Met behulp van een volledige immunohistochemische methode om de innervatie van de galwegen in te studeren Suncus murinus

Samenvatting

Een gehele-mount immunohistochemische aanpak, om de neurofilament eiwit expressie in het extrahepatische galweg in Suncus murinus te visualiseren. Wordt hier gepresenteerd. Dit protocol kan gebruikt worden om de innervering van alle viscerale organen in S. murinus of andere soorten te analyseren.

Samenvatting

Dit werk beschrijft de gehele berg immunohistochemie kleuring methode in detail, met behulp van neurofilament eiwit antilichaam voor het labelen van de innervatie van het galweg in Suncus murinus ( S. murinus   ). Ten eerste werd het monster van S. murinus gescheiden en in 4% paraformaldehyde (PFA) gefixeerd. Ten tweede werd een enzymatische behandeling en potentiële endogene peroxidase-inactivering uitgevoerd. Het monster werd vervolgens blootgesteld aan het primaire antilichaam, anti-neurofilament eiwit antilichaam, gedurende 3-6 dagen. Het werd vervolgens geïncubeerd met het secundaire antilichaam dat is geconjugeerd met mierikswortelperoxidase. De kleurreactie werd geopenbaard door het monster te laten reageren met een 3,3'-diaminobenzidine (DAB) substraat. Deze methode kan worden toegepast om de innervering van alle viscerale organen te analyseren. Bovendien kan dit protocol ook worden aangepast om andere neuronale antilichamen te testen, maar optimalisatie van de antibodiesHet moet eerst gedaan worden. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door Kuratani en Tanaka ^{1 , 2 , 3} .

Inleiding

De huismussklok , Suncus murinus , behoort tot de orde Insectivora en de familie Soricidae. Dit kleine zoogdier is verspreid over heel Zuidoost-Azië en woont in huizen en grasgebieden die zich bevinden in de buurt van menselijke woningen of veestokken ⁴ . Deze soort vertoont algemene morfologische kenmerken die vergelijkbaar zijn met mensen dan andere laboratoriumdieren, zoals de muis, de rat en het konijn ⁵ . Vroeger werd immunostaining met een perifere neuronmarkering voor S. murinus neurofilament eiwit (NFP) gebruikt om perifere zenuwen in de alvleesklier ⁶ , hoofdduodenale papilla ⁷ , pylorus ⁸ , galblaas ⁵ en extrahepatische galwegen ^{9 te} markeren.

NFP is een macromoleculaire complex die deel uitmaakt van het volwassen neuronale cytoskelet. Neurofilament-gerelateerd eiwitS bemiddelen interacties tussen NFP en de zygosoom. Zowel de enzymfunctie als de structuur van linkerproteïnen worden gereguleerd door NFP ¹⁰ . Het NFP-complex is gemaakt van drie polypeptiden: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) en NF-H (200 kDa). NFP kan worden gevonden in neuronale axonen in zowel het centrale als perifere zenuwstelsel. Anti-menselijk NFP antilichaam is aangetoond om axonen van het centrale en perifere zenuwstelsel te vermelden. Anatomische en elektrofysiologische onderzoeken hebben aangetoond dat de sfincter, galblaas en proximale maagdarmkanaal ^{11 , 12 , 13 , 14} verbonden zijn. Echter, de morfologische kenmerken van hun neuronale verbindingen zijn nog niet gedefinieerd.

Dit werk demonstreert het gebruik van een volledig-mount immunohistochemische kleuring methode om de innervation van de S. murinus bilIary kanaal met een NFP antilichaam.

Protocol

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institusionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van Tokyo (IACUC). De dieren werden gehuisvest en behandeld in overeenstemming met de Gids voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren en de gids voor de verzorging en het gebruik van experimentele dieren van de Canadese Raad voor Dierenverzorging . We gebruikten dieren die gefokt en gehandhaafd zijn in het Functional Morphology Laboratory, Departement van Grenzen Gezondheidswetenschappen, Tokyo Metropolitan University, Japan.

1. Dierenzorg en huisvesting

1. Verkrijg 7 S. murinus (3 vrouwtjes en 4 mannen met een gewicht van 70-90 g) uit een gesloten fokcolonie.
2. Kooi de S. murinus individueel na speen (20 d na de geboorte) in plastic kooien uitgerust met een houten nestkastje met papierstrips. Bewaar ze in een conventioneel geconditioneerde dierkamer: 23-27 ° C, geen vochtigheidscontrole en een 12:12 uur licht: donkere cyclus. Commercieel leverenIal forelpellets en water ad libitum.

