Toepassing van genetisch gecodeerde Fluorescent stikstofoxide (NO •) Probes, de geNOps, voor real-time beeldvorming van NO • Signalen in afzonderlijke cellen

Samenvatting

Dit manuscript presenteert protocollen voor de toepassing van nieuwe genetisch gecodeerde stikstofmonoxide (NO•) sondes (geNOps) om NO• schommelingen in één cel in real-time te monitoren met behulp van fluorescentiemicroscopie. De Ca²⁺-getriggerde NO• vorming op het niveau van individuele endotheelcellen werd gevisualiseerd door geNOps te combineren met een chemische Ca²⁺ sensor.

Samenvatting

Stikstofoxide (NO •) is een kleine groep, die verscheidene belangrijke cellulaire functies bemiddelt bij zoogdieren, bacteriën en planten. Ondanks het bestaan van een groot aantal werkwijzen voor het detecteren van NO • in vivo en in vitro, de real-time monitoring van NO • bij de enkele-celniveau is zeer uitdagend. De fysiologische of pathologische effecten van NO • worden bepaald door de werkelijke concentratie en de duur van deze radicale wonen. Dienovereenkomstig, methoden die de eencellige detectie van NO • Laat zijn zeer gewenst. Onlangs hebben we uitgebreid de pallet van NO • indicatoren introductie één fluorescerend eiwit gebaseerde genetisch gecodeerde stikstofoxide (NO •) probes (geNOps) die direct reageren op cellulaire NO • schommelingen en derhalve deze behoefte. Hier laten we het gebruik van geNOps intracellulaire NO • signalen in responsie op twee verschillende chemische NO • -liberating moleculen beoordelen. Onze resultaten also bevestigen dat vers bereide 3- (2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino) -N-methyl-1-propaanamine (NOC-7) een veel groter potentieel om veranderingen in intracellulaire NO • niveaus opwekken ten opzichte van de anorganische NO • nitroprussidenatrium (SNP). Bovendien tweekleurige levende cellen beeldvorming met de groene geNOps (G-geNOp) en de chemische Ca2 ⁺ indicator fura-2 werd uitgevoerd met de strakke regulatie van Ca2 ⁺ -afhankelijke visualiseren • NO vorming in één endotheelcellen. Deze vertegenwoordiger experimenten tonen aan dat geNOps zijn geschikte instrumenten om de real-time productie en afbraak van eencellige NO • signalen te onderzoeken in diverse experimentele opstellingen.

Inleiding

We hebben onlangs een nieuwe klasse van genetisch gecodeerde fluorescente NO • probes, zogenaamde geNOps ^1. Deze sensoren bestaan uit een eenvoudig opgebouwd, bacterie-afgeleide NO • bindend domein ^2, dat is geconjugeerd aan een verschillend fluorescerend eiwit (FP) variant ³ (cyaan, groen of oranje FP). NO • binding aan de niet-heem-ijzer (II) in het midden ⁴ geNOps verlaagt direct de fluorescentie-intensiteit ^1. Belangrijk is dat de geNOps fluorescentie herstelt snel en volledig bij het intracellulaire NO • spiegels afnemen ^1. Dienovereenkomstig geNOps mogelijk real-time beeldvorming van (sub) cellulaire NO • schommelingen. Hoewel de NO • sensing mechanisme van geNOps onduidelijk blijven tot nu toe hebben ze bewezen uitstekende NO • verslaggevers zijn, en dus hebben de potentie om het openen van een nieuw tijdperk van polychromatic, kwantitatieve NO • bioimaging met een hoge ruimtelijke en temporele resoluties ^{1, 5.} Andere beschikbare fluorescerende NO • probes gebaseerd op kleine chemische verbindingen, die moeten in cellen worden geladen, en irreversibel gemodificeerd door NO • ^6. Bijkomende nadelen van NO • gevoelige kleine fluoroforen hun mogelijke cytotoxiciteit en relatief lage specificiteit waardoor het moeilijk om ze te gebruiken in een betrouwbare, analytische en afdoende wijze ^{7, 8, 9.} Hoewel de effectieve gebruik van genetisch gecodeerde fluorescente probes vereist efficiënte genoverdracht technieken hebben FP-gebaseerd genetisch gecodeerde sensoren voren als onmisbare hulpmiddelen die ons begrip van de inwendige werking van de cellen ^{10, 11} een revolutie. Voor de ontwikkeling van de interne FP-gebaseerde geNOps, een Förster resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde NO • sensor, aangeduid als NOA-1 ^12, geconstrueerd. Sato et al. ontwierp deze verfijnde probe die bestaat uit twee subeenheden van het NO • -gevoelige oplosbare guanylaatcyclase (sGC), beide geconjugeerd met FRET-gebaseerde sensoren melden cyclisch guanosine monofosfaat (cGMP) niveau ^12. Aangezien deze probe reageert cGMP, alleen indirect detecteert intracellulaire NO • ¹² fluctuaties. Hoewel de NOA-1 reageert op NO • verhogingen van de nano-molaire gebied, deze tool is nog niet vaak gebruikt tot nu toe, waarschijnlijk als gevolg van beperkingen ten aanzien van de beschikbaarheid en bruikbaarheid van deze omvangrijke tweedelige sensor.

