Methodenartikel

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

DOI:

10.3791/55448

⸱

16 mei 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Structural Biochemistry, Max Planck Institute of Molecular Physiology, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Texas Medical School at Houston

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel wordt een protocol voor het verwerken van cryo-EM-beelden gepresenteerd met behulp van de software suite SPHIRE. Het onderhavige protocol kan toegepast worden op bijna alle enkel-deeltjes-EM-projecten die zich richten op bijna atomaire resolutie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SPHIRE (SPARX voor High-Resolution Electron Microscopy) is een nieuwe open-source, gebruiksvriendelijke software suite voor de semi-geautomatiseerde verwerking van single-particle electron cryo-microscopie (cryo-EM) data. Het hier beschreven protocol beschrijft in detail hoe u een near-atom-resolutie-structuur kunt verkrijgen die begint met cryo-EM micrograph films door gebruikers te begeleiden door middel van alle stappen van de bepaling van de pijplijn met enkele deeltjesstructuur. Deze stappen worden gecontroleerd vanuit de nieuwe SPHIRE grafische gebruikersinterface en vereisen minimale gebruikersinterventie. Met behulp van dit protocol werd een 3,5 Å structuur van TcdA1, een Tc toxine complex van Photorhabdus luminescens , afgeleid van slechts 9500 enkele deeltjes. Deze gestroomlijnde aanpak zal beginnende gebruikers helpen zonder uitgebreide verwerkingservaring en voorafgaande structurele informatie om geluidsvrije en onpartijdige atoommodellen van hun gezuiverde macromoleculaire complexen in hun eigen staat te verkrijgen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na de ontwikkeling van de directe elektronen detector technologie, is de opmerkelijke vooruitgang in single-particle cryo-EM momenteel herstructurering van structurele biologie 1 . Vergeleken met röntgenkristallografie vereist deze techniek slechts een kleine hoeveelheid eiwitmateriaal zonder de noodzaak van kristallisatie, terwijl tegelijkertijd minder beperkingen voor de zuiverheid van het monster worden gesteld en nog steeds de bepaling van structuren bij bijna atoomresolutie mogelijk maakt. Het is belangrijk dat verschillende composities of toestanden nu computationally gescheiden zijn en structuurbepaling van de verschillende conformaties kan worden uitgevoerd op een ongekend detailniveau. Recentelijk kunnen dichtheidskaarten van uitdagende moleculen worden geproduceerd bij resoluties waardoor de novo modelbouw mogelijk is en zo diep inzicht in hun werkingswijze 2 , 3 , 4 , 5.

Een grote verscheidenheid aan beeldverwerkingssoftwarepakketten zijn beschikbaar in de 3DEM (3D Electron Microscopy) gemeenschap (https://nl.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) en de meeste van hen zijn onder voortdurende ontwikkeling. Bijna atoomresolutie is bereikt voor eiwitten die verschillende moleculaire gewichten en symmetrieën vertonen met verschillende softwarepakketten, waaronder EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 en SPARX 11 . Elk pakket vereist een ander niveau van gebruikers expertise en biedt een ander niveau van gebruikersbegeleiding, automatisering en extensibility. Bovendien, terwijl sommige programma's complete omgevingen bieden om alle stappen van beeldanalyse te vergemakkelijken, zijn anderen ontworpen om specifieke taken te optimaliseren, zoals de verfijning van uitlijnparameters vanaf een bekende rEferentiestructuur. Meer recent zijn er verschillende platforms ontwikkeld, waaronder APPION 12 en SCIPION 13 , die een enkele verwerkingspijpleiding bieden die benaderingen en protocollen integreert uit de hierboven genoemde softwarepakketten.

Om bij te dragen aan de huidige ontwikkeling van cryo-EM, werd SPARX opnieuw ontwikkeld tot een nieuw stand-alone en compleet platform voor single particle analysis, genaamd SPHIRE (SPARX voor High Resolution Electron Microscopy). Om de toegankelijkheid van de techniek voor nieuwe onderzoekers op het gebied te vergroten en om te gaan met de grote hoeveelheid data die wordt geproduceerd door moderne volledig geautomatiseerde high-end elektronenmicroscopen, werd de verwerkingspijplijn opnieuw ontworpen en vereenvoudigd door een makkelijk te gebruiken Grafische gebruikersinterface (GUI) en automatisering van de belangrijkste stappen van de workflow. Bovendien werden nieuwe algoritmen toegevoegd om snelle, reproduceerbare en geautomatiseerde structuurbepaling van cr mogelijk te makenYo-EM beelden. Voorts werd validatie door reproduceerbaarheid geïntroduceerd om voorkomende gangbare artefacten te voorkomen die geproduceerd werden tijdens verfijning en heterogeniteitsanalyse.

Hoewel het programma uitgebreid werd aangepast, werden de gewaardeerde kernkenmerken gehandhaafd: eenvoudige open source code, het moderne objectgerichte ontwerp en Python-interfaces voor alle basisfuncties. Zo werd het niet veranderd in een black box programma, waarmee gebruikers de Python-code kunnen bestuderen en gemakkelijk wijzigen, aanvullende toepassingen kunnen maken of de algehele werkstroom kunnen wijzigen. Dit is vooral handig voor non-standaard cryo-EM projecten.

Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van een map met bijna atoomresolutie dichtheid van cryo-EM beelden met behulp van de GUI van SPHIRE. Het beschrijft in detail alle stappen die nodig zijn om een ​​dichtheidskaart te genereren van ruwe cryo-EM directe detectorfilms en is niet beperkt tot een bepaald macromolecule type. Dit protocol is voornamelijk bedoeld om newc te begeleidenOmers in het veld door de workflow en verstrekken belangrijke informatie over cruciale stappen van de verwerking evenals enkele mogelijke valkuilen en obstakels. Meer geavanceerde functies en de theoretische achtergrond achter SPHIRE worden elders beschreven.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Om dit protocol te volgen, moet SPHIRE op een systeem met een MPI-installatie (momenteel een Linux-cluster) worden geïnstalleerd. Download SPHIRE en de TcdA1 dataset van http://www.sphire.mpg.de en volg de installatie instructies: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:download. Deze procedure installeert ook EMAN2. SPHIRE gebruikt momenteel EM122's e2boxer voor partikelselectie en e2display voor het weergeven van beeldbestanden. Voor de dosisgewogen bewegingscorrectie van de ruwe micrograaffilms gebruikt SPHIRE unblur 14 . Download het programma en volg de installatie instructies (http://grigoriefflab.janelia.org/unblur, Grigorieff lab). Voor het interactief visualiseren van de resulterende structuren, gebruikt het protocol het moleculaire grafische programma Chimera 15 (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html). Een fijne handleiding om vertrouwd te raken met de functies die door dit protocol worden gebruikt, kunnen fou zijnEn hier: https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/data/tutorials/eman07/chimera-eman-2007.html. Instructies voor het indienen van een parallelle baan naar een cluster van de SPHIRE GUI vindt u hier: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:submissions. De algemene organisatie van de SPHIRE GUI en de belangrijkste stappen van de door dit protocol uitgevoerde workflow worden geïllustreerd in figuur 1 .

