Methodenartikel

Kwantitatieve visualisatie van leukocytinfectiet in een muizenmodel van Fulminant-myocarditis door middel van lichte microscopie

DOI:

10.3791/55450

⸱

31 mei 2017

 ,  ,  , 
1Department of Translational Skin Cancer Research, University of Duisburg/Essen, 2Institute for Experimental Immunology and Imaging, University of Duisburg/Essen, 3Imaging Center Essen, Electron Microscopy Unit, University Hospital of Essen

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een microscopie-aanpak van lichte lakens om het cardiale CD45 + leukocyten infiltraat te visualiseren in een muizenmodel van aseptische fulminante myocarditis, die wordt geïnduceerd door de intratracheale difterie toxine behandeling van CD11c.DTR muizen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescentiemicroscopie (LSFM), in combinatie met chemische clearingprotocollen, is de gouden standaard geworden voor het analyseren van fluorescent gelabelde structuren in grote biologische proefpersonen, en is van toepassing op cellulaire resolutie. De constante verfijning van de onderliggende protocollen en de verbeterde beschikbaarheid van gespecialiseerde commerciële systemen maken ons in staat om de microstructuur van hele muisorganen te onderzoeken en zelfs de karakterisering van cellulaire gedrag in verschillende live-imaging benaderingen mogelijk te maken. Hier beschrijven we een protocol voor de ruimtelijke full-mount visualisatie en kwantificering van de CD45 + leukocytenpopulatie in ontstoken muisharten. De methode maakt gebruik van een transgene muisstam (CD11c.DTR) die recentelijk is aangetoond dat het een robuust, inducerend model is voor de studie van de ontwikkeling van fulminante fatale myocarditis, gekenmerkt door dodelijke hartritmestoornissen. Dit protocol omvat myocarditis inductie, intravitusAl antilichaamgemedieerde celkleuring, orgaanbereiding en LSFM met daaropvolgende computerondersteunde beeldbehandeling. Hoewel het voorgesteld is als een zeer aangepaste methode voor onze specifieke wetenschappelijke vraag, is het protocol de blauwdruk van een gemakkelijk verstelbaar systeem dat ook volledig andere fluorescerende structuren in andere organen en zelfs in andere soorten kan richten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tijdens de evolutie van lichtmicroscopie verschenen er vele gespecialiseerde vormen, allemaal ontwikkeld om beperkingen in het visualisatieproces voor bepaalde exemplaren te minimaliseren. Een dergelijke methode is fluorescentiemicroscopie (LSFM) met lichte lak. Vooropgesteld in 1903 door Siedentopf en Zsigmondy 1 en het vinden van zijn eerste fundamentele biologische toepassingen in de vroege jaren negentig 2 , is LSFM uitgegroeid tot het meest krachtige microscopische hulpmiddel tot op heden voor het visualiseren van grote specimens, zoals intacte muisorganen, met een fluorescentie signaalresolutie Naar het cellulaire niveau. Vanwege deze voordelen, in combinatie met het potentieel voor live-celbeelden, noemden Nature Methods LSFM de "Method of the Year 2014 3. "

Zoals de naam suggereert, wordt de steekproefverlichting in een LSFM uitgevoerd door lichte lakens, die loodrecht op de as van de gebruikte doel f zijn gerichtOf emissie-licht collectie en daaropvolgende beeldvorming. Het lichtvel wordt gewoonlijk gegenereerd door middel van brede, gecollimeerde laserbundels met een cilindrische lens of door de snelle zijwaartse beweging van smalle, gefocusseerde laserstralen in slechts één horizontaal of verticaal vlak 4 , 5 . Op deze manier wordt alleen het brandpunt van de beeldende optica verlicht, typisch met een dikte van 1-4 μm. Bijgevolg worden voor het in het verlichtingsvlak geplaatste fluorescerende monster zowel de opwekking van verstrooid licht als de effecten van fotobladen uit gebieden boven of onder het brandpuntsvlak geëlimineerd of sterk onderdrukt 6 , 7 . Aangezien alle out-of-focus vliegtuigen niet worden verlicht, worden fotoboekeffecten in deze gebieden weggelaten. In tegenstelling tot standaard confocal- of multi-fotonmicroscopie zijn de paden van verlicht en uitgestraald licht van elkaar gescheiden, zodat de uiteindelijke beeldkwaliteit Het is niet afhankelijk van de perfecte focus van de excitatie lichtbundel door de doelstellingen. Afhankelijk van de onderliggende vraag is het dus mogelijk om doelstellingen met een enorm gezichtsveld (FOV) te gebruiken, zodat het grootste mogelijk gebied van het verlichte vliegtuig kan worden afgebeeld zonder dat onderdelen in de xy-richting bewegen.