Veelzijdige functies van NO •, die van invloed zijn fundamentele biologische processen zijn goed gekarakteriseerd ^{13, 14.} Veel studies aangetoond dat de NO • concentration in cellen en subdomeinen bepaalt lot van de cel in gezondheid en ziekten ^{14, 15, 16.} In zoogdieren, NO • voornamelijk enzymatisch gegenereerd in diverse celtypen door de goed gekarakteriseerde nitric oxide synthase (NOS) gezin ^17. Tot nu toe zijn drie isovormen van NOS beschreven ^{18, 19, 20;} Dit zijn de Ca2 ⁺ / calmoduline-afhankelijke endotheliaal NOS (eNOS of NOS-3) ¹⁸ en neuronaal NOS (nNOS of NOS-1) ^19, en de Ca2 ⁺ / calmodulin-onafhankelijk constitutief actieve induceerbaar NOS (iNOS of NOS- 2) ^20. Het bestaan van mitochondriaal NOS (mtNOS) is ook gesuggereerd ^21. Echter, mtNOS wordt beschouwd als een splicing variant van nNOS en derhalve niet afzonderlijk geclassificeerd als isovorm ^21. Een andere isovorm, behalve die in zoogdiercellen, is de zogenaamde bacteriële NOS (BNOS), vooral in gram-positieve bacteriën ^22. De enzymatische productie van NO • is sterk gecontroleerde en afhankelijk van de beschikbaarheid van verschillende cofactoren zoals nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADPH), flavineadeninedinucleotide (FAD), tetrahydrobiopterine (BH4), moleculaire zuurstof en L-arginine ^17. De kationische aminozuur L-arginine is het substraat dat wordt omgezet in L-citrulline op NO productie • ^17. Naast de sterk gereguleerde enzymatische vorming van NO •, is gepostuleerd dat de groep niet-enzymatisch kan worden teruggebracht van nitriet pools mitochondria onder hypoxische omstandigheden ^23. Zodra NO • wordt geproduceerd in een cel, kan het vrij diffunderen door biomembranen ^14,ref "> 15. De korte halfwaardetijd van deze groep wordt vooral bepaald door de omstandigheden en verschillende paden en chemische reacties efficiënt afbreken NO • niveau ^24. Uiteindelijk, de vorming, diffusie en afbraak van NO • afhangt op verschillende omgevingsparameters waarbij de effectieve concentratie van het biologisch zeer actieve molecuul ²⁴ te bepalen.