1. PROJECT: Stel constante parameterwaarden voor dit project in

  1. Start de SPHIRE GUI applicatie door " sphire &" en de ENTER toets in een terminal venster te typen.
  2. Pas de projectbreedte parameters ( bijv. Pixelgrootte, deeltjesradius en symmetrie) in de respectievelijke invoervelden van de projectinstellingenpagina aan en registreer dan deze waarden voor alle volgende stappen van de workflow.
    1. Klik op het pictogram "PROJECT" rechtsonder in het linker paneel om de pagina Projectinstellingen te openen.
    2. Meet de langste as van een deeltje met behulp van het e2display.py beeld interactieve displaygereedschap en voer dan de helft van de deeltjesgrootte in op "Protein particle radius". Als de meting in A is, moet u het apparaat omzetten naar pixels met behulp van de pixelgrootte ( bijv. Als een deeltje 200 Å lang is en de pixelgrootte 1,2 A / pixel is, dan is de langste as van het deeltje 200 / 1,2 = ~ 166 pixels en de straal 166/2 = 83 pixels).
    3. Stel de grootte van de deeltjesbox op ten minste 1,5 keer van de deeltjesgrootte. Vermijd raamgroottes met een groot voornaam. Onthoud ook dat het 3D-verfijningsalgoritme momenteel een even genummerde doosgrootte nodig heeft.
      OPMERKING: in het venster moet een marge zijn opgenomen om rekening te houden met de initiële centrifugeringsfouten die voortvloeien uit het plukken (de noodzaak om deeltjes binnen het raam te verschuiven) en voor het voldoende achtergrondgebied buiten de deeltjesgrens voor een correcte CTF-correctie (vooral belangrijk voor grote defocuswaarden 16).
    4. Stel 'CTF venster grootte' in die van 'Particle box size'. Voor projecten met lage contrastgegevens, gebruik een groter venster om vlotere schattingen van power spectra te verkrijgen.
    5. Stel 'Point-group symmetrie' van het complex ( bijvoorbeeld 'C5'). Als de symmetrie van de doelstructuur niet bekend is, laat het dan bij "C1" (asymmetrisch). Als echter een bepaalde symmetrie met hoge order later wordt geïdentificeerd tijdens de verwerking, wijzigt u deze symmetrie-instelling dienovereenkomstig en herhaalt u de stappen na 2D-uitlijning met ISAC.
    6. Stel "Moleculair eiwit" in kDa (geschatte waarde volstaat). Druk op de knop "Registreren instellingen".

2. FILM: Richt de frames van elke filmmicrograaf om de totale beweging van de steekproef te corrigeren

  1. Voor alle filmmikrograafen, bereken de x / y-shift voor alle frames en maak dan hun dosisgewicht en dosisgewogen moGecorrigeerd gemiddelde (zie discussie). Merk op dat de voormalige alleen nodig is voor de CTF-schatting omdat de schatting niet goed presteert bij de dosisgewogen gemiddelden, terwijl deze laatste gebruikt wordt voor alle andere stappen van de structuurbepaling.
    1. Klik op het pictogram "MOVIE" en vervolgens op de knop "Micrograph Movie Alignment". Zet "Exblur executable path" instellen door het uitvoerbare bestand te selecteren. Stel 'Input micrograph path pattern' in door een ruwe ongewijzigde film micrograph te selecteren en het variabele deel van de bestandsnamen te vervangen door het wildcard "*" (bijvoorbeeld TcdA1 _ *. Mrc). Specificeer het pad voor "Output directory".
    2. Stel 'Summovie executable path' in door het uitvoerbare bestand te selecteren.
    3. Stel 'Aantal filmframes' in op het aantal frames in elke filmmicrobeeld. Stel de "Microscope voltage" en "Exposure per frame" in op de waarden die tijdens het verzamelen van gegevens worden gebruikt. (Voor exampLe, als de totale dosis 60 e / / 2 is met 20 beelden die zijn opgenomen zonder voorafgaande blootstelling, is de belichting voor elk kader 60/20 = 3 e / A 2. ) Druk op de "Run Command" knop om de Frames van elke film micrograaf.
      OPMERKING: dit creëert automatisch twee uitvoer directories die respectievelijk dosisgewicht en dosisgewogen bewegingsgerichte gemiddelde micrograven bevatten.

3. CTER: Schat de defocus- en astigmatismeparameters van de CTF

  1. Schat de CTF-parameters (defocus en astigmatisme, de andere worden door de gebruiker ingesteld) voor elke dosisgewogen gemiddelde micrograaf.
    1. Klik op het pictogram "CTER" en vervolgens op de knop "CTF Estimation". Om "Input micrograph path pattern" in te stellen, selecteer een dosisgewicht bewegingsgecorrigeerde micrograph en vervang het variabele deel van de bestandsnamen met de wildcard"*". Geef ook het pad op voor "Output directory".
    2. Stel 'Amplitude contrast' in op de waarde die routinematig gebruikt wordt voor het soort gegevens (ijsdikte is een belangrijke factor) en microscoopspanning in het laboratorium ( bijv. 10%). Typische waarden liggen in het 7 - 14% bereik 17 .
    3. Stel 'Microscoop sferische aberratie (Cs)' en 'Microscoopspanning' die tijdens de gegevensverzameling wordt gebruikt.
    4. Stel 'Laagste frequentie' en 'Hoogste frequentie' van het zoekbereik voor het CTF-modelfitting op respectievelijk 0.0285 en 0.285 Å -1 (40-4 Å). Druk op de knop "Run command" om de CTF parameters te schatten.
      OPMERKING: De CTF parameters worden automatisch opgeslagen in het bestand partres.txt in de opgegeven output directory. De CTF schatting van de 112 micrografen werd berekend op 96 kernen en afgerond na ~ 3 min op de Linux cluster gebruikt om de representatieve resultaten te verkrijgen.