In moderne LSFM-systemen wordt een fluorescerend beeld van de gegenereerde optische sectie vastgelegd op een zeer gevoelige lading-gekoppelde apparaat (CCD) of complementaire metalen oxide-halfgeleider (CMOS) camera's die het gehele gezichtsveld (FOV) kunnen verwerven In microseconden. Door het monster door het lichtblad te verplaatsen en door het verkrijgen van afbeeldingen bij gedefinieerde z-stappen, is het dus mogelijk om de volledige 3D-informatie van een monster in een redelijke hoeveelheid tijd 8 , 9 te verkrijgen, waardoor deze techniek van toepassing is op levende cellen Studies 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .

Niettegenstaande, hoewel LSFM een snelle, gevoelige en fluorescentie-vriendelijke methode biedt, is lichtoverdracht door het monster nog steeds een belangrijk probleem, vooral wanneer grote biologische monsters het doel zijn voor een 3D-analyse. Lichte transmissie wordt kritisch aangepast door fysieke aspecten van absorptie en door licht verstrooiing bij interfaces van structuren met verschillende brekingsindexen 13 . Daarom, wanneer beeldvorming meerdere millimeters groot is, wordt LSFM meestal gecombineerd met clearingprotocollen om de monsters optisch transparant te maken. Deze technieken zijn gebaseerd op het idee om water uit het respectievelijke biologische weefsel te verwijderen en uit te wisselen met water- of (organisch) op oplosmiddel gebaseerde immersiemiddelen, die worden gekozen om de brekingsindexen van de specifieke doelweefselcomponenten nauwkeurig aan te passen. Als gevolg hiervan wordt laterale lichtverstrooiing geminimaliseerd, en alle golflengtenVan het licht kan veel efficiënter door het weefsel 13 passeren. In veel gevallen lijken biologische monsters op deze manier macroscopisch kristalhelder, waardoor LSFM kan worden uitgevoerd, zelfs op hele muisorganen, met behulp van lange werkafstand, lage vergrotingsdoelstellingen.

Hier presenteren we een voorbereidingsprotocol voor grootbeeldbeeldvorming in een lakvelmicroscoop (zie de tabel van materialen), die we hebben vastgesteld om het cellulaire hartinfarct te onderzoeken in een murine model van myocarditis 15 . CD11c.DTR muizen verdrijven de primaat difterie toxine receptor (DTR) onder de controle van de CD11c promotor 16 . Bijgevolg worden cellen in deze muizen die CD11c samen met de DTR uitdrukken gevoelig gemaakt voor het exotoxine van Corynebacterium difterie (difterietoxine, DTX); De systemische behandeling van deze dieren met DTX resulteert in een uitputting van alle CD11c + ceLLS. CD11c is een integrin en is als celoppervlakreceptor voor een verscheidenheid van verschillende oplosbare factoren betrokken bij activatie- en rijpingsprocessen, hoofdzakelijk in cellen van de monocytische lijn 17 . Bijgevolg is het CD11c.DTR muismodel intensief gebruikt om de rol van dendritische cellen en macrofaag subsets te bestuderen in het kader van vele verschillende immunologische vragen. Na verloop van tijd is gemeld dat CD11c.DTR-muizen die systemisch met DTX behandeld zijn, nadelige bijwerkingen kunnen ontwikkelen en sterk verhoogde sterftecijfers 18 , 19 kunnen weergeven. Onlangs konden we de onderliggende oorzaak van de dood identificeren 15 , waarin de ontwikkeling van fulminante myocarditis na de intratracheale DTX-toepassing in deze dieren werd beschreven. De toxine-uitdaging veroorzaakte cellulaire vernietiging, inclusief in de centrale delen van het stimulusoverdrachtssysteem in het hart. Dit ging gepaard met massale CD45+ Infiltratie van leukocyten, wat uiteindelijk leidt tot dodelijke hartritmestoornissen. In dit geval was niet alleen het uiterlijk van de leukocytenpopulatie belangrijk, maar ook de ruimtelijke verdeling in het hart. Deze experimentele vraag is een uitdaging voor moderne microscopische beeldvorming, die we hebben opgelost door middel van een microscopische aanpak van lichte lakens die wordt ondersteund door intravitale antilichamenverf en een optisch clearingprotocol op basis van organisch oplosmiddel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de EU-richtlijnen en werden goedgekeurd door de relevante lokale autoriteiten in Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Duitsland). De dieren werden gebruikt en gehuisvest onder specifieke pathogeenvrije (SPF) condities.