De geNOps technologie maakt het mogelijk de directe detectie van (sub) cellulaire NO • fluctuatie ¹ en is daarom geschikt om opnieuw te onderzoeken, en onlangs ontdekt de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de opbouw en afbraak van cellulaire NO • signalen. Hier bieden we eenvoudige protocollen en representatieve resultaten voor het gebruik van geNOps te visualiseren exogeen opgeroepen en endogeen gegenereerde NO • profielen, op het niveau van individuele cellen. Bovendien kan de geNOps techniek worden aangepast voor appassing in andere mobiele model systemen om de complexe patronen van NO • vorming, verspreiding en afbraak in reactie op diverse cellulaire stimuli en spanningen te bestuderen.

Protocol

1. Voorbereiding van het chemisch Buffers en oplossingen

1. Bereid een opslagbuffer bevattende 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM _CaCl2, 1 mM _MgCl2, 10 mM HEPES, 2,6 mM NaHCOs _3, 0,44 mM KH _{2PO 4,} 0,34 mM Na ₂ HPO _4, 10 mM D- glucose, 2 mM L-glutamine, 1 x MEM vitamines, 1x MEM aminozuren, 1% pen strep en 1% amfotericine B. oplossen alle componenten in gedestilleerd water en meng de buffer gedurende 20 minuten met een magneetroerder bij kamertemperatuur. Breng de pH op 7,44 met behulp van 1 M NaOH. Na de druppelsgewijze toevoeging van NaOH, pH gemeten met behulp van een pH meter onder voortdurend roeren.
2. Bereid een fysiologische Ca2 ⁺ -bevattende buffer bestaande uit 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM _CaCl2, 1 mM _MgCl2, 10 mM D-glucose en 10 mM HEPES. Breng de pH op 7,4 met behulp NaOH zoals beschreven in stap 1.1.
3. Bereid een Ca2 ⁺ -vrij buffer die bestaat uit dezelfde ingrediëntenzoals weergegeven in stap 1,2. Met 1 mM EGTA in plaats van 2 mM.
4. Oplosbaar Fura-02:00 in DMSO tot een 1 mM voorraad oplossing te verkrijgen. Aliquot de voorraad oplossing in goed afgesloten flesjes en bewaar bij -20 ° C gedurende maximaal een maand. Indien bevroren, zodat de voorraadoplossing equilibreren bij kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur beschermd tegen licht. Verdun de Fura-2:00 voorraadoplossing in 1 ml opslagbuffer (stap 1,1) tot een uiteindelijke concentratie van 3,3 urn.
5. Bereid 1 ml van een 100 mM histamine voorraadoplossing in gedestilleerd water (pH 7,0). Verdun de 100 mM histamine voorraadoplossing in 100 ml Ca2 ⁺ -bevattende fysiologische buffer tot een eindconcentratie van 100 uM histamine.
6. Oplosbaar Nω-nitro-L-arginine (L-NNA) in 100 ml calcium-bevattende fysiologische buffer tot een eindconcentratie van 300 pM verkregen. Bewaar de oplossingen bij 37 ° C waterbad gedurende tenminste 1 uur totdat de L-NNA volledig opgelost.
7. Oplosbaar 10 mg NOC-7 in gedestilleerd water (pH 7,0) tot een 10 mM voorraadoplossing te verkrijgen. Aliquot de voorraad oplossing in kleine porties in goed afgesloten flesjes en op te slaan onmiddellijk bij -70 ° C. Verdun de NOC-7 voorraadoplossing in een fysiologische buffer tot een eindconcentratie van 10 uM NOC-7 te verkrijgen.
   OPMERKING: NOC-7 is een kleine chemische verbinding die spontaan NO afgeeft met een korte halfwaardetijd. bereiden altijd de werkende buffers die NOC-7 net voorafgaand aan elk experiment bestaat.
8. Maak een oplossing 1 mM natrium nitroprusside (SNP) in een fysiologische buffer calcium en voor te bereiden een 10 uM verdunning.
   OPMERKING: bereid altijd kleine hoeveelheden (~ 10 ml) van NO-donor oplossingen vanwege de snelle afbraaksnelheid.
9. Bereid een fosfaat-gebufferde oplossing (PBS), bestaande uit 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 9,2 mM Na ₂ HPO ₄ en 1,5 mM KH _{2PO 4.} Stel de pH op 7,44 met NaOH / HCl.