4. Venster: Uittreksel deeltjes uit de dosisgewogen gemiddelde micrografieën

  1. Kies partikels handmatig of automatisch van micrograafen met e2boxer 6 en maak coördinaatbestanden, die elk een lijst bevatten van deeltjes xy-coördinaten binnen de bijbehorende micrografie.
    1. Klik op het "WINDOW" icoon en vervolgens op de knop "Particle Picking". Druk op de knop "Run command" om e2boxer 6 te starten en de partikels van elke micrograaf handmatig of automatisch te selecteren 18 (zie Discussie ). Bewaar de finale deeltjescoördinaten voor elke micrograaf in het EMAN1-bestandsformaat (.box). Als alternatief importeer u de coördinatiedossiers van andere programma's na het converteren naar de EMAN1-indeling.
  2. Partikelstapels maken door deeltjesbeelden uit de dosisgewogen micrografen te extraheren (in SPHIRE is deeltjesstapel vaakEn gewoon 'stack' genoemd).
    1. Druk op de knop "Particle Extraction". Specificeer "Input micrograph path pattern" door een dosisgewogen bewegingsgerichte micrograph te selecteren en vervang het variabele deel van de bestandsnamen met de wildcard "*" (bijvoorbeeld TcdA1 _ *. Mrc). Stel ook "Input coordinates path pattern" in door een coördinatenbestand te kiezen (bijvoorbeeld TcdA1 _ *.). Specificeer het pad voor "Output directory".
    2. Stel 'CTF parameters source' in door het CTF parameter bestand te selecteren (partres.txt geproduceerd in stap 3.1). Druk op de knop "Uitvoeren commando".
  3. Combineer de geëxtraheerde deeltjesbeeldstapels in één enkele.
    1. Klik op de knop "Particle Stack". Specificeer het pad naar "Output virtual image stack" met behulp van een BDB file path formaat ( bijv. "Bdb: Particles / stack", waar "Particles" wijzen opE directory met een BDB databank directory waarvan de naam altijd EMAN2DB is en "stack" verwijst naar een bepaalde beeldstapel in deze database). Specificeer "Input BDB image stack patroon" door een map te selecteren die begint met "mpi_proc" en vervang dan het variabele deel van de directorynamen met de wildcard "*" ( bijv. Particles / mpi_proc_000 naar Particles / mpi_proc_ *). Druk op de knop "Uitvoeren commando".

5. ISAC: Classificatie van deeltjesbeelden in 2D

  1. Bereken 2D-klasgemiddelden door deeltjes aan te passen en te clusteren volgens hun 2D-uitstraling.
    OPMERKING: De resulterende 2D gemiddelden hebben een verbeterde signaal-ruisverhouding (SNR) in vergelijking met de individuele deeltjesbeelden en worden dus gebruikt om de kwaliteit en heterogeniteit van de dataset visueel te beoordelen, evenals ongewenste afbeeldingen uit de stapel uit te sorteren (Bijvoorbeeld ijskristallen, koolstofranden,Aggregaten, fragmenten, en dergelijke) 19 . Bovendien worden ze vervolgens gebruikt om een ​​eerste 3D-model te bepalen.
    1. Klik op het icoon "ISAC" en vervolgens op de knop "ISAC - 2D Clustering". Zet "Input image stack" door het stack bestand te selecteren dat de geëxtraheerde deeltjes bevat. Specificeer het pad voor "Output directory".
    2. Gebruik 200 - 1000 voor "Afbeeldingen per klas". Kies het juiste nummer in het licht van het verwachte aantal 2D-klassen (het totale aantal deeltjes gedeeld door het aantal beelden per klas). Pas deze parameter aan, afhankelijk van de SNR en de grootte van de dataset. Verhoog het aantal leden per les als de dataset te luidruchtig is. Verlaag het aantal wanneer een klein aantal deeltjes beschikbaar is.
      OPMERKING: Omwille van geheugenlimieten, voor vrij grote datasets (> 100.000 deeltjes), verdeel de volledige dataset in subsets, voer ISAC voor elke subset zelfstandig uit en combineer dezeDe resultaten op het einde. Gedetailleerde instructies voor dit verwerkingsscenario staan ​​op http://www.sphire.mpg.de/wiki/doku.php.
    3. Controleer het selectievakje 'Fase-flip'. Houd de standaardwaarden voor de "Doel deeltjesradius" en "Beeldgrootte van de deeltjesformaat" vast om het proces te bespoedigen door automatisch alle partikelafbeeldingen met deze instellingen te krimpen. Druk op de knop "Uitvoeren commando" om de 2D klasgemiddelden te berekenen.
      OPMERKING: Deze stap is computationeel veeleisend en de looptijd neemt aanzienlijk toe met het aantal deeltjes en klassen, evenals de doelradius en beeldgrootte. Op een cluster met 96 processen is de 2D-classificatie van ~ 10.000 deeltjes na ongeveer 90 minuten afgerond.
  2. Weergeven en visueel inspecteren van de resulterende ISAC 2D gemiddelden om ervoor te zorgen dat hun kwaliteit bevredigend is (zie discussie).
    1. Druk op de knop "Display Data" onder "UTILITIES". Stel "Input files "door het bestand te selecteren dat de ISAC 2D gemiddelden bevat (class_averages.hdf geproduceerd in stap 5.1). Druk op de knop" Run command "om de definitieve reproduceerbare en gevalideerde klassengemiddelden weer te geven die door ISAC worden geleverd.
  3. Maak een nieuwe stapel met alleen de deeltjesleden van de gevalideerde klassengemiddelden.
    1. Druk op de "Create Stack Subset" knop. Stel 'Input image stack' in door hetzelfde stack bestand te selecteren als in stap 5.1.1. Stel 'ISAC gemiddelden' in door de ISAC 2D gemiddelden (class_averages.hdf geproduceerd in stap 5.1) te selecteren. Specificeer het pad voor "Output directory". Druk op de knop "Uitvoeren commando".

