptie polymerase dat geïnitieerd van de promoter-proximale gebied, en niet in staat om de beëindiging uitgelezen signaal blijft transcriptie van het gebied stroomafwaarts van het 3'-uiteinde van een gen zoals getoond in figuur 2A. Met het besef dat de eukaryote genoom vertoont overweldigend alomtegenwoordig transcriptie in zin evenals anti-sense richtingen in en rond een gen ^{6, 7, 8, 9, 10,} werd al snel duidelijk dat de traditionele TRO test niet kan detecteren of de polymerase signaal stroomafwaarts van een gen betekent een promotor geïnitieerd transcript (Figuur 2A) of een afwijkende RNA dat som ingeleidewhere in het midden van het gen of stroomafwaarts van de terminator element (figuur 2B) of de polymerase transcriptie van de antisense richting vanaf het 3 'uiteinde van het gen (Figuur 2C). De streng-specifieke TRO assay gebruikt BrUTP beschreven kunnen onderscheiden of de waargenomen readthrough polymerase-promoter representeert geïnitieerde verlengde sense mRNA of een antisense transcript dat stroomafwaarts van het gen onderzochte ingeleid. We hebben met succes deze benadering gebruikt om de rol van Kin28 kinase beëindiging van transcriptie aangetoond in gist ^2. Gebruikmakend van de aanpak hier laten we zien dat Rna14 nodig is voor de beëindiging van de transcriptie van ASC1 in gist.

Protocol

Opmerking: Deze werkwijze werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in artikel Medler, S en Ansari, A. ^2.

1. Het kweken en oogsten van de cellen

1. Start een 5 ml kweek van cellen in YPD-medium (10 g / l gistextract, 20 g / l pepton, 2% dextrose) uit een vers uitgestreken plaat Saccharomyces cerevisiae.
2. Groeien de cellen overnacht in een orbitale schudder bij 30 ° C en 250 rpm.
3. Verdun de nacht gegroeide kweek 100 keer tot een eindvolume van 100 ml in YPD medium in een 250-ml kolf war.
   LET OP: Een totaal van 100 ml van de cultuur is nodig per TRO reactie; Als meerdere reacties nodig zijn, moet een groter volume kweek worden gebruikt.
4. Groeien de cellen tot een optische dichtheid van 0,8-1,0 bij 600 nm ₍₆₀₀ A ~ 0,8-1,0).
5. Oogst de cellen door centrifugatie bij 820 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C in een steriele 50 ml conische buis.
6. Resuspendeer de cellen in 10 ml ijskoude TMN buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM _MgCl2, 100 mM NaCl) en incubeer op ijs gedurende 5 minuten.
7. Centrifugeer bij 820 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C om de cellen te pelleteren. Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie.

2. permeabilisatie en Voorbereiden Cellen voor Run-on Assay

1. Resuspendeer de cellen in 1 ml 0,6% sarkosyl oplossing op en neer pipetteren zachtjes met een afgeknot P ₁₀₀₀ tip. Breng de celsuspensie aan een gekoelde 1,5 ml microcentrifugebuis.
2. Schud de cellen voorzichtig bij 4 ° C gedurende 25 min op een platform shaker.
   OPMERKING: Reactievaatjes moet worden verpakt in een 50 ml conische buis met ijs om een ​​lage temperatuur te handhaven op het vermijden van elke nieuwe initiatie gebeurtenissen in de promoter in dit stadium.
3. Centrifugeer de cellen bij 1200 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C met een tafelblad gekoelde centrifuge.
4. Zuig het supernatant om de overtollige vloeistof uit de per verwijderenmeabilized cel pellet.

3. transcriptie Run-on Reaction

1. Voeg 150 ul van transcriptie oploopvlak buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCI, 10 mM _MgCl2, 2 mM DTT (dithiothreitol), 0,75 mM elk van ATP, CTP, GTP en BrUTP, 200 U RNase inhibitor) aan de gepermeabiliseerde cel pellet.
2. Meng voorzichtig door en neer te pipetteren met behulp van een afgeknotte P ₂₀₀ tip.
   LET OP: Als de verwerking van meerdere monsters, houden alles op ijs tot alle monsters zijn klaar en ga dan verder naar de volgende stap.
3. Incubeer gedurende 5 minuten bij 30 ° C in een waterbad.
   LET OP: Stel de incubatietijd tussen 1 en 5 minuten om een ​​optimale integratie van BrUTP te garanderen in de ontluikende RNA.
4. Stop de reactie door toevoeging van 500 pi koude kant-en-klare RNA-isolatie reagens. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.