1. Inductie van Myocarditis door Difterie Toxine (DTX)

  1. Bereid de DTX oplossing voor de inductie van myocarditis door de DTX voorraadoplossing te verdunnen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een 1 μg / mL werkoplossing.
  2. Voeg 100 μl van deze oplossing intratracheaal toe (in 8 tot 10 weken oude CD11c.DTR muizen ( ongeveer 5 ng / g lichaamsgewicht (bw)), zoals blijkt uit Hasenberg et al. Voor het toepassen van een schimmelsporingsuspensie 20 .
    OPMERKING: De intraperitoneale toediening van het toxine kan leiden tot een soortgelijke inductie vanFatale myocarditis. Deze aanpak zou echter eerst moeten worden gevalideerd.
    1. Voor de toepassing anesthetiseren de dieren door een intraperitoneale (ip) injectie van 100 mg / kg bw ketamine en 10 mg / kg lichaamsgewicht xylazine.
    2. Na het bereiken van diepe narcose (toonknijptest), intubeer de dieren door gebruik te maken van een 22 G inwendige veneuze katheter door de mondholte. Controleer de juiste positionering van de lensbuis door de dieren te ventileren met een ademhaling van kleine dieren met een snelheid van 250 ademhalingen per minuut en een inademingsvolume van 250 μL per adem, ook getoond door Hasenberg et. al. 20 .
      OPMERKING: Bij correct positionering verandert de ademsnelheid van de dieren volgens de toegepaste ventilatie instellingen.
    3. Ontkoppel het ventilatiesysteem en installeer de 100 μL DTX oplossing of een gelijke hoeveelheid PBS als een controle door de katheter in de long en blijf de dieren nog 1 minuut minder ventileren.
  3. Laat de dieren herstellen van de verdoving en monitor de algemene gezondheidsstatus en lichaamsgewichtverandering gedurende 4 dagen.
    OPMERKING: Afhankelijk van de genetische achtergrond, de muisstamme of het begingewicht, kan de ernst en de aanvang van myocarditis variëren en moet eerst worden bepaald.

2. Voorbeeldvoorbereiding voor lichtevelmicroscopie

  1. 4 dagen na toxine applicatie verdoving de muizen door een inductie kamer te spoelen met een verdampte 2% isofluraan / zuurstof mengsel. Injecteer 15 μg van een direct gemerkt anti-CD45-antilichaam (clone 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) in 50 μl PBS intraveneus (iv) met behulp van de retro-orbitale toedieningsroute, die een zeer snelle en zeer nauwkeurige toepassing van de Juiste hoeveelheid antilichaam.
    OPMERKING: De gewenste diepte van narcose is bereikt wanneer de muizen liggend zijn en reageren niet op het toetsen van de nippen.
  2. Na 2 uur incubatie, offer de muizen door cervicale dislocatie anD de harten in situ perfuseren met 5 ml PBS / EDTA (5 mM).
    1. Ontsteek het hart en injecteer de perfusieoplossing in de rechter ventrikel met behulp van een 21 G katheter. Perfuse met langzame, constante druk en zorg ervoor dat het bloed kan worden gedreineerd na het openen van de aorta.
      OPMERKING: Deze transcardiale perfusie kan resulteren in kleine voorbereidingsartifacten, die de uiteindelijke 3D visualisatie van het orgaan kunnen storen. Daarom kunnen geavanceerde dierproeven de perfusie uitvoeren door middel van de inferieure vena cava, waarbij de abdominale aorta wordt uitgesneden.
  3. Voor chemische fixatie, vul het hart door dezelfde uitsparing met 5 ml 4% paraformaldehyde (PFA). Houd de katheter op zijn plaats en koppel gewoon een nieuwe spuit die met PFA is gevuld. Perfuse met langzame en constante druk.
    OPMERKING: Paraformaldehydeis zeer giftig; Vermijd contact met de huid, ogen en andere slijmvliezen.
    1. Pak het hart voorzichtig met getande tang; puLicht het een beetje naar boven; En snijd alle weefselverbindingen, inclusief de inkomende en uitgaande slagaders en aderen. Bewaar het orgaan nog eens 4 uur in 4% PFA voor verdere fixatie.
  4. Om het orgaan te dehydreren, incubeer het hart in een stijgende ethanol serie bij 50%, 70% en tweemaal bij 100%, elk voor 12 uur, bij 4 ° C in het donker. Gebruik hier zwarte 5 ml polypropyleen reactiebuizen, zodat ze constant in een buisrotor draaien, met behulp van een vertragingssnelheid om de luchtbellenvorming te voorkomen.
  5. Volledige monstervoorbereiding door chemische clearing. Om de harten transparant te maken, incubeer ze in 98% dibenzylether (DBE) terwijl u de nacht constant draait.
    OPMERKING: DBE is irriterend voor de ogen, de huid en het ademhalingsstelsel.