6. VIPER: Bereken een eerste 3D-model

  1. Selecteer een klein aantal klassengemiddelden (≥ 100 beelden) door alle slechte klassengemiddelden en identieke weergaven van het deeltje te verwijderen (zie Discussie) en gebruik ze om een ​​repRoducible initial model met behulp van VIPER. Vergeet niet dat de selectie minstens 60-80 hoogwaardige gemiddelden bevat met ~ 200-500 leden elk.
    1. Klik op het "VIPER" icoon en vervolgens op de "Display Data" knop. Stel "Input files" in door de ISAC 2D gemiddelden (class_averages.hdf geproduceerd in stap 5.1) te selecteren. Druk op de knop "Uitvoeren commando".
    2. Druk ergens op de middelste knop van de muis in het grafische venster van het e2display en activeer de "DEL" knop in het pop-upvenster. Verwijder alle slechte klasgemiddelden en identieke weergaven van het deeltje (zie discussie ). Druk op de knop "Opslaan" om de overige 2D-klasgemiddelden op te slaan in een nieuw bestand.
  2. Van de geselecteerde ISAC gemiddelden, genereer een eerste referentie voor de volgende 3D-verfijning.
    1. Klik op de knop "Initial 3D Model - RVIPER". Stel "Input images stack" in door de gescande klasse te selecterenGemiddelden (geproduceerd in stap 6.1). Specificeer het pad voor "Output directory".
    2. Zorg ervoor dat u dezelfde waarde voor "Doel deeltjesradius" gebruikt als ISAC stap 5.1.3. Druk op de knop "Run command" om een ​​reproduceerbaar ab initio 3D-model te genereren.
      OPMERKING: Deze stap is computationeel veeleisend en de looptijd neemt significant toe met het aantal gemiddelden en de grootte van de deeltjes. Op een cluster met 96 processen is deze baan (~ 100 klasgemiddelden) afgerond na ~ 15 min.
  3. Controleer of het resulterende 3D-model redelijk is met inachtneming van de klassengemiddelden en bovendien de structurele integriteit ( dwz geen losgekoppelde onderdelen en / of richtingartifacten). Gebruik het programma Chimera 15 om de kaart weer te geven. Voer op dit punt een eerste vergelijking uit met een kristalstructuur van een homologe eiwit of een domein van het geïnde eiwit als het bestaat (een voorbeeld wordt weergegeven in het gedeelte RepreseNtatieve resultaten).
  4. Voor de daaropvolgende 3D-verfijning, genereer een initiële 3D-referentie en een 3D-masker van een ab initio 3D-model door het omliggende geluid te verwijderen en opnieuw te coderen om de oorspronkelijke pixelgrootte overeen te stemmen.
    1. Klik op de knop '3D-referentie maken'. Stel 'Invoervolume' in door het ab initio 3D-model te selecteren (average_volume.hdf geproduceerd in stap 6.2). Specificeer het pad voor "Output directory".
    2. Stel 'Resample Ratio Source' in door het ISAC-krimpverhouding-bestand te selecteren (README_shrink_ratio.txt geproduceerd in stap 5.1). Druk op de knop "Uitvoeren commando".

7. MERIDIEN: verfijn het oorspronkelijke 3D-volume

  1. Verfijn het 3D-volume vanaf het oorspronkelijke 3D-model.
    1. Klik op het "MERIDIEN" icoon, dan de knop "3D Refinement". Stel "Input image stack" en "Initial 3D reference" door seleCting de deeltjesstapel en het ab initio 3D-model (geproduceerd in respectievelijk stap 5.3 en 6.4). Specificeer het pad voor "Output directory".
    2. Stel 3D-masker in door het 3D-maskerbestand te selecteren (geproduceerd in stap 6.4). Gebruik altijd een 3D-masker, maar vooral in een vroeg stadium van analyse, gebruik een sferisch masker of een zachtrandig masker dat losgemaakt is op de verwijzing, om te voorkomen dat het voorspellen van onjuiste maskering wordt aangebracht.
    3. Controleer het selectievakje 'Zend hard 2D masker aan'. Stel 'Startresolutie' in op een cutoff frequentiewaarde tussen 20 - 25 Å. Houd er rekening mee dat een low-pass filter met deze cutoff frequentie wordt toegepast op de initiële 3D-structuur om de initiële bias te verminderen.
    4. Controleer de specificaties van cluster die gebruikt worden voor dit proces en stel vervolgens "Geheugen per node" in op het beschikbare geheugen in gigabyte. Druk op de knop "Uitvoeren commando" om het 3D-volume op een volledig geautomatiseerde manier te beginnen vanaf het oorspronkelijke 3D-model.
      OPMERKING: Deze procedure verdeelt de dataset in twee helften, verdeelt de twee modellen zelfstandig en levert twee rauwe volumes uit, elk uit slechts de helft van de deeltjes. Het is computationeel veeleisend en de looptijd neemt aanzienlijk toe met het aantal deeltjes. Op deze cluster eindigde de meridiaanverfijning na ~ 2,5 uur op 192 processen (~ 8.000 deeltjes, 352 doosgrootte).
  2. Maak een zacht randig 3D-masker van het geraffineerde volume voor de volgende scherpstap.
    1. Klik op de knop "Adaptive 3D Mask". Stel "Invoervolume" in door een van de ongefilterde halfvolumes te selecteren (geproduceerd in stap 7.1). Specificeer het pad voor "Output mask".
    2. Stel een waarde in van "Binarisatie drempel". Gebruik Chimera om ervoor te zorgen dat bij dit specifieke drempel het geluid duidelijk buiten het belang van het oplosmiddelgebied van de ongefilterde halfkaarten ligt en alle dichtheden van het eiwit nog steeds cVerward aan elkaar. Druk op de knop "Run commando" om het soft-edge 3D-masker te maken.
      OPMERKING: Het hoofdlichaam van het resulterende masker (bestaande uit voxels met een waarde van> 0,5) dient de deeltjesstructuur stevig aan te passen, maar sluit nog steeds alle dichtheden van belang. De zachte randafval moet minstens 8-10 pixels breed zijn.
  3. Voeg de twee ongefilterde halfvolumes samen die verkregen worden door de 3D-verfijning. Vervolgens scherp het samengevoegde volume door het stroomspektrum aan te passen op basis van de modulatie-overdrachtsfunctie (MTF) van de detector, de geschatte B-factor en de FSC (Fourier Shell Correlation) schatting van de resolutie.
    1. Selecteer de knop "Sharpening". Stel "Eerste ongefilterde halfvolume" en "Tweede ongefilterde halfvolume" in door de bijbehorende bestanden (vol_0_unfil.hdf en vol_1_unfil.hdf in stap 7.1) te selecteren. Gebruik altijd "B-factor enhancement". Typ gewoon de standaardwaarde om e te kunnen makenSchat de B-factor waarde van de invoer dataset met behulp van het bereik tussen de eindresolutie frequentie en 10 Å. U kunt ook een ad-hoc waarde opgeven ( bijv. -100).
    2. Houd de standaardwaarde voor "Low-pass filter frequentie" om een ​​FSC-gebaseerd filter toe te passen.
    3. Stel 'Gebruiker-voorzien masker' in door het 3D-masker te selecteren (geproduceerd in stap 7.2). Onthoud dat de gerapporteerde resolutie wordt bepaald met behulp van FSC met dit masker. Druk op de knop "Run command" om het geraffineerde 3D volume te scherpen.
  4. Genereer de 3D-hoekverdelingskaart vanuit de projectieaanwijzingen van alle deeltjes die worden geraamd door de 3D-verfijningstap hierboven.
    1. Klik op de knop hoekverdeling. Stel 'Parameterbestand uitlijnen' in door het bestand te selecteren (final_params.txt geproduceerd in stap 7.1) en druk op de knop 'Uitvoeren opdracht'.
  5. Controleer het scherpe 3D-model visueel met behulp van Chimera. Zorg ervoor dat de structuur redelijk is gezien de opgeloste resolutie (zie discussie ).
  6. Controleer de hoekverdeling visueel met behulp van Chimera. Controleer of de distributie ongeveer gelijkmatig de gehele 3D-hoekruimte beslaat. Houd er rekening mee dat, voor symmetrische structuren, de verdeling binnen de unieke asymmetrische driehoek beperkt is.