2. Weefselbereiding

1. Om 4% (w / v) paraformaldehyde (PFA) voor te bereiden, loste 40 g PFA in 1000 ml 0,01 M fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) op. Meng in een dampkast een vortex tot de oplossing helder is. Bewaar de 4% PFA O / N bij 4 ° C.
   Voorzichtigheid: Draag geschikte persoonlijke beschermende uitrusting (PPE) bij het hanteren van PFA.
2. Om het dier te perfectioneren en te repareren, verdovende het met ether en geef het dan een intraperitoneale injectie van somnopentyl (pentobarbitalnatrium, 0,6 ml / kg lichaamsgewicht).
3. Nadat het dier volledig verdikkeld is, open de buikholte met een scalpel, waardoor een middelste abdominale incisie 3 cm lang wordt. Terwijl u de inferieure vena cava inslaat voor het uitsteken, plaatst u een katheter retrogradely in de abdominale aorta op het niveau onmiddellijk boven de bifurcatie van deze slagader in de gemeenschappelijke iliac arteries.
4. Injecteer somnopentyl (pentobarbital dusDium, 1,0 ml / kg lichaamsgewicht). Na volledige euthanasie, perfuse met 0,01 M PBS (pH 7,4) en dan met 4% PFA in een dampkast.
5. Na perfusie injecteer 2-3 ml witte neopreen latex (verdunde witte neopreen latex 3: 2 met gedistilleerd water (DW)) om de bloedvaten te markeren.
6. Uittrekken van de buikorganen, inclusief de lever, galblaas, gemene galweg, duodenum, en pancreas en blok, met de bijbehorende zenuwen en vaten.
7. Inject ongeveer 0,1 ml blauwe neopreen latex (voeg een druppel blauwe inkt toe aan 10 mL van de verdunde witte neopreen latex) naar de galblaas om het galgsysteem te labelen.
8. Post-fix overnacht met 4% PFA bij 4 ° C voor volledige-mount immunostaining.
   Let op: PFA is giftig. Vermijd direct PFA te behandelen. PFA moet in een dampkast worden gebruikt.

3. Whole-Mount Immunohistochemistry

Opmerking: gedurende het protocol, inclusief tijdens het wassen, antilichaam incubatie, en kleur, thHet exemplaar moet op de nutator blijven, schudden bij RT of bij 4 ° C.