2. Celbereiding

LET OP: In oestellen om uniformiteit in de prestatie meten stikstofoxide (NO •) in afzonderlijke cellen met behulp geNOps cellen moeten worden gepreïncubeerd met een ijzer (II) / vitamine C met buffer voorafgaand aan beeldvorming experimenten om Fe ²⁺ herstellen binnen de NO • bindende domein van de NO • -probes. Bij EA.hy926 en HEK293 cellen, incubatie gedurende 20 min met het ijzer (II) booster oplossing leidt tot volledige activatie van de NO • sensors.

1. Seed 5,5 x 10 ⁵ EA.hy926 of HEK293 cellen voor de volgende dag of 3,5 x 10 ⁵ cellen voor de dag na de volgende dag, op 30-mm microscoop dekglaasjes in een putje van een 6-wells plaat. Incubeer cellen bij 37 ° C in een bevochtigde omgeving met 5% _CO2.
   OPMERKING: Gedetailleerde informatie betreffende adenovirale infectie van zoogdiercellen en virusconstructie is beschreven door Zhang et al. ^25. Deze stap geldt niet voor de HEK 293-cellen stabiel tot expressie G-geNOp.
2. Neem foetaal kalfsserum (FCS) en antibiotica vrij Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) en voeg adeno geassocieerde virus type 5 (AAV5) vector die het gen dat codeert voor G-geNOp (MOI: 500 voor EA.hy926-cellen verkregen bijna 100 % positieve cellen; MOI: 1 is efficiënt voor HEK293 cellen).
   LET OP: Het gebruik van adeno-geassocieerde virale vectoren is toegewezen aan risicogroep 2. Biosafety level 2 insluiting is algemeen vereist voor het werken met deze vector. Eventueel kan virusinfectie ook worden uitgevoerd in FCS bevattend medium. Als alternatief kunnen cellen tijdelijk worden getransfecteerd met behulp lipide gebaseerde dragers ^1.
3. Verwijder het kweekmedium en was cellen met voorverwarmde (37 ° C) PBS. Voeg 1 ml DMEM / AAV5 drager van elk putje gedurende 1 uur. Deze stap geldt niet voor de HEK 293-cellen stabiel tot expressie G-geNOp.
4. Voeg 1 ml 20% FCS bevattend DMEM aan elk putje om een ​​uiteindelijke concentratie van 10% FCS. Laat de AAV5-bevattende media niet uit de cellen. Gently wip de plaat aan het medium binnen de putten te homogeniseren. Incubeer cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C in een bevochtigde omgeving met 5% _CO2. Deze stap is niet voor de HEK 293 cellen die stabiel tot expressie G-geNOp.
5. Na 48 uur, was cellen met voorverwarmd PBS. Vervolgens 2 ml voorverwarmde opslagbuffer (1.1) aan elk putje en incubeer cellen bij kamertemperatuur kamertemperatuur gedurende tenminste 1 uur beschermd tegen licht straling.
6. Vervang de opslagbuffer met 1 ml / putje van het ijzer (II) booster oplossing bij kamertemperatuur (RT). Incubeer cellen gedurende precies 20 minuten in het donker.
   LET OP: niet overschrijden of vermindering van de optimale incubatietijd omdat dit de reactie van de NO • sondes kunnen beïnvloeden.
7. Was de cellen eenmaal met opslagbuffer en incubeer elk putje met 2 ml opslagbuffer tenminste 2 uur bij kamertemperatuur, zodat de cellen equilibreren.
8. Vervang de opslagbuffer met 3,3 uM Fura-2:00 in 1 ml opslagbuffer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur, beschermdtegen licht.
9. Was de cellen tweemaal met opslagbuffer en incubeer nogmaals gedurende ten minste 30 min, zodat cellen equilibreren.