8. SORT3D: Sorteer 3D Heterogeniteit door te richten op de sterk veranderlijke regio's

  1. Bereken de 3D-veranderlijkheidskaart uit de deeltjesstapel die wordt gebruikt in de 3D-verfijning.
    1. Klik op "SORT3D" icoon en dan op "3D Variability Estimation" knop. Stel 'Input image stack' in door de zelfde gescreende partikelstapel te selecteren die is gegeven aan de 3D-verfijningstap 7.1.1. Specificeer het pad voor "Output directory".
    2. Houd de standaardwaarde voor "Aantal projecties".
      OPMERKING: De beelden van de hoekige buurmanCapuchon wordt gebruikt om de 2D-variantie op elke 3D-projectiehoek te schatten. Hoe groter het aantal, hoe minder luidruchtig de schatting, maar hoe lager de resolutie en rotatie artefacten zijn meer uitgesproken.
    3. Controleer het selectievakje 'Gebruik CTF'. Druk op de knop "Uitvoeren commando".
  2. Gebruik de 3D-veranderlijkheidskaart om een ​​focusmasker voor de 3D-clusteringstap hieronder te maken.
    1. Selecteer de knop "Binary 3D Mask". Stel 'Invoervolume' in door de 3D-variabiliteitskaart te selecteren (geproduceerd in stap 8.1). Specificeer het bestandspad voor "Output mask".
    2. Stel "Binarisatie drempel" in door gebruik te maken van de uitvoer van het veld "Level" in de "Volume Viewer" van Chimera. Druk op de knop "Uitvoeren commando".
  3. Sorteer deeltjesbeelden in homogene structurele groepen door te richten op structureel sterk veranderlijke gebieden.
    1. Druk op de knop "3D clustering - RSORT3D".Stel 'Input 3D-verfijning directory' in door de output directory van de 3D-verfijning te selecteren (geproduceerd in stap 7.1). Specificeer het pad voor "Output directory".
    2. Stel '3D-masker' in door het zachte randje 3D-masker te selecteren (geproduceerd in stap 7.2). Stel 'Focus 3D masker' in door de binariseerde 3D-variabiliteitskaart te selecteren (geproduceerd in stap 8.2).
    3. Voor grote datasets gebruik je minimaal 5.000-10.000 voor "Afbeeldingen per groep". Houd er rekening mee dat het programma altijd het aantal beelden per groep lager houdt dan deze instelling. Pas de waarde aan door het verwachte aantal 3D-groepen te overwegen (het totale aantal deeltjes gedeeld door de waarde 'Afbeeldingen per groep'), de dataset, de SNR en de mate van heterogeniteit. Begin met ~ 5-10 initiële 3D-groepen, als er voldoende deeltjes beschikbaar zijn, tenzij een hoger aantal verschillende structurele toestanden in de dataset verwacht wordt.
    4. Gebruik ten minste 3.000-5.000 deeltjes voor "Kleinste groepsgrootte".Houd er rekening mee dat in het programma groepen die een lager aantal beelden bevatten dan de instelling van "Kleinste groepsgrootte" negeren. Druk op de knop "Run command" om de 3D clustering uit te voeren.
      OPMERKING: RSORT3D is onderverdeeld in twee stappen. De eerste "sort3d" -stap geeft 3D heterogeniteit weer. Vervolgens reconstrueert het de volumes van elke homogene structurele groep met behulp van de 3D-uitlijnparameters bepaald door de 3D-verfijningstap hierboven. De tweede stap 'rsort3d' ontdekt reproduceerbare leden van elke groep door een tweerichtingsvergelijking van de twee onafhankelijke sorteerroutes uit te voeren. Dan reconstrueert het homogene structuren met alleen de reproduceerbare toegewezen deeltjes. Op een cluster met 96 kernen is deze baan (ongeveer 8.000 deeltjes, 352 doosgrootte) na ongeveer 3 uur afgerond.
  4. Nadat het programma is afgerond, gebruik Chimera om een ​​homogene 3D-groep te selecteren. Selecteer de structuur van de hoogste schijnbare resolutie, meestal geassocieerd met de meeste poPulous groep. Zorg ervoor dat de geselecteerde structuur visueel redelijk is, rekening houdend met de 2D-klasgemiddelden en biologische aspecten van het geïnde eiwit (zie discussie ). Als er andere volumes zijn die vrijwel identiek zijn aan een soortgelijke resolutie, beschouw ze als uit een enkele homogene 3D-groep.
  5. Doe een lokale verfijning tegen de deeltjesleden van de meest homogene 3D-groep (met de hoogste resolutie).
    1. Klik op de knop "Local Subset Refinement". Stel 'Subset text file path' in door het tekstbestand met de partikel ID's van de geselecteerde groep te selecteren (bijvoorbeeld Cluster0.txt geproduceerd in stap 8.3). Stel '3D-verfijning directory' in door de uitvoer directory van de vorige 3D-verfijning te selecteren (geproduceerd in stap 7.1).
    2. Stel 'Herstarten herhaling' in op die waar de hoogste resolutie is bereikt in de vorige 3D-verfijning. druk de"Run command" knop om een ​​lokale verfijning van de geselecteerde populatie deeltjes uit te voeren.
  6. Net als bij stap 7.2, creëer u een zacht randig 3D-masker uit een ongefilterd eindvolume dat gereconstrueerd wordt door de lokale subsetverfijning.
  7. Vergelijk met stap 7.3, voeg twee ongefilterde uiteindelijke halfvolumes samen die afgeleid zijn door de lokale subsetverfijning en versnelt het samengevoegde volume. Doe echter niet het scherp volume van deze keer.
    OPMERKING: Indien de heterogeniteitsanalyse in stap 8.4 verschillende afzonderlijke staten op vergelijkbare resolutie aangeeft, kan men alle verschillende staten zelfstandig verfijnen.