3. Licht-microscopie

  1. Voer LSFM uit met behulp van de lakmicroscoop (zie de tabel van materialen). Plaats het monster op de standaard monsterhouder van de microscoop in de DBE-gevulde cuVette, die geschikt is voor specimens tot 30 mm x 30 mm x 15 mm.
  2. Houd het monster stevig vast tijdens de opname door gebruik te maken van gedroogde en verwijderde agarose blokken.
    1. Voor het bereiden van de agarose blokken, giet 2% gesmolten agarose in een mal (15 mm x 15 mm x 5 mm). Laat de agarose afkoelen tot het stevig is.
    2. Dehydrateer het in een stijgende ethanol serie (50%, 70% en tweemaal bij 100%). Incubeer de agarose blokken in de nacht in 98% DBE. Bewaar de agarose in DBE totdat het wordt gebruikt.
      OPMERKING: Aangezien de agarose hoofdzakelijk uit water bestaat, kunnen de incubatietijden voor elke dehydratietrap worden verlengd, afhankelijk van de grootte van het blok.
      OPMERKING: DBE is irriterend voor de ogen, de huid en de ademhalingswegen.
    3. Wanneer nodig, snijd het bereid agarose blok naar de gewenste vorm met een scherpe scalpel. Typisch gesneden prisma- of wigvormige vormen om aan de randen van de monsteradapter te plaatsen.
      OPMERKING: Aangezien de agarose blokken elastisch zijn,Het monster blijft op zijn plaats wanneer hij met weinig kracht wordt geduwd.
  3. Ontdek de fluorescentiesignalen van belang (hier, autofluorescentie en anti-CD45-antilichamenvervuiling) met de juiste instellingen voor excitatie- en emissiefilter.
    1. Voor de detectie van het verbindingsweefsel afgeleid autofluorescentie signaal, gebruik een 525/50 nm bandpas filter bij een excitatie golflengte van 488 nm (OPSL: 50 mW); CD45-kleuring met een AF647-gekoppeld antilichaam wordt gedetecteerd bij 668 nm (bandpasfilter: 680/30 nm) en bij een excitatiegolflengte van 647 nm (diode laser: 50 mW).
    2. Kies 4 μm als de afstand tussen de twee individuele z-vlakken.

4. Image Post-processing

OPMERKING: De verkregen digitale beeldgegevens werden verder verwerkt met een wetenschappelijke 3D / 4D beeldverwerkings- en analysesoftware (zie de tabel van materialen).

