Methodenartikel

Geautomatiseerde Contractie Analyse van Human Engineered hartweefsel voor Cardiac Drug Safety Screening

DOI:

10.3791/55461

⸱

15 april 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Experimental Pharmacology and Toxicology, Cardiovascular Research Center, University Medical Center Hamburg-Eppendorf and DZHK (German Center for Cardiovascular Research)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier tonen we de generering van humane gemanipuleerde hartweefsel van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide cardiomyocyten. We presenteren een methode om contractiekracht en voorbeeldige verandering van contractie patroon geanalyseerd door hERG kanaal remmer E-4031. Deze werkwijze vertoont een hoge mate van robuustheid en geschiktheid voor cardiale geneesmiddelscreening.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hartweefsel techniek beschreven technieken driedimensionale kracht opwekkende gemanipuleerde weefsels vormen. Voor de uitvoering van deze procedures in fundamenteel onderzoek en preklinische ontwikkeling van geneesmiddelen, is het belangrijk om protocollen voor automatisch genereren en analyses te ontwikkelen onder gestandaardiseerde omstandigheden. Hier presenteren we een techniek om Engineered hartweefsel (EHT) van cardiomyocyten van verschillende species (rat, muis, mens) te genereren. De techniek berust op de montage van een fibrine-gel die gedissocieerd cardiomyocyten tussen elastische polydimethylsiloxaan (PDMS) berichten in een 24 putjes format. Driedimensionale, kracht opwekkende EHTs vormen binnen twee weken na het gieten. Deze procedure maakt het mogelijk om het genereren van enkele honderden EHTs per week en is technisch alleen beperkt door de beschikbaarheid van hartspiercellen (0,4-1,0 x 10 6 / EHT). Evaluatie van auxotonic spiercontracties wordt uitgevoerd in een gewijzigde incubatiekamer met een mechanical interlock 24-wells platen en een camera bovenop deze kamer. Een software bestuurt een camera bewogen op een XYZ-assenstelsel elke EHT. EHT contracties gedetecteerd worden door een geautomatiseerd figuur algoritme en kracht berekend op basis van verkorting van de EHT en elastische neiging en geometrie van de PDMS posten. Deze procedure maakt het mogelijk voor automatische analyse van grote aantallen EHT onder gestandaardiseerde en steriele omstandigheden. De betrouwbare detectie van effecten van geneesmiddelen op cardiomyociet samentrekking is van cruciaal belang voor de ontwikkeling van het hart van geneesmiddelen en veiligheid farmacologie. We demonstreren het voorbeeld van het hERG kanaal remmer E-4031, dat het menselijke EHT systeem repliceert drug reacties op contractie kinetiek van het menselijk hart, wat aangeeft dat een veelbelovend voor cardiale drugveiligheid screening.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cardiale bijwerkingen zoals de door drugs veroorzaakte lange QT-syndroom hebben geleid tot de markt nemen van de afgelopen jaren. Statistieken tonen aan dat ongeveer 45% van alle opnames zijn te wijten aan ongewenste effecten op het cardiovasculaire systeem 1. Dit medicijn niet na de dure ontwikkelingsproces en goedkeuring is het worst-case scenario voor farmaceutische bedrijven. Onderzoek en ontwikkeling afdelingen daarom richten op het opsporen van dergelijke ongewenste cardiovasculaire effecten vroeg op. Voor economische en ethische bezwaren, de inspanningen om dierproeven te verminderen en te vervangen door nieuwe in vitro screeningstesten zijn gaande.