4. RNA-extractie

1. Voeg 200 pl zuur gewassen glasparels aan de cel ophanging,on (stap 3.4) en schud krachtig gedurende 20 minuten bij 4 ° C in een vortex mixer.
2. Doorboren de bodem van de microcentrifugebuis met een hete 22 G naald en plaats het op de top van een 15 ml steriele conische buis.
3. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 1 min bij 4 ° C om het cellysaat te verzamelen. Breng de cellysaat een 1,5 ml microcentrifugebuis.
4. Voeg 500 ul koud RNA-isolatie reagens en 200 pl chloroform aan het cellysaat. Meng de inhoud van een vortex mixer en centrifugeer bij 16.168 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
5. Breng de bovenste waterige fase naar een nieuwe microcentrifugebuis.
6. Voeg een gelijk volume van koude fenol / chloroform / isoamylalcohol (125: 24: 1) pH 4-5. Schud op een vortex mixer en centrifugeer bij 16.168 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
7. Breng de bovenste waterige fase die RNA naar een nieuwe microcentrifugebuis. Herhaal stap 4.6 nog twee keer.
8. Om de finale RNA-bevattende waterfase, voeg 5 M NaCl stock om een ​​eindconcentratie van 0,3 M. Voeg 3 maal het volume koude ethanol om het RNA te precipiteren.
   1. Incubeer gedurende 1 uur of overnacht bij -20 ° C.
      OPMERKING: Voer de stappen 4,9-4,11 terwijl de anti-BrdU korrels worden gedurende het blokkeren (zie stap 5.3).
9. Centrifugeer bij 16.168 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de RNA pellet in 100 ul van DEPC (diethylpyrocarbonaat) water.
10. Gebruik een RNA-isolatie mini kit om het RNA te scheiden van de niet opgenomen nucleotiden BrUTP. Elueer het RNA uit de kolom met 100 gl RNase-vrij water.
11. Incubeer de RNA in een 65 ° C waterbad gedurende 5 minuten en vervolgens over ijs gedurende ten minste 2 min.

5. affiniteitszuivering van BrUTP-gelabelde RNA

1. Tot 25 pl anti-BrdU vaste parels, voeg 500 ul van 0,25x SSPE (Natrium Saline fosfaat EDTA) bindingsbuffer (20x SSPE: 3 M NaCl, 0,2 M NaH ₂ PO ₄ , 0,02 M EDTA, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,05% Tween, 37,5 mM NaCl). Centrifugeer bij 200 xg gedurende 30 seconden bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof.
2. Herhaal stap 5,1 driemaal.
3. Voeg 500 pl blokkerende buffer (1x bindingsbuffer, 0,1% polyvinylpyrrolidon, 1 mg ultrazuivere runderserumalbumine (BSA)) aan de korrels en schud voorzichtig gedurende 1-2 uur bij 4 ° C op een platform shaker.
4. Was de korrels nog tweemaal met 500 ul bindingsbuffer, zoals beschreven in stap 5.1.
5. Voeg 400 ul bindingsbuffer aan de korrels.
6. Breng 100 pi van RNA (van stap 4,11) rechtstreeks aan de korrels. Incubeer onder voorzichtig schudden gedurende 1 - 2 uur bij 4 ° C op een platform shaker.
7. Was de kralen achtereenvolgens met 500 ul bindingsbuffer, 500 pl buffer met laag zoutgehalte (0,2X SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween), 500 ul buffer met hoog zoutgehalte (0,25x SSPE, 1 mM EDTA, 0,05% Tween, 100 mM NaCl), en tweemaal met 500 ul van TET buffer (1x tE, 0,05% Tween), spinnen bij200 g gedurende 30 seconden bij 4 ° C tussen elke wassing.
8. Elueer het BrUTP-gemerkte RNA parels achtereenvolgens tweemaal met 150 ul en eenmaal met 200 ui elutiebuffer (20 mM DTT, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS), door incubatie gedurende 4 min bij 42 ° C in een waterbad, gevolgd door kort centrifugeren tot korrels te scheiden van het supernatant.