3. Live-cell imaging van NO • en Ca ²⁺ Signalen in afzonderlijke cellen

1. Bevestig een 30 mm dekglas gecoat met EAhy.926 of HEK293-cellen (uit stap 2.1) in een metalen perfusie kamer en plaats het op de microscoop. Sluit de instroom tube naar buffer reservoirs en efflux een vacuümpomp. Zorg voor een consistente stroom en te voorkomen dat het aftappen van het deksel slip.
2. Start de zwaartekracht aangedreven perfusie met fysiologische buffer calcium (uit stap 1.2) met een semi-automatische perfusie systeem.
   Opmerking: Een dergelijk systeem bestaat uit bufferreservoirs respectieve buizen, magnetische kleppen die elektronisch worden gestuurd en een vacuümpomp (zie Figuur 1B). Het debiet kan variëren van 1 tot 3 ml / min, afhankelijk van de hoogte van de perfusie reservoirs. Voor een constante lokale drug toepaskation, moet de stroomsnelheid van de gebruikte reservoirs ongeveer gelijk zijn. Deze dienen voor beeldvorming experimenten worden getest. Bedenk dat endotheelcellen reageren op schuifspanning die kan worden geïnduceerd door rigoureuze perfusie toegenomen.
3. Schakel de imaging-systeem en laat de warming-up van alle toestellen gedurende 30 min.
4. imaging-instellingen met behulp van de respectieve software definiëren. Kies een golflengte van 340 nm excitatie en 380 nm voor Fura-2 beeldvorming en 480 nm voor spannende G-geNOp. Te minimaliseren fluorescentie bleken verhoging van de camera binning tot 4 en verminderen excitatie intensiteiten en de blootstelling tijden. Zie ook de stappen 3,6-3,8.
   OPMERKING: Imaging instellingen en parameters zijn afhankelijk van de apparaten die worden gebruikt, Fura-2 laden efficiëntie en G-geNOp expressie niveaus.
5. Selecteer het beeldgebied door het bewegen van de XYZ-tafel van de microscoop tot verschillende fluorescerende cellen in het brandpunt. Vervolgens kunt u hier regio's van belang (ROI) via de betreffende software tool. Teken regio's die verschillende hele single fluorescerende cellen per beeldvorming veld handmatig. Bovendien definieert een achtergrondgebied van vergelijkbare grootte.
   LET OP: Zodra beelden zijn verworven en opgeslagen ROI kan ook opnieuw worden gedefinieerd na de beeldvorming proces voor verdere analyse met behulp van respectieve imaging-analyse software (zie Materials List).
6. Start het verzamelen van gegevens over een omgekeerde en geavanceerde fluorescentiemicroscoop met een gemotoriseerde monster podium, en een monochromatische lichtbron. Afwisselend exciteren bij 340 nm en 380 nm voor Fura-2:00 en 480 nm voor G-geNOp respectievelijk. Stel respectieve belichtingstijden, zodat voor alle kanalen, een duidelijke fluorescentiesignaal detecteerbaar is na verloop van tijd. Zie ook stap 3.4.
   Opmerking: Dit is afhankelijk van de intensiteit van het excitatielicht en de camera binning. Gebruik bijvoorbeeld 15% intensiteit van het excitatielicht, een camera binning van 4 en 150 ms voor 340 nm, 50 ms voor 380 nm en 300 ms voor 480 nm. Zie ook stap 3.4.
7. Verzamel de uitgestraalde licht bij 510 nm voor Fura-2 / uur, 520 nm voor G-Genop het gebruik van een charge-coupled device (CCD) camera met de juiste filter set bestaande uit de 500 nm exciter, een 495 nm dichroic en een 510-520 nm emitter. Record een totale kader om de 3 sec.
8. Noteer de eerste minuut (eventueel maximaal