  1. Openen en vooraf aanpassen van de gegevensbestanden.
    1. Nadat u de analysesoftware hebt gestart, selecteert u de knop "Overslaan" in de linkerbovenhoek. Om de beeldstapels te openen, kies 'Bestand', 'Open' en selecteer een map die de gegevens bevat van het eerste verworven kanaal. Kies 'Bewerken' en 'Kanalen toevoegen' om verdere verworven kanalen toe te voegen.
      OPMERKING: Afhankelijk van de gegevensgrootte en het computersysteem kan dit proces enkele minuten duren. Het gepresenteerde protocol toont alle stappen voor 2 acquisitiekanalen (autofluorescentie en AF647).
    2. Corrigeer de dimensies x, y en z voxel door op "Bewerken" te klikken en "Beeldeigenschappen" te selecteren. Wanneer het nieuwe venster opent, past u de parameters aan.
      OPMERKING: Deze stap hangt af van het werkende microscoopsysteem en het specifieke dataformaat. Correcte xyz-waarden zijn cruciaal voor latere afmetingen en afmetingen. In de meeste gevallen worden deze parameters opgeslagen als meta data in de micrograph bestanden. Echter, als het bestand foRmat kan niet door de analysesoftware correct geïnterpreteerd worden, het is belangrijk om de pixelgrootte handmatig in te voeren. De pixelgrootte in de x- en y-afmetingen is afhankelijk van de pixelgrootte van de camera, de potentieel toegepaste binning en de lens en objectieve vergroting. De pixelgrootte in z is gelijk aan de zelf gedefinieerde z-stap grootte ( bijv. 4 μm).
  2. Kanaal aanpassingen
    1. Verplaats eerst het autofluorescentiesignaal naar grijstinten door de "Display-aanpassing" ("Bewerken" en "Weergave aanpassing van het display") te openen. In een nieuw venster worden alle geopende kanalen en de weergave-instellingen voor alle van hen weergegeven; Om de standaardkleur te wijzigen, selecteer het autofluorescentie kanaal en kies de "witte" weergavestijl. Klik op 'ok' om te solliciteren.
    2. Voor aanpassing op zwart niveau, ga terug naar "Beeld aanpassing" en stel de zwarte waarde in om ongewenste achtergrond signalen uit te sluiten die geen voorbeeldstructuur vertegenwoordigens.
      1. Om dit te doen, gebruik de bovenste linker driehoek op de balk en sleep het van links naar rechts.
        OPMERKING: Wijzigingen worden onmiddellijk weergegeven. Zorg ervoor dat alleen signalen die niet van het monster afkomstig zijn, onderdrukken. Minimumwaarden op de achtergrond moeten nooit "0" zijn om pitch-black pixels te vermijden, aangezien de geluidssignalen nodig kunnen zijn voor aanvullende berekeningen. Zorg ervoor dat alle veranderingen op het zwarte niveau na het maken van een afbeelding worden uitgevoerd. Anders kan waardevolle voorbeeldinformatie verloren gaan. De black level aanpassing serveert alleen representatieve doeleinden. Om dezelfde beeldinstellingen over verschillende monsters te gebruiken, kunnen precieze waarden worden ingevoerd in het minimale numerieke veld onder de kanaallijst. Dit is zeer nuttig voor kwantitatieve analyses.
    3. Voer de intensiteitsinstelling uit, door de bovenste driehoek te gebruiken om de betreffende kanaalintensiteit aan te passen of door precieze waarden in het maximale numerieke veld onder de channe in te voerenL lijst
    4. Voer contrastinstelling uit door de onderste driehoek in het midden van de balk te slepen om de gamma-waarde te verhogen of te verlagen of de precieze waarden in te voeren.
    5. Pas het AF647 kanaal aan volgens het autofluorescentie kanaal. Als verschil, stel de visualisatie van het AF647 signaal in op een hittekaart kleur opzoek tafel. Doe dit door de kanaalmodus "brand" te kiezen in een aanpak die vergelijkbaar is met die in stap 4.2.1.
      OPMERKING: Aangezien de totale signaalintensiteiten significant lager zijn dan het autofluorescentie kanaal, worden de zwarte niveaus meestal aangepast aan veel lagere waarden. Wat het autofluorescentie kanaal betreft, wordt de helderheid van dit kanaal gewoonlijk verhoogd.
    6. Selecteer de "mix mode" om weefselstructuren in detail te visualiseren. Analyseer alle monsters uit één serie met dezelfde parameterwaarden.
  3. Virtuele clipping
    1. Om het orgaan voor de 3D-scene expo vrijwel te openenRt, gebruik een clipping plane op het gesmolten 3D object.
      1. Klik op het pictogram 'Knipperplan' (schaar) in de objectlijst. Binnen het beeldweergave verschijnt een geel kader en een manipulator (witte spindel). Draai de spindel aan het dunner einde met de muis, waardoor de oriëntatie van het knippervlak veranderd wordt en beweeg het dikker middelste deel van de spil om de gewenste diepte van de knipping te selecteren.