Een set van gevestigde assays zijn opgenomen in de Verenigde Staten Food and Drug Administration (FDA) en het European Medicines Agency (EMA) richtsnoeren voor preklinische evaluatie van pro-aritmische effecten van geneesmiddelen 2. De technologie van herprogrammering somatische cellen, gevolgd door differentiatie vanhumane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) versterkt dit onderzoeksgebied 3. Het biedt nu de mogelijkheid om nieuwe kandidaat-geneesmiddelen op de menselijke hartspiercellen in vitro screenen en voorkomt problemen met de inter-species verschillen. Recente cardiale differentiatie protocollen 4, 5 bieden onbeperkt aanbod van hartspiercellen zonder ethische zorg. Echter, het meten van de contractiele kracht, de belangrijkste en best gekarakteriseerd in vivo parameter van hartspiercellen, is niet goed vastgesteld. Dit hangt samen met de relatieve onrijpheid 6 van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM) in vergelijking met de volwassen cardiomyocyten. Een mogelijke verbetering te construeren 3-dimensionele hartweefsel van enkelvoudige cellen 7 (engineered hartweefsel EHT). De EHT protocol is gebaseerd op het inbedden één murine of humane hartspiercellen 8 sup>, 9, 10 in fibrine hydrogel tussen twee flexibele polydimethylsiloxaan (PDMS) berichten 11 24 putjes. Binnen een paar dagen de hartspiercellen spontaan beginnen te contracteren als enkele cellen en beginnen te cellulaire netwerken te vormen. Na 7-10 dagen, macroscopische contracties van het gehele weefsel zichtbaar. Tijdens dit proces wordt de extracellulaire matrix wordt verbouwd, hetgeen leidt tot een vermindering van diameter en lengte. De verkorting van de EHT resultaten bij het buigen van de PDMS plaatsen zelfs tijdens rust, het onderwerpen van hartspiercellen in de ontwikkelingslanden EHT om continue belasting. EHTs blijven auxotonic spiercontracties te voeren over een aantal weken. Menselijke EHTs tonen respons op fysiologische en farmacologische stimulering vermelding van hun geschiktheid voor drug screening en ziektemodel 7.

In dit manuscript presenteren we een robuust en eenvoudig protocol voor de Generatiop menselijke EHT en contractiliteit geautomatiseerde analyse van concentratie afhankelijke veranderingen van de contractie patroon in aanwezigheid van hERG kanaal remmers.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De volgende stappen beschrijven een celcultuur protocol. Gelieve te presteren onder steriele omstandigheden en het gebruik van voorverwarmde media.