9. LOCALRES: Schat de lokale resolutie van het definitieve 3D-volume aan

  1. Schat de lokale resolutie van het 3D-volume dat is verkregen uit de homogene set deeltjes.
    1. Klik op het "LOCALRES" icoon en vervolgens op de knop "Local Resolution". Stel 'Eerste halfvolume' en 'Tweede helft' in-volume "door de ongefilterde uiteindelijke halve volumes van de lokale subset-verfijning te selecteren (geproduceerd in stap 8.5). Stel 3D-masker in door het soft-edged 3D-masker te selecteren dat is geproduceerd in stap 8.6. Geef het bestandspad voor" Output volume " .
    2. Houd de standaardwaarde van 7 pixels voor "FSC-venstergrootte". Onthoud dat deze instelling de grootte van het venster bepaalt waar de lokale-echte-ruimte correlatie wordt berekend; Grotere venstergroottes produceren gladdere resolutie kaarten ten koste van lokale oplossbaarheid.
    3. Houd de standaardwaarde 0,5 van "Resolutie afsnijden" voor resolutie criterium.
      OPMERKING: Voor elke voxel rapporteert het programma de lokale resolutie als de frequentie waarmee de lokale FSC onder de gekozen resolutie drempel druppelt. Een drempel lager dan 0,5 wordt niet aanbevolen, omdat de lagere correlatiewaarden een hoge statistische onzekerheid hebben. Daarom zal de bijbehorende lokale resolutie sterk variëren tussen voxels.
    4. Voor "OveraLl resolutie ", stel de absolute resolutie in geschat na de lokale subset verfijning (stap 8.7). Druk op de knop" Run command "om de lokale resolutie van het volume te berekenen.
  2. Breng het 3D-lokale filter aan op het volume dat is gehaald na de lokale subsetverfijning door gebruik te maken van de 3D-lokale resolutiekaart.
    1. Klik op de knop "3D Local Filter". Stel 'Invoervolume' in door het scherp maar ongefilterd 3D volume te selecteren (geproduceerd in stap 8.7). Stel ook "Lokaal resolutiebestand" en "3D-masker" in (respectievelijk in stap 9.1 en 8.6). Onthoud dat het 3D-masker de regio bepaalt waar de lokale filtering wordt toegepast. Specificeer het bestandspad voor "Output volume". Druk op de knop "Run command" om het 3D lokale filter aan te passen.
  3. Gebruik Chimera om het definitieve 3D-model en de 3D-locale resolutie kaart visueel te inspecteren (geproduceerd in stap 9,2 en 9,1 resp.ectief). Selecteer de optie 'Oppervlakkleur' ​​om het 3D-volume te kleuren volgens de lokale resolutie. Houd er rekening mee dat de verdeling van de lokale resolutie glad moet zijn (zie discussie ).

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hierboven beschreven protocol werd uitgevoerd vanaf 112 directe detectorfilms van de A-component van het Photorhabdus luminescens Tc complex (TcdA1) 20 , 21 , 22 . Deze dataset werd opgenomen op een Cs-gecorrigeerde elektronencryo-microscoop met een XFEG-veld met hoge lichtsterkte, bediend met een versnellingspanning van 300 kV. De beelden werden automatisch verkregen met een totale dosis van 60 e - / Å -2 bij een pixelgrootte van 1,14 Å op de monsterschaal. Na de uitlijning van de filmkaders ( Protocol Stap 2 ), hadden de resulterende bewegingsgerichte gemiddelden isotrope Thon-ringen die zich uitstrekken tot hoge resolutie ( Figuur 2a ). De afzonderlijke deeltjes waren gemakkelijk zichtbaar en goed gescheiden ( figuur 2b ). Partikels werden vervolgens geplukt met behulp van het zwermgereedschap van e2boxerLass = "xref"> 18 ( Protocol Stap 4.1 ). In dit geval werd een passende drempel ingesteld met behulp van de meer selectieve optie ( figuur 2c ). De 112 digitale micrografen leverden 9.652 deeltjes op. De meerderheid van de geëxtraheerde beelden ( Protocol Stap 4.2 ) bevatten goed gedefinieerde deeltjes en hun doosgrootte was ~ 1,5 keer groter dan de deeltjesgrootte, zoals aanbevolen ( Figuur 2d ). Vervolgens werd met behulp van ISAC een 2D heterogeniteitsanalyse uitgevoerd ( Protocol Stap 5 ). Het leverde 98 klassengemiddelden op ( figuur 3a ). Met behulp van deze 2D-klassengemiddelden werd een ab initio- model berekend met behulp van VIPER ( Protocol Stap 6 ) bij intermediaire resolutie ( Figuur 3b ). Dit model laat een uitstekende overeenkomst zien met de kristalstructuur van TcdA1 die eerder is opgelost bij 3.9 Å resolutie 22 ( Figuur 3c ). Dit ab initio model werd gebruikt als initiële tem Plaat voor de 3D-verfijning (MERIDIEN), waardoor een reconstructie van 3,5 Å (0,143 criterium) ( Protocol Stap 7 ) van slechts ~ 40.000 asymmetrische eenheden ( Figuur 4 ) wordt verkregen. Deze kaart met bijna atoomresolutie is binnen 24 uur verkregen, met gebruik van maximaal 96 CPU's voor de stappen van de workflow die profiteren van meerdere kernen.

Voor de 3D-variabiliteitsanalyse ( protocolstap 8) werden alleen 2.000 deeltjesbeelden per groep gebruikt in stap 8.3.3 ( dwz het proces begint met 5 initiële 3D-groepen) en 200 afbeeldingen voor de kleinste groepsgrootte in stap 8.3.4 vanwege Het kleine aantal deeltjes (~ 10.000). Uit de analyse bleek gelokaliseerde flexibiliteit voornamelijk in het N-terminale gebied van het complex dat de His-tag bevat die gebruikt werd voor zuivering ( Figuur 5a ). In feite werden twaalf N-terminale resten en de His-tag niet opgelost in de eerder gepubliceerde kristalstructuur van TcdA1"> 22 en dit meest waarschijnlijke versteurde gebied bleef onopgelost in de huidige cryo-EM dichtheid, waarschijnlijk door de flexibiliteit ervan. Aanvullende variabiliteit werd gedetecteerd bij de receptor-bindende domeinen en het BC-bindende domein ( Figuur 5a ). Bevredigende resolutie van de structuur en de vrij kleine omvang van de dataset, werd deze heterogeniteit besloten tolerant te zijn en daarom werd geen gefocuste 3D classificatie 23 uitgevoerd. Ten slotte werd de lokale resolutie van de einddichtheidskaart berekend ( protocol stap 9.1, figuur 5b ) en de gespleten 3D-kaart werd lokaal gefilterd ( protocol stap 9.2) . Een volume van deze kwaliteit kan gebruikt worden voor de novo modelbouw met behulp van Coot 24 of een ander verfijningsinstrument ( Figuur 6 ).

figure-results-1
Afbeelding 1: Beeldverwerking met SPHIRE. (A) De GUI van het SPHIRE softwarepakket. Een specifieke stap van de workflow kan geactiveerd worden door het respectievelijke pictogram aan de linkerkant van de GUI te selecteren ("workflow step"). De commando's en hulpprogramma's die geassocieerd worden met deze stap van de workflow worden weergegeven in het centrale gedeelte van de GUI. Nadat u een van de commando's hebt geselecteerd, worden de respectieve parameters in het rechter gedeelte van de GUI weergegeven. Geavanceerde parameters vereisen gewoonlijk geen wijziging van de standaardinstellingen. ( B ) Stadiums in de workflow van single particle image processing met behulp van de SPHIRE GUI. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Motion Correction and ParticLe extractie. (A, b ) Typische hoogwaardige, lage dosis, gedreven gecorrigeerde digitale micrograaf opgenomen bij een defocus van 1,7 μm. Let op dat de isotrope Thon-ringen zich uitbreiden tot een resolutie van 2,7 Å in het stroomspektrum (a) en de goed waarneembare deeltjes in het 2D-beeld ( b ). ( C ) Partikel selectie met behulp van e2boxer. Groene cirkels geven aan geselecteerde deeltjes aan. ( D ) Typische ruwe deeltjes geëxtraheerd uit de dosisgewogen micrograaf. Schaalstaven = 20 nm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: 2D Clustering en Initiële Model Generatie. (A) Galerij van 2D-klasgemiddelden, met meerderheid van zijaanzichten o F het deeltje Schaalbalk = 20 nm. ( B ) Ab initio 3D-kaart van TcdA1 verkregen met RVIPER uit de referentievrije klassengemiddelden. ( C ) Vaste lichaamspas van de TcdA1 kristalstructuur (linten) (pdb-id 1VW1) in de initiële cryo-EM-dichtheid (transparant grijs). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Cryo-EM 3D Structuur van TcdA1. (A, b ) Definitieve 3,5 A dichtheidskaart van TcdA1 berekend met gebruik van ~ 9.500 deeltjesafbeeldingen: ( a ) zij- en ( b ) bovenaanzicht. ( C ) Representatieve gebieden van de cryo-EM dichtheid voor een a-helix en een β-vel.Arge.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

figure-results-5
Figuur 5: Variabiliteitsanalyse en Lokale Resolutie. (A) Oppervlakte van de geslepen TcdA1 cryo-EM kaart (grijs) en de variabiliteitskaart (groen). Voor betere duidelijkheid werd de variabiliteitskaart laagdoorlaat gefilterd naar 30 Å. ( B ) Oppervlakteweergave van de TcdA1 scherpe Cryo-EM kaart gekleurd volgens de lokale resolutie (Å). Let op de topologische overeenkomst tussen gebieden met hoge variabiliteit en lage lokale resolutie. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: 3D ModEl Gebouw van TcdA1 met behulp van Coot. Representatieve gebieden van de cryo-EM-dichtheid en het atoommodel worden getoond voor een a-helix. Het atoommodel werd gebouwd de novo met behulp van Coot. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enkele deeltjescryo-EM heeft in de afgelopen jaren een snelle ontwikkeling getoond en leverde talrijke atoomresolutiestructuren van macromoleculaire complexen van grote biologische betekenis 25 op . Om het grote aantal beginnende gebruikers te ondersteunen die momenteel binnenkomen, ontwikkelden we het single-particle image- analyseplatform SPHIRE en presenteerde we hier een doorloopprotocol voor de gehele workflow inclusief filmuitlijning, deeltjespikken, CTF-schatting, eerste model Berekening, 2D en 3D heterogeniteitsanalyse, hoge resolutie 3D-verfijning en lokale resolutie schatting en filtering.

Het hier beschreven protocol is bedoeld als een korte gids voor het bepalen van de 3D-structuur met behulp van cryo-EM micrographs van het geïnde eiwit en met behulp van computergereedschap die door de stand-alone GUI van SPHIRE wordt geleverd.

Het belangrijkste kenmerk van de workflow is dat het meestVan de procedures moeten slechts één keer worden uitgevoerd, aangezien zij vertrouwen op het concept van validatie door reproduceerbaarheid 19 en geen parameter tweaking nodig hebben. Dit automatische validatiemechanisme is een voornaamste voordeel van SPHIRE over andere softwarepakketten, aangezien de resultaten zowel objectief als reproduceerbaar zijn, en vooral belangrijk zijn tegen aanvaardbare computerkosten. De pijpleiding biedt bovendien een schat aan diagnostische informatie voor ervaren gebruikers om zelfstandige validatie en beoordeling met eigen methoden te voeren. Desalniettemin moet een beginnende gebruiker die tenminste elementaire theoretische achtergrond heeft in structurele biologie en elektronenmicroscopie, in staat zijn om near-atomic resolution structuren te verkrijgen door gebruik te maken van eigen data en de geautomatiseerde validatieprocedures.

Het verkrijgen van een near-atomische resolutie structuur is echter niet altijd eenvoudig en het resultaat zal sterk afhangen van de kwaliteit van het monster en de invoer dieeen. Voor de hier geplaatste procedures wordt ervan uitgegaan dat er voldoende voldoende ongewijzigde ruwe EM-films van hoge kwaliteit beschikbaar zijn, waarbij hun gemiddelden duidelijk duidelijke homogene en willekeurig georiënteerde enkele deeltjes aantonen. In het algemeen zijn er geen beperkingen met betrekking tot symmetrie, grootte of algemene vorm van het molecuul, maar een laag molecuulgewicht kan een beperkende factor zijn, vooral wanneer het eiwit een featurloze bolvormige vorm heeft. Meestal is analyseren van grotere, goed bestelde deeltjes met hoge punt-groepssymmetrie minder veeleisend. Daarom is het sterk aan te bevelen voor beginnende gebruikers om het huidige protocol eerst te runnen met een goed gekenmerkt cryo-EM dataset. Ofwel de SPHIRE-studiegegevens (http: /sphire.mpg.de) of een van de EMPIAR-ingediende datasets (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) met rauwe films zijn een goed beginpunt .

Bij het verwerken van eigen gegevens is het zeer waarschijnlijk dat sommige datasets of sommige afbeeldingen niet aan bepaalde kwaliteiten zullen voldoenTy criteria. In aanvulling op de geautomatiseerde stabiliteits- en reproduceerbaarheidscontroles, uitgevoerd door het programma voor belangrijke stappen van de workflow, wordt het nog steeds aanbevolen voor gebruikers om de resultaten visueel te inspecteren bij bepaalde "checkpoints" van het protocol, vooral als de uiteindelijke reconstructie Is niet bevredigend.

De eerste visuele inspectie kan op het micrograafniveau worden uitgevoerd na de filmuitlijning ( protocol stap 2 ) en de CTF-schatting ( protocol stap 3 ). De resulterende bewegingsgerichte gemiddelden zouden duidelijk herkenbare en gescheiden afzonderlijke deeltjes moeten tonen en hun krachtspektra zouden duidelijk herkenbare, isotrope Thon-ringen moeten tonen. De ruimtelijke frequentie waarop ze zichtbaar zijn, definieert in de meeste gevallen de hoogste resolutie waaraan de structuur in principe uiteindelijk kan worden bepaald. Voorbeelden van een bewegingsgeregeld gemiddelde van voldoende kwaliteit en zijn vermogensspectrum worden weergegeven in de sectie & #34; Representatieve resultaten. "Outlier beelden die een negatief effect kunnen hebben op het eindresultaat, kunnen worden verwijderd met behulp van SPHIRE's Drift en CTF assessment GUI tools (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).

Met betrekking tot deeltjescreening is de cruciale stap in de SPHIRE-pijpleiding de 2D-classificatie met behulp van ISAC ( Protocol stap 5.2) . Hier dient de gebruiker te controleren dat de reproduceerbare 2D-klasgemiddelden automatisch door het programma worden geïdentificeerd, een reeks oriëntaties vaststellen die voldoende zijn om de hoekruimte gelijkmatig te bedekken. Als de kwaliteit van de klasgemiddelden niet bevredigend is (luidruchtige en / of wazige afbeeldingen) en / of het aantal reproduceerbare klassengemiddelden zeer laag is, overwegen om de automatische plukkwaliteit te verbeteren, datasetbeeldvorming of voorbeeldbereiding te optimaliseren. In de meeste gevallen is het niet mogelijk om een ​​betrouwbare reconstructie uit een dataset te berekenen die geen goede 2D-klasgemiddelden geeft. Voorbeelden van hoogwaardige 2D klasse aveWoedingen worden weergegeven in de sectie "Representatieve resultaten".

Tenminste 100 klassengemiddelden zijn vereist om een ​​betrouwbaar eerste 3D-model te verkrijgen met behulp van RVIPER op een geautomatiseerde manier ( Protocol stap 6.1 ). Voor deze stap moet de gebruiker de gemiddelden selecteren met de hoogste kwaliteit en zo veel mogelijk oriëntaties van het deeltje bevatten. De kwaliteit van het initiële model is cruciaal voor het succes van de daaropvolgende 3D-verfijning met hoge resolutie.

In andere softwarepakketten wordt soms een 3D-classificatie uitgevoerd om "slechte" deeltjes 8 , 9 te verwijderen. In SPHIRE worden de meeste van deze deeltjes echter automatisch verwijderd tijdens de 2D-classificatie met behulp van ISAC. Het wordt daarom aanbevolen om de computationeel intensieve stap van 3D-sortering alleen uit te voeren als de reconstructie en de 3D-variabiliteitsanalyse heterogeniteit van de dataset aanduiden.

Belangrijker nog, de gebruiker moet de resulterende 3D-volumes zorgvuldig altijd inspecteren ( Protocol stap 9.3 ) en bevestig dat de eigenschappen van de betreffende dichtheid goed overeenstemmen met de nominale resolutie. Bij een resolutie van <9 Å worden staafvormige dichtheden die overeenkomen met a-helices zichtbaar. Bij een resolutie <4,5 Å, zijn dichtheden die overeenkomen met strengen in β-bladen normaal gescheiden en worden omvangrijke aminozuren zichtbaar. Een kaart met hoge resolutie (<3 Å) zou duidelijk herkenbare zijketens moeten tonen, waardoor een nauwkeurig atoommodel kan worden gebouwd.

Tot op heden verkregen resultaten blijkt dat, met behulp van SPHIRE's geautomatiseerde reproduceerbaarheidstesten en minimale visuele inspecties, het onderhavige protocol algemeen toepasbaar is op elk type enkel-deeltjescryo-EM project. Representatieve resultaten van elke verwerkingsstap worden getoond voor de reconstructie van het TcdA1 toxine vanPhotorhabdus luminescens 21 , die is opgelost aan bijna atomaire resolutie. Dichtheidskaarten van vergelijkbare kwaliteit kunnen gebruikt worden om betrouwbare atoommodellen te ontwerpen door middel van de novo -ruggengraatopsporing, alsmede wederkerige of echte ruimteverfijning, en aldus een solide structurele kader voor het begrijpen van complexe moleculaire mechanismen.

ACCESSIE CODES:

De coördinaten voor de EM-structuur en de onbewerkte films zijn gedeponeerd in de Electron Microscopy Data Bank en het Electron Microscopy Pilot Image Archive onder toetredingsnummers EMD-3645 en EMPIAR-10089.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken D. Roderer voor het leveren van ons TcdA1 micrographs. We bedanken Steve Ludtke voor zijn lopende ondersteuning van EMAN2-infrastructuur. Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Max Planck Society (naar de SR) en de Europese Raad in het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (KP7 / 2007-2013) (subsidie ​​nr. 615984) (naar SR) en subsidie ​​van de nationale instituten van Gezondheid R01 GM60635 naar PAP).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SPHIREMax Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund  en Houston Medical School, Houston, Texas http://sphire.mpg.de
UCSF ChimeraUniversity of California, San Franciscohttp://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
UnblurJanelia Farm Research Campus, Ashburnhttp://grigoriefflab.janelia.org/unblur
CootMRC Laboratory of Molecular Biology,  Cambridgehttp://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
EMAN2Baylor College of Medicine, Houstonhttp://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Computing Cluster met 1824 coresMax Planck Institute of Molecular PhysiologyLinux Cluster met 76  nodes, elk met 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz en 128 Gb RAM
TITAN KRIOS elektronenmicroscoop FEI300 kV, Cs correctie, XFEG
Falcon II direct elektronendetectorFEI
EPU (geautomatiseerde gegevensverzameling software)FEIhttps://www.fei.com/software/epu/

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  2. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  3. Bai, X. -C., Yan, C., et al. An atomic structure of human γ-secretase. Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).
  4. Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution. Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).
  5. von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
  6. Tang, G., Peng, L., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  7. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  8. Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  9. Scheres, S. H. W. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  10. Shaikh, T. R., Gao, H., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  11. Hohn, M., Tang, G., et al. SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing. Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).
  12. Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  13. de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  14. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980(2015).
  15. Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  16. Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment. Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).
  17. Frank, J. Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , Oxford University Press. (2006).
  18. Woolford, D., Ericksson, G., et al. SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software. Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).
  19. Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images. Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).
  20. Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail. Nature Publishing Group. , (2016).
  21. Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins. Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).
  22. Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail. Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).
  23. Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation. Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).
  24. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  25. Callaway, E. The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology. Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Single Particle AnalysisElectron Cryo microscopySPHIRE Software3D RefinementCTF EstimationParticle PickingISAC 2D ClusteringVIPER Initial ModelMERIDIEN RefinementLocal Resolution Analysis

Gerelateerde artikelen