      2. Verberg het kader en de manipulator door de desbetreffende selectievakjes onder de objectlijst te vinken en de gewenste snapshots te maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gepresenteerde LSFM benadering analyseert de leukocytenverdeling en hoeveelheid in muizenharten bij inductie van ernstige myocarditis. Figuur 1A legt het voorbehandelingsprotocol voor de transgene CD11c.DTR muizen voor myocarditis inductie uit. Deze stap vertegenwoordigt de noodzakelijke trigger voor de aanwerving van leukocyten aan het myocardium. Na een succesvolle DTX-toepassing ontwikkelen de dieren ernstige ziektebeelden, zoals algemene zwakte, anorexia en gewich...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de moderne levenswetenschappen speelt de microscopische visualisatie van biologische processen een steeds belangrijker rol. In deze context zijn er in de laatste twee eeuwen veel ontwikkelingen gerealiseerd die bijdragen tot het beantwoorden van vragen die niet tot dit punt kunnen worden aangepakt. Ten eerste is er een duidelijke neiging geweest om het resolutie vermogen van lichtmicroscopen fundamenteel te vergroten. Met gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) 21 ,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoek in het Gunzerlaboratorium werd ondersteund door het Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek (subsidie ​​nr. 0315590 AD) en door de Duitse Onderzoeksstichting (subsidie ​​nr. GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). We bedanken verder de IMCES voor technische ondersteuning en Sebastian Kubat voor hulp bij 3D-cartoonmodellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
difterietoxineSigma AldrichD0564
fosfaat gebufferde zoutoplossingBiochromL182-10
ketamine [50 mg/mL]InresaPZN 4089014
xylazine [2 %]Ceva
seringBraunREF 9161502Braun Omincan F 
indwelt veneuze katheter Becton DickinsonREF 381923BD Insyte Autoguard
klein dierenrespiratorHarvard Apparatus73-0044MiniVent
anit-CD45 antilichaam (AF647)BioLegend103124
ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) dinatriumzout dihydraatCarl Roth8043.2
katheter (21 G)BD BiosciencesREF 387455BD valu-set
paraformaldehydeSigma AldrichP6148
PE buis (5 mL)Carl RothEKY9.1Rotilabo
ethanolCarl Roth9065.4
dibenzyletherSigma-Aldrich108014
buisrotatorMiltenyi Biotec130-090-753MACSmix
agarose (lage gelling)Sigma AldrichA4018
mal (15 x 15 x 5 mm)Tissue Tek4566Cryomold 
lichtblad microscoopsysteemLaVision BiotecUltramicroscope 
microscooplichaamOlympusMVX10 
objectiefOlympus0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm 
sCMOS camera 5.5MPAndor Technology
488 nm OPSL (50mW) laserCoherent
647 nm  diodelaser (50mW)Coherent
3D beeldverwerking & analysesoftwareBitplaneIMARIS Ver. 8.3
transgene muisstamSteffen Jung et al.CD11c.DTR
wt muisstamEnvigoBalb/c Ola Hsd J
Laser ModuleLaVision Biotec
MVPLAPO 2XC Objectieflens

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
  2. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
  3. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
  4. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705(2007).
  5. Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), pdb top78 (2010).
  6. Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
  7. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  8. Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
  9. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
  10. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  11. Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207(2013).
  12. Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
  15. Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
  16. Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
  17. Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
  18. Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
  19. Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
  20. Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
  21. Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
  22. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
  23. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
  24. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  25. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  26. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  27. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
  28. Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
  29. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  30. Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , in press (2016).
  31. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  32. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  33. Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014(2005).
  34. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  35. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  36. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650(2015).
  37. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  38. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  39. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  40. Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
  41. Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
  42. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Murine myocarditisfluorescentie imagingorgaanclearingantilichaamskleuringbeeldverwerkinghartontstekingvisualisatie van het gehele orgaanCD45 positieve cellen

Gerelateerde artikelen