1. Cardiac Differentiatie van iPSC

  1. Cultiveren van de iPSC
    1. Coat 6 putjes (1 ml / putje) of T75-kolven (7 ml / kolf) waarvan de groeifactor basaalmembraanmatrix (bijv geltrex, 1: 200; zie tabel materiaalkosten) verdund in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) voor 30 min bij 37 ° C. Bereid FTDA medium 12 door mengen basische DMEM / F-12 medium met 2 mM L-glutamine, 0,5% penicilline / streptomycine, 5 mg / l transferrine, 5 ug / l selenium, 0,1% menselijk serumalbumine, 1x lipide-mengsel, 5 mg / l insuline, 50 nM dorsomorphin, 2,5 ng / ml activine A, 0,5 ng / ml humaan TGFß1 en 30 ng / mL FGF2.
    2. Zaad iPSC (~ 3 x 10 10/05 cm²) in FTDA medium en kweek bij 37 ° C, 5% CO2, 21% O2 met dagelijkse mediumverversing (Figuur 1A). Bij 80% confluentie doorgang (1: 2-1: 6) met ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA, 0,5 mM; incubatietijd ~ 4 min).
  2. De vorming van embryo lichamen (EB)
    1. Cultiveren iPSC in T75 kolven tot hoge dichtheid.
      1. Wassen flessen met confluente cellen tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (PBS) en geïncubeerd in 0,5 mM EDTA gedurende -10 min. Zorg ervoor dat de cellen niet los van de bodem van de kolf.
      2. Verwijder EDTA met glazen pipet, spoelen uit cellen met 10 ml PBS, tikt kolven bij de bank om cellen los.
        OPMERKING: Gebruik cel schraper indien nodig.
      3. Verzamel cellen in 50 ml conische buis, voeg ¼ volume (bijvoorbeeld 10 ml RMPI tot 40 ml celsuspensie) RPMI 1640 medium (of een andere standaard medium dat 1,8 mM calcium) en gecentrifugeerd bij 250 xg gedurende 5 minuten.
    2. Hersuspenderen celpellet in FTDA medium aangevuld met 4 mg / ml polyvinylalcohol (PVA) en10 uM Y27632 en tel de cellen in een Neubauer kamer.
    3. Vul de centrifugekolf met de celsuspensie (30 x 10 6 cellen / 100 ml FTDA medium aangevuld met PVA en Y-27632; zie stap 1.2.2) en start EB formatie in spinner kolven (pas rotorsnelheid magnetische roerder 40 rpm ) in de celkweek incubator (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) overnacht.
  3. mesodermale differentiatie
    1. Tijdens EB vorming, laag celkweek flessen geschikt voor suspensiekweek met niet-ionogene oppervlakteactieve stof (14 ml / T175) overnacht bij 37 ° C.
    2. De volgende ochtend was surfactant gecoate kolven tweemaal met PBS (30 ml / T175). Voeg PBS opnieuw en in de incubator te houden totdat het nodig is.
    3. Verwijder de centrifugekolf uit de incubator.
      OPMERKING: De celsuspensie moet duidelijk met kleine macroscopisch zichtbare EBS (figuur 1B) zijn.
    4. Breng 50 ml suspensie aan een 50 ml conische kuipe EBS en laat bezinken gedurende 5-20 min.
    5. Verwijder het supernatant en was het pellet met 7 ml RPMI 1640 aangevuld met 2% PVA en 10 pM Y-27632. Overdracht suspensie tot een gegradueerde 15 ml conische buis en schatting EB volume (~ 50-100 pi).
    6. Transfer inhoud van de spinner kolven niet beklede T175 flessen en verlaat deze op V-vormige rek voor sedimentatie gedurende maximaal 20 minuten. Verwijder supernatant en was embryoïde lichamen zoals hierboven vermeld. Vul niet de T175 kolf met meer dan 200 ml als sedimentatie te lang zou duren. Als aanvankelijk centrifugekolf volume groter is dan 200 ml, verdeeld EB suspensie verscheidene T175 flessen en combineer EBS opnieuw na wassen.
    7. Verwijder wasmedium en resuspendeer in mesodermale medium voor differentiatie, dat RPMI aangevuld met 4 mg / ml PVA, 0,5% penicilline / streptomycine, 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine-ethaansulfonzuur (HEPES), 0,05% humaan serum albumine, 5 ug / ml transferrine, 5 ng / ml natriumseleniet, 0,1% lipide mix, 250 uM fosfo-ascorbaat, 10 pM Y-27632, 10 ng / ml botmorfogeenproteïne-4 (BMP-4), en 3 ng / ml activine A, 5 ng / mL FGF2 stabiel.
    8. Verwijderen uit PBS-surfactant gecoate T175 flessen en vul met celsuspensie (200 pl EB in 40 mL). Gebruik kleinere kolven voor kleinere EB volume.
    9. Cultiveren EBS in suspensie gedurende drie dagen (37 ° C, 5% CO2, 5% O2). Uitwisseling 50% van het medium (zelfde samenstelling als in stap 1.3.7) dagelijks (gebruik V-vormige sedimentatie rack). Bereid medium elke dag vers vóór het voeren.
  4. Cardiac differentiatie
    1. Bereid nieuwe oppervlakte-actieve stof beklede schepen de dag vóór en behandelen zoals hierboven (1.3.2) aangegeven.
    2. Na drie dagen van mesodermale inductie, laat EBS genoegen nemen met maximaal 5 min op sedimentatie rek. Verwijder meeste van het medium en wassen met RPMI 1640 aangevuld met 0,5% penicilline / streptomycine en 10 mM HEPES.
    3. Breng 10 ml EB suspensie gegradeerde15 mL buis en schatting EB volume na sedimentatie.
    4. Resuspendeer EBS zorgvuldig cardiale differentiatie medium bestaande uit RPMI 1640 aangevuld met 0,5% penicilline / streptomycine, 10 mM HEPES, 0,05% menselijk serumalbumine, 5 ug / ml transferrine, 5 ng / ml natriumseleniet, 0,1% lipide mengsel, 250 pM fosfo -ascorbate, 1 pM Y-27632, 100 nM Wnt-remmer DS-I-7 13.
    5. Transfer EBS nieuwe surfactant gecoate celkweek flessen (-200 pl EBS in 46 ml / T175).
    6. Incubeer gedurende drie dagen (37 ° C, 5% CO2, 21% O2) met 50% mediumverandering (mediumsamenstelling zie stap 1.4.4) op de tweede en derde dag. Laat het medium binnen de eerste 48 uur niet veranderen.
    7. Incuberen in een medium bestaande uit RPMI 1640 aangevuld met 500 uM 1-thioglycerol, 10 mM HEPES, 0,5% penicilline / streptomycine, 1 pM Y-27632, 2% serumvrij neurale celcultuur supplement (bv B27) insuline, 100 nM Wnt remmer DS-I-7 met dagelijkse uitwisseling van 50% medium voor de komende vier dagen. EBS moet gaan kloppen binnen deze periode.
    8. Na een week van cardiale differentiatie, over te schakelen naar hetzelfde medium zonder Wnt remming en met serum-vrij neurale celcultuur supplement. Ververs 50% van het medium elke dag, met uitzondering van de eerste dag.
  5. Dissociatie van menselijke hartspiercellen
    OPMERKING: Na twee weken differentiatieprotocol dient EBS spontane contracties (figuur 1C) vertonen. Als dat zo is, start dissociatie en voor te bereiden collagenase oplossing.
    1. Bereid collagenase oplossing door weging en oplossen 200 U / ml calcium-vrije Hanks' gebalanceerde zoutoplossing zonder calcium / magnesium (HBSS) en voeg 1 mM HEPES, 10 pM Y-27632, 30 uM N-benzyl-p-tolueensulfonamide ( BTS). Steriliseren door filtratie (0,2 urn filter) en bewaar monsters bij -20 ° C. Ontdooi monsters bij 4 ° C gedurende de nacht.
    2. Settle EBS op sedimentatie rek,aspireren medium en vervangen door 20-25 ml voorverwarmde HBSS. Herhaal deze wasstap eens te meer.
    3. Aspireren HBSS en vervangen voorverwarmd collagenase-oplossing (15 ml / T175). Incubeer gedurende 4 uur in de celkweek incubator (37 ° C, 5% CO2, 21% O2).
    4. Bereid blokkeerbuffer met DMEM aangevuld met 1% penicilline / streptomycine en DNase (12 ug / ml).
    5. Tik op de celkweek kolven op de bank, los EBS moet desintegreren en uit elkaar vallen (indien niet, verhoog incubatietijd). Voorzichtig fijnstampen celsuspensie overgebracht in een conische buis van 50 ml. Wassen flessen met blokkerende buffer (15 ml / T175) en breng aan de buis.
    6. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 100 x g. Resuspendeer cellen in warm DMEM, vermaal en tel cellen.

2. Genereren van Engineered hartweefsel (EHT)

  1. Autoclaaf handel verkrijgbare PDMS rekken en polytetrafluorethyleen (PTFE) afstandhouders (zie Materialen enEquipment spreadsheet; Figuur 2) en de voorbereiding van de volgende oplossingen onder steriele omstandigheden, een dag voor EHT genereren.
    1. Bereid 2% agarose door wegen en oplossen in geschikt volume van PBS, autoclaaf, direct bewaren bij 60 ° C.
    2. Bereid aprotinine (33 mg / ml) door weging en oplossen in geschikt volume aqua ad iniectabilia, steriel filter (0,22 urn filter), hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.
    3. Bereid fibrinogeen (200 mg / ml) door oplossen steriele fibrinogeen geschikt volume steriel 0,9% NaCl (lauw), hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.
    4. Bereid thrombine (100 U / ml) door oplossen steriele trombine in drie delen steriel PBS en 2 delen aqua ad iniectabilia, analyseren hoeveelheid van 3 pi in kleine buisjes en bewaar bij -20 ° C.
    5. Bereid 10x DMEM door oplossen van 670 mg 10x DMEM poeder in 5 ml aqua ad iniectabilia, steriel filter en bewaar bij 4 ° C.
    6. Bereid 2x DMEMdoor het mengen van 2 ml DMEM met 10 x 2 ml door warmte geïnactiveerd paardenserum, 0,2 ml penicilline / streptomycine en 5,8 ml aqua ad iniectabilia, steriel filter en bewaar bij 4 ° C.
    7. Bereid EHT-casting medium (ECM) door mengen DMEM met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal kalfserum, 1% penicilline / streptomycine en 1% L-glutamine (200 mM), bewaar bij 4 ° C.
  2. Bereid gietvormen in 24-putjesplaten pipetteren 1,6 ml warm agarose (2% PBS) en het plaatsen van de PTFE afstandhouder (figuur 2A) in de putjes.
    LET OP: Plaats spacer onmiddellijk na pipetteren tot een maximum van 8 putten - agarose stolt zeer snel. Laat de agarose bij kamertemperatuur niet gedurende langer dan 5 min.
  3. Na agarose stolling (~ 10 min, agarose wordt opaak draaien) Verwijder de PTFE afstandhouders (figuur 2C) en plaats de PDMS rekken (figuur 2B) in de gietvormen zodat paren PDMS posten bereiken in elke vorm (Figuur 2D).
  4. Resuspendeer de cardiomyocyten als ECM met een minimale concentratie van 15 x 10 6 cellen / ml.
  5. Bereid 110% van het geschatte volume van reconstitutie mengsel in een ronde bodem 15-mL buis op ice.For 24 EHTs, pipet reconstitutie mengsel vermeld in tabel 1 van mens, rat of muis cardiomyocyten, respectievelijk (10% extra is inbegrepen).
    OPMERKING: celconcentratie van reconstitutie mengsel verschilt voor menselijk (10 x 10 6 cellen / ml), ratten (4,1 x 10 6 cellen / ml) en muizen (6,8 x 10 6 cellen / ml) EHTs. Afhankelijk van de concentratie van de celsuspensie, voeg extra ECM tot een eindvolume van 2640 pi. Fibrinogeen lauw voor pipetteren te zijn. Vul langzaam de punt van de pipet en niet het oppervlak van de koude reconstitutie mengsel niet met de fibrinogeen bevattende pipet bij het toevoegen van fibrinogeen aan reconstitutie mix - de viscositeit van de fibrinogeen in de pipetpunt onmiddellijk zou toenemen.
  6. Vermaal de reconstitutie mengsel 10-15 maal met een serologische pipet tot de fibrinogeen stolsel wordt opgelost. Controleer de reconstructie mix in de pipet voor homogeniteit.
  7. Voor elke EHT Pipetteer 100 ul reconstitutie mengsel in een hoeveelheid trombine (3 pl in 200 pl buis), mengen en pipet het mengsel in de agarose-sleuven zo snel mogelijk (figuur 2E). Gebruik een nieuwe filter tip voor elke EHT. Resuspendeer de reconstructie mix (trituratie met serologische pipet 5-10 maal) na elke 8 EHTs.
  8. Zodra alle slots zijn gevuld met reconstitutie mix, sluit het deksel van de celkweekschaal en incubeer bij 37 ° C, 7% CO2 gedurende 2 uur.
  9. Verwijder de plaat uit de incubator en plaats onder een steriele kap. Bedek elk putje met een kleine hoeveelheid medium (bijvoorbeeld DMEM, ongeveer 200-500 pl) Schud de platen voorzichtig opnieuw incuberen bij 37 ° C gedurende ten minste 10 min. De toevoeging van DMEM zal het verwijderen van fibrine gels uit agarose gietmallen verlichten.
  10. Bereid een nieuwe plaat met 24 putjes met 1,5 ml EHT-medium per putje bestaande uit DMEM aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd paardenserum, 1% penicilline / streptomycine, 10 ug / ml insuline, 33 ug / ml aprotinine.
  11. Verwijder voorzichtig de PDMS rekken uit de agarose gietmallen en overbrengen naar de met medium gevulde plaat met 24 putjes (figuur 2F). Plaats de schaal terug in de incubator (37 ° C, 7% CO2, 40% O2 voor menselijk en ratten EHTs, 21% O2 voor muizen EHTs) en diervoeders maandag, woensdag en vrijdag met vers bereide EHT-medium. EHTs moet spontane contracties afbuigen van de posten van de PDMS rekken tonen 7-10 dagen na het gieten (figuur 1D, 2G).
    1. Voor muizen EHTs voeg 25 ug / ml 5-cytosine βDarabinofuranoside kweekmedium gedurende 48 uur tot fibroblast proliferatie te beperken.

3. Analyse Contractie

LET OP: De krimp analyse is gebaseerd opVideo-optische registratie in een commercieel verkrijgbaar EHT analyseapparaat (zie tabel van materialen). De centrale eenheid van dit instrument een incubatiekamer (Figuur 3A). De software die bij het instrument berekent contractiekracht basis van afbuiging van de PDMS palen met bekende elasticiteitsmodulus en de vorm 11 (aanvullend Figuur 1).

  1. Schakel de verwarmingsinrichting van de machine 2 uur voor de meting. Schakel gastoevoer en elektronische voorziening van de as onmiddellijk vóór de samentrekking analyse.
  2. Voor baseline opname (referentiepunt in de analyse), plaatst de 24-well plaat met EHTs in EHT-medium in de EHT analyseapparaat en start de contractie analysesoftware volgens leveranciershandboek.
    1. Klik op het tabblad "Protocol" in het rechter paneel en voer de relevante informatie met betrekking tot studie, gebruikersnaam, species, ceType II, leeftijd, opnameduur en aanvullende opmerkingen.
    2. Klik op het tabblad "Camera" op het linker paneel en beginnen met camera live-modus met automatische figuur detectie-modus. Klik op het tabblad "Setup" op het rechter paneel andadjust de camera positie met de xyz coördinaten voor elk putje in de 24-well-schotel. Zorg ervoor dat de EHT is in het midden van het raam en in de focus van de camera.
      1. Zorg ervoor dat het deksel van de celkweek gerecht is niet mistig, omdat dit cijfer erkenning en krimp analyse zal aantasten.
        NB: Het cijfer erkenning algoritme is gebaseerd op het opsporen van een hoog contrast gebieden en het toezicht op de verandering in de positie. In de software die gebieden van figuur herkenning met een blauwe kruis dat beweegt met de contracties van de EHT gemarkeerd.
      2. Ervoor zorgen dat de posities van de blauwe kruisen aan de boven- en ondereinden van de EHTs en bewegende alleen verticaal afstemmen van de contracties van de EHTs (Figuur 3B). Save setup posities van elk putje door op de knop "positie ok".
    3. Klik vervolgens op het tabblad "Parameters" op het linkerpaneel. De hier getoonde parameters bepalen de criteria op basis waarvan de software identificeert een samentrekking piek en markeert het met een groen plein. Deze waarden zijn zeer belangrijk voor correcte identificatie van contractie pieken (figuur 3C) en geen valse gegevenspunten (figuur 3E-F).
      OPMERKING: Een lijst van soorten afhankelijke parameters en voorbeelden is weergegeven in figuur 3H. Voor meer informatie, raadpleeg de software handleiding.
    4. Klik op het tabblad "Automatic" op het rechter paneel en de inleiding van de analyse door het activeren van de knop "Start". De software zal achtereenvolgens van de ene put naar het volgende, opnemen EHT contracties en bereken kracht tijdens het opnemen (weergegeven in de tab "real time" in het linkerpaneel). Aan het einde van de analyse, een pdf-rapport summarizing de resultaten automatisch gegenereerd.
  3. Opslaan en analyseren van de PDF-rapport het systeem gegenereerd om de resultaten samen te vatten.
  4. Bewaken van de contractiele parameters door herhaalde meting over meerdere dagen. De EHT zal toenemen in contractie van kracht totdat het een plateau (meestal rond dag 15 van de cultuur) heeft bereikt.
  5. geneesmiddelscreening
    1. Prepare proteïne vrije Tyrode oplossing een dag vóór de meting en equilibreren in 24-putsplaten (2 ml / putje) in de celkweek incubator (37 ° C, 7% CO2, 40% O2) overnacht: 120 mM NaCl, 5,4 mM KCI, 1 mM MgCl2, 0,1-5 mM CaCl2, 0,4 mM NaH 2PO 4, 22,6 mmol NaHCO3, 5 mM glucose, 0,05 mM Na2EDTA, 25 mM HEPES. Voeg calcium tot 1,8 mm of de eerder bepaalde [EC 50] om positieve inotrope effecten te onderzoeken.
    2. Weeg en los het geneesmiddel in DMSO en filtreer steriel, indien nodig.Bereid 6 verschillende 1000x-sub-voorraadoplossingen (in DMSO) van de werkconcentratie (bv 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 pM voor de respectieve nanomolaire bereik).
    3. Verdun de respectievelijke beelden in de Tyrode platen (2 pl per put 2 ml) en meng. Plaats de borden terug in de couveuse totdat het nodig is.
    4. Start de nulmeting door de eerste-Tyrode gevulde 24-well-plaat onder de motorkap en steriele positie koolstof elektroden in de putjes. Breng de PDMS rekken met EHTs bovenop koolstofelektroden, sluit het deksel, zet de plaat terug in de incubator en wacht op een equilibratie gedurende -30 min.
    5. Breng de EHTs uit de incubator naar de vergrendeling in de EHT analyse-instrument. Sluit het instrument en opnemen spontane basislijn contractiliteit (20 s / EHT).
    6. Sluit de koolstofelektroden de stimulatie- kabel en start elektrische stimulatie van de EHTs (2,5 V, 4 ms pulsduur, humaan: ~ 1 Hz, rat: ~ 2Hz, muis: ~ 4 Hz). Noteer het "tempo" basislijn (10 s / EHT). Zorg ervoor dat alle EHTs goed zijn tempo. Stimulatiefrequentie en de spanning kan variëren van cellijn tot cellijn.
    7. Na basislijn opname verwijderen EHTs uit het instrument en breng de elektroden met PDMS rekken geplaatst, de 24-well-plaat met de eerste geneesmiddelconcentratie. Breng de EHTs weer op de vergrendeling van de EHT analyseapparaat onmiddellijk en incubeer er (standaarddrugtests incubatietijd bijvoorbeeld 20 min).
    8. Sluit stimulatie kabels passen figuur herkenning en opname EHT contracties reageren op het eerste geneesmiddelconcentratie.
    9. Voor de volgende geneesmiddelconcentraties Herhaal stap 3.5.7 en 3.5.8 met de 24-well-platen met hogere geneesmiddelconcentraties.
    10. Sla alle pdf opnames. Controleer elke opname voor figuur erkenning juiste positionering van groene pleinen identificeren contractie pieken en artefacten (zie 3.2.1 en figuur 3 ).
    11. Voer extra offline analyse indien nodig.
      1. Kies de betreffende vlucht voor de "Runs" database op het linker paneel door te klikken op "Select run". In het tabblad "Parameter" aan de linkerkant, te wijzigen parameter voor krimp analyse. Kies nu "Offline analyse" op het tabblad "Offline" op het rechter paneel om de video's opnieuw analyseren.
      2. Figuur erkenning aan te passen en dus een nieuw videobestand te nemen, kiest "Sample beoordeling" na het aanpassen van het cijfer herkenning in het tabblad "real time". LET OP: Sample beoordeling kan alleen heranalyseren één putje in een tijd, terwijl offline analyse nieuwe parameter kan gelden voor alle putten door te klikken op de knop "Use parameter op alle putjes" in het "Parameter" paneel aan de linkerkant. Beide soorten offline analyses zullen automatisch nieuwe data bestanden en pdf-weergave van de resultaten te creëren.
    12. Analyseer het experiment door het combineren van de resultaten van de biological repliceert en samenvatting van de gegevens in concentratieresponskrommen voor frequentie contractiekracht, samentrekkingstijd en relaxatietijd (Figuur 5D) en / of grafische weergave van de gemiddelde contractie pieken (figuur 5C).
      OPMERKING: PDMS rekken en PTFE afstandhouder kan herhaaldelijk worden gebruikt (PDMS rekken max 5 keer en PTFE afstandhouder eindeloos.). Na gebruik handmatig met water, koken tweemaal in gedemineraliseerd water en autoclaaf. Wees je bewust van mogelijke carry-over effecten, bij het opnieuw gebruik van de rekken, zoals drugs zouden kunnen worden geabsorbeerd door het PDMS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cardiale differentiatie en Bereiding van EHT

IPSC werden uitgebreid op verkorte groeifactor basaalmembraanmatrix, gedissocieerd met EDTA en embryoid lichamen (EB's), gevormd in spinner kolven overnacht. Na mesodermale inductie gedurende drie dagen werd cardiale differentiatie gestart met het Wnt-remmer. Na ~ 17 dagen differentiatieprotocol, sloegen EBS gedissocieerd tot afzonderlijke cellen met collagenase type II (fi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Engineered hartweefsel biedt een waardevolle optie om de gereedschapskist van het cardiovasculair onderzoek. EHTs in 24 putjes zijn waardevol gebleken voor ziektemodel 8, 14, drugveiligheid screenen 7, 8, 10, 11, 15, of basische cardiovasculair onderzoek 16,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IM, TE en AH zijn mede-oprichters van EHT Technologies GmbH, Duitsland.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn dankbaar Alessandra Moretti en Dennis Schade voor hun vriendelijke bijdrage van het materiaal. Wij erkennen de grote steun van de iPS en EHT werkgroep bij de afdeling Experimentele Farmacologie en Toxicologie van het UKE. Het werk van de auteurs wordt ondersteund door subsidies van de DZHK (German Center for Cardiovascular Research) en het Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF), de Duitse Research Foundation (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), British National Center for the Replacement Verfijning en Vermindering van Dieren in Onderzoek (NC3Rs BARST-IT verlenen 35.911-259.146), de British Heart Foundation RM / 13/30157, de European Research Council (Advanced Grant IndivuHeart), de Duitse Hartstichting en de Freie und Hansestadt Hamburg.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
EHT analysis instrumentEHT Technologies GmbHA0001Software is inbegrepen
EHT PDMS rackEHT Technologies GmbHC0001
EHT PTFE spacerEHT Technologies GmbHC0002
EHT electrodeEHT Technologies GmbHP0001
EHT pacing adapter/cableEHT Technologies GmbHP0002
24-well-plateNunc144530
6 well-cell culture plateNunc140675
15 mL falcon tube, graduated Sarstedt62,554,502
Cell scraperSarstedt831,830
Spinner flaskIntegra182 101
Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct Thermo scientific70101Stel roertoerental op 40 tpm in
T175 cell culture flask Sarstedt 831,812,002
V-shaped sedimentation rack Custom made at UKE Hamburgna
10× DMEMGibco52100
1-Thioglycerol Sigma AldrichM6145
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma Aldrich49752
Activin-A R&D systems338-AC
Agarose Invitrogen15510-019
AprotininSigma AldrichA1153
Aqua ad injectabiliaBaxter GmbH1428
B27 PLUS insulin Gibco17504-044
BMP-4R&D systems314-BP
Collagenase II WorthingtonLS004176
DMEMBiochromF0415
DMSO Sigma AldrichD4540
DNase II, type V (from bovine spleen)Sigma D8764
Dorsomorphin abcamab120843
EDTA Roth8043.2
Fetal calf serumGibco10437028
FGF2Miltenyi Biotec130-104-921
Fibrinogen (bovine)Sigma AldrichF8630
Geltrex GibcoA1413302Voor coating: 1:200 verdunning
HBSS w/o Ca2+/Mg2+ Gibco14175-053
HEPES Roth9105.4
Horse serumLife technologies26050088
Human serum albumin Biological Industries05-720-1B
Insulin, humanSigma AldrichI9278
L-GlutaminGibco25030-024
Lipidmix Sigma AldrichL5146
MatrigelBD Biosciences354234Voor EHT reconstitutiemix.
N-Benzyl-p-ToluenesulfonamideTCIB3082-25G
PBS w/o MgCl2/CaCl2Biochrom14190
Penicillin/StreptomycinGibco15140
Pluronic F-127 Sigma AldrichP2443
Polyvinyl alcohol Sigma AldrichP8136
RPMI 1640 Gibco21875
Sodium seleniteSigma AldrichS5261
TGFß1Peprotech100-21
ThrombinSigma AldrichT7513
Transferrin Sigma AldrichT8158
Y-27632Biorbytorb6014
hiPSCCustom made at UKE hamburgna
iCell cardiomyocytes kitCellular Dynamics InternationalCMC-100-010-001
Pluricyte cardiomyocyte kitPluriomicsPCK-1.5
Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kitAxiogenesis AGAx-C-HC02-FR3
Cellartis cardiomyocytesTakara Bio USA, Inc.Y10075

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines? Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
  2. Guidance for Industry S7B Nonclinical Evaluation of the Potential for Delayed Ventricular Repolarization (QT Interval Prolongation) by Human Pharmaceuticals. , U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm074963.pdf (2005).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  4. Burridge, P. W. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  5. Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).
  6. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  7. Mannhardt, I. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
  8. Eder, A. Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 109 (6), 436(2014).
  9. Stöhr, A. Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice. J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).
  10. Schaaf, S. Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397(2011).
  11. Hansen, A. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  12. Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PloS One. 7 (7), e41958(2012).
  13. Lanier, M. Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response. J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).
  14. Hirt, M. N. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).
  15. Jacob, F. Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue. PLoS One. 11 (2), e0145937(2016).
  16. Friedrich, F. W. Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).
  17. Crocini, C. Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 108 (3), 349(2013).
  18. Fiedler, J. Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization. J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).
  19. van Meer, B. J. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).
  20. Godier-Furnémont, A. F. G. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
  21. Eng, G. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Commun. 7, 10312(2016).
  22. Huebsch, N. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).
  23. Masumoto, H. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).
  24. Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues. Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).
  25. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  26. Vandenburgh, H. Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
  27. EHT Technologies GmbH. , Available from: http://www.eht-technologies.com Forthcoming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Assemblage van fibrinegelPDMS pilaartjeskrachtmetingcameragebaseerde detectiefiguuropleidingsalgoritmehERG kanaalinhibitieE 4031 medicijnrespons

Gerelateerde artikelen