6. Neerslag van BrUTP gelabelde RNA

1. Voeg 500 ul koud fenol / chloroform / isoamylalcohol (125: 24: 1) pH 4-5 om de affiniteit gezuiverde BrUTP gelabeld RNA. Mengen op een vortex mixer en centrifugeer bij 16.168 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
2. Breng de bovenste waterige fase naar een nieuwe microcentrifugebuis.
3. Voeg 5 M NaCl voorraad tot een eindconcentratie van 0,3 M en 3 maal het volume koude ethanol naar het RNA te precipiteren.
4. Incuberen bij -20 ° C overnacht.
5. Verzamel het neergeslagen RNA door centrifugatie bij 16.168 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
6. Verwijder de bovenstaande vloeistof en de pellet aan de lucht drogen gedurende 10 min.
7. Resuspendeer de RNA pellet in 26 ul DEPC water.
8. Bepaal de uiteindelijke RNA-concentratie door meting van de absorptie bij 260 nm met een spectrofotometer. Ook bepaalt de verhouding 260/280. Een verhouding ~ 2 duidt op een pure RNA monster.
9. Bewaar de RNA monsters in aliquots bij -80 ° C totdat ze nodig voor cDNA-synthese.

7. Reverse transcriptie van BrUTP-gelabelde RNA

1. Pas de RNA-concentratie tot 100 ng / ul met behulp van DEPC water. Gebruik 0,5 ug RNA voor elk cDNA-synthesereactie.
   Opmerking: De concentratie van RNA-matrijs kan variëren 0,5-1,0 ug tot optimale cDNA-synthese te bereiken.
2. Reverse transcriberen het RNA met meerdere omgekeerde primers stroomafwaarts van het poly (A) website (stopplaats) zoals getoond in figuur 3A.
3. Aan elke reverse transcriptie reactie, voeg 5 ul RNA template (0,5 ug), 1 uL dNTP mix (10 mM elk), 2 pl reverse primer C, D, E, F of G (50 uM elk) (zie figuur 3A) en nuclease vrij water. Het uiteindelijke reactievolume in elke buis 13 pi.
   Opmerking: Het aantal reverse transcriptie reacties zullen afhangen van het aantal omgekeerde primers voor cDNA-synthese. Bijvoorbeeld, voor ASC1 vijf reverse primers werden gebruikt en dus werden vijf reverse transcriptie reacties opgezet. Label de buizen als C, D, E, F en G aan de hand van de reverse primer voor cDNA-synthese.
4. Incubeer de buizen met RNA-matrijs, dNTP mix en primers in een thermocycler bij 65 ° C gedurende 5 minuten aan een secundaire structurele conformatie te verwijderen, en daarna afkoelen tot 4 ° C gedurende ten minste 2 min.
5. Voeg 1 pl reverse transcriptase (200 U / pl), 4 ui buffer en 2 ui 0,1 M DTT aan elke buis met het RNA-matrijs en primer (stap 7,4). Meng door pipetteren voorzichtig op en neer.
6. Uitvoeren reverse transcriptie door het incuberen van het reactiemengsel in een thermocycler bij 42 ° C gedurende 60 minuten.
7. Inactiveren reverse transcriptase bij 65 ° C gedurende 20 min.
8. Bewaar de cDNA bij -20 ° C of naar de volgende stap.

8. Amplificatie van cDNA

1. Voer de PCR-reactie voor amplificatie van elke cDNA-preparaat (aangeduid C, D, E, F en G ASC1) vanaf stap 7,8 als volgt: 3,0 pi cDNA sjabloon in stap 7,8, 1,0 pl voorwaartse primer B (10 uM), 1,0 ul reverse primer C of D of E of F of G (10 uM), 2,5 ui 10x polymerase PCR-buffer, 0,5 uL dNTP mix (10 mM elk), 1,0 pl _MgCl2 (2,5 mM), 15,5 ui PCR kwaliteit water en 0,5 pl thermostabiele polymerase enzym.
   OPMERKING: Verschillende verdunningen van cDNA template variërend van 1: 5 tot 1: 100 te worden getest om de productopbrengst PCR optimaliseren. Een enkele promoter-proximale forward primer gebruikt om cDNA te amplificerenverkregen met verschillende reverse primers. Bijvoorbeeld, één voorwaartse primer B vlakbij het promoter werd gebruikt in combinatie met vijf reverse primers van C naar G ASC1. BC, BD, BE, BG BF en werden in buizen respectievelijk aangeduid als C, D, E, F en G zoals getoond in figuur 3A.
2. Voer het PCR met de volgende thermische cyclus parameters: 1 cyclus 95 ° C gedurende 2 min (warme start voor het activeren van polymerase), 30 - 40 cycli 95 ° C gedurende 30 s (denaturatie), 54 ° C gedurende 15 s (hybridisatie) , 68 ° C gedurende 1 min (extensie), en 1 cyclus 68 ° C gedurende 5 min (laatste verlenging).
   OPMERKING: De annealing temperatuur zal variëren afhankelijk van de specifieke primers wordt gebruikt en de verlenging zal variëren afhankelijk van de verwachte productgrootte.
3. Scheid het PCR product door elektroforese op 0,8%, 1,5% of 2% agarosegels afhankelijk van de verwachte grootte van het product.
4. Kwantificeren PCR product zoals beschreven in El Kaderi et al. , 2012 ^11.
   LET OP: U kunt ook gebruik maken van real-time RT-qPCR strategie om het bedrag van de ontluikende transcripten te kwantificeren.

Resultaten

Om de toepasbaarheid van de BrUTP-streng-specifieke TRO procedure aan te tonen in het detecteren van een transcriptie terminatie defect, gebruikten we een beëindiging-defect is, temperatuurgevoelige mutant van RNA14 genoemd rna14-1. De rol van Rna14 in de beëindiging van de transcriptie door RNA-polymerase II werd aangetoond met behulp van de traditionele TRO test die RNA in de terminator-proximale gebied van geselecteerde genen ¹ gedetecteerd. D...

Discussie

De streng-specifieke TRO protocol hier gebruikt werd aangepast van het protocol dat wordt gebruikt voor het GRO-Seq (Global Run On-Sequencing) analyse in zoogdiercellen ^12. We hebben met succes het protocol aangepast om ontluikende transcriptie studeren in gist. Om specifiek wat de transcriptie beëindiging defect, aangepast we het protocol verder door zich te ontdoen van de RNA-hydrolyse stap. Dit liet ons toe om specifiek detecteren volledige lengte ontluikende transcripten die geïnitieerd vanaf...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fenol-chloorform-isoamylalcohol mengsel	Sigma-Aldrich	77619	pH 4-5
TRIzol reagens	Life technologies	15596-026
RNase Inhibitor, menselijke placenta	New England Biolabs	M0307S
Anti-BrdU kralen	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323AC
Protoscript II	New England Biolabs	M03368L	of een gelijkwaardig enzym
Advantage 2 polymerase Mix	Clontech	639201	of een gelijkwaardig enzym
5-Bromouridine 5' trifosfaat natriumzout	Santa Cruz Biotechnology	sc-214314A
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104
ATP	New England Biolabs	N0451AA
CTP		N0454AA
GTP		N0452AA
Ultra-pure bovien serum albumine (BSA)	MC Labs	UBSA-100
Asc1 B			AGATTCGTCGGTCACAAGTCC
Asc1 C			GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC
Asc1 D			TGTACATATGTATTTTCGCAGCA
Asc1 E			GCCAAGGAGACTGAATTTAATG
Asc1 F			CTATGGAATGGGGGTTTTAAG
Asc1 G			GGTTATGGCAGACATGCCAC
5s cDNA			AGATTGCAGCACCTGAGT
5’ 5s omgekeerd			GGTTGCGGCCATATCTAC
3’ 5s omgekeerd			TGAGTTTCGCGTATGGTC