1. Dag 1: Enzymatische behandeling en inactivatie van potentiële endogene peroxidase
   1. Was het voorbereide exemplaar met DW 4x gedurende 1 uur elk bij kamertemperatuur in een op maat gemaakte glazen flesje. Rip het specimen zachtjes op de nutator om de PFA te verwijderen. Vermijd beschadiging van het monster bij het uitwisselen van oplossingen.
   2. Om 1% (w / v) orthoperiodinezuur op te bereiden, lost 1 g orthoperiodinezuur op in 100 ml DW.
   3. Incubeer het monster gedurende 20 minuten bij 1 ° C in 1% orthoperiodinezuur om eventuele intrinsieke peroxidase-reactie te voorkomen.
   4. Bereid 0,004% (w / v) papain door 0,004 g papain in 100 ml 0,025 mol / L Tris-HCl buffer (pH 7,6) op te lossen.
   5. Was het monster met DW gedurende 10 minuten bij RT.
   6. Incubeer het monster in vers bereide 0,004% papain gedurende 2 uur bij 37 ° C in een bad met constante temperatuur met zachte schommeling.
   7. Was het monster met DW voor 50-60 minuten bij RT.
   8. Bewaar het monster in 4% PFA bij 4 ° C / N.
2. Dag 2: Enzymatische behandeling
   1. Was het opgeslagen monster met DW 4 keer per 1 uur bij RT.
   2. Incubeer het monster in vers bereide 0,004% papain gedurende 2 uur bij 37 ° C in een bad met constante temperatuur met zachte schommeling.
   3. Was het monster met DW gedurende 50-60 minuten bij RT. Bewaar het monster in 4% PFA bij 4 ° C / N.
3. Dag 3: Bevriezing
   1. Was het opgeslagen monster met DW 4x gedurende 1 uur elk bij RT, zoals hierboven.
   2. Bereid 2,5% (w / v), 5% (w / v) en 10% (w / v) sucrose door respectievelijk 2,5 g, 5 g en 10 g saccharose op te lossen in 100 ml 0,01 M PBS PH 7,4).
   3. Dompel het monster in 30 minuten voor 2,5 minuten (w / v), 5% (w / v) en 10% (w / v) sucrose.
   4. Bevroren het monster bij -20 ° C gedurende 30 - 60 minuten en ontdooit het dan bij RT; Herhaal de cyclus 3x.
   5. Naar pRepareer 2% Triton X-100 (v / v), voeg 2 ml Triton X-100 toe aan 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4).
   6. Bewaar het monster in 2% Triton X-100 bij 4 ° C / N.
4. Dag 4: Incubatie van primaire antilichamen
   1. Bereid de verdunningsoplossing van het primaire antilichaam door 0,2 g Bovine Serum Albumin (BSA), 0,3 ml Triton X-100 en 0,1 g Natriumazide in 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4) op te lossen.
      Let op: Natriumazide is acuut giftig. Inademing en aanraken moeten vermeden worden. Draag geschikte PPE.
   2. Verdun het primaire antilichaam (NFP) 1: 600 in de bovenstaande verdunningsbuffer (stap 3.4.1). Incubeer het monster met NFP antilichaam bij 4 ° C gedurende 3-6 dagen, waarbij het monster zachtjes op de noot schudt. Grotere monsters vereisen verhoogde incubatietijden.
5. Secundaire antilichaam incubatie
   1. Was het monster in PBS 4x gedurende 1 uur bij RT om het ongebonden primair antilichaam te verwijderen.
   2. Bereid de verdunningsoplossing voor het secundaire antilichaam door 0,2 g BSA en 0,3 ml Triton X-100 in 100 ml 0,01 M PBS (pH 7,4) op te lossen.
   3. Verdun het secundaire antilichaam (peroxidase-geconjugeerde, affiniteits-gezuiverde schapen-anti-muis IgG-HRP) 1: 600 in de verdunningsbuffer (stap 3.5.2). Incubeer het monster met het secundaire antilichaam bij 4 ° C gedurende 3 d, en houd het monster zachtjes aan de nutator grijpen.
6. Kleur
   1. Bereid DAB kleuroplossing door 0,002 g 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) op 100 ml 0,05 mol / L Tris-HCl buffer (pH 7,6) onder een dampkast toe te voegen, waarbij de oplossing in het donker blijft.
   2. Was de specimen bij RT in PBS 4x voor 1 uur elk.
   3. Voeg 10 μl 30% H ₂ O ₂ in vers bereide DAB kleuroplossing toe en incubeer met de oplossing bij 4 ° C / N of 3 d terwijl u zachtjes op de nutator schuift.
   4. Stop de reactie door plaCing het monster in PBS met 0,04% natriumazide wanneer de optimale kleurintensiteit is bereikt.
      OPMERKING: Vermijd het gebruik van natriumazide tot deze stap, aangezien het peperwortelperoxidase remt.
7. Beeldvorming van het gekleurde weefsel
   1. Zet het monster zorgvuldig over op een petri glazen schotel (5 cm hoog, 10 cm in diameter) met PBS. Vastgehouden beelden met behulp van een camera op een stereomicroscoop vastleggen.
      OPMERKING: Gefocusterd gebrandschilderd weefsel moet worden afgebeeld terwijl het volledig in PBS wordt gedompeld op een transparante glazen schotel.

Resultaten

Figuren 1 - 4 tonen typische resultaten voor NFP-positieve zenuwvezels in het extrahepatische galweg in S. murinus . Het antilichaam tegen NFP genereerbaar de innervation in het gehele beeld van het extrahepatische galwegen ( Figuur 1 ), galblaas ( Figuur 2 ), bovenste galweg ( Figuur 3 ) en duodenale papilla gebied ( Figuur 4 ...

Discussie

Dit werk beschrijft de experimentele procedure voor het visualiseren van de innervatie van het extrahepatische galwegstelsel met behulp van een antilichaam tegen neurofilament eiwit. Dit protocol werd aangepast uit het protocol beschreven door Kuratani en Tanaka ^{1 , 2 , 3} .

Bepaal voor dit experiment de tijdlijn voor elk van de experimenten, aangezien de full-mount staining-aanpak 2-3 weken blijft. ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
orthoperiodezuur	Wako	162-00732
papaïne	Wako	164-00172
bovijn serumalbumine (BSA)	Wako	010-15131
natriumazid	Nacalai Tesque	312-33
neurofilament-eiwit (NFP)-antilichaam	Dako	M0762, lot 089, clone: 2F11
peroxidase-geconjugeerd affiniteit-gezuiverd schapen anti-muis IgG-HRP	MBL	Code 330
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)	Wako	349-00903
imidazool	Sigma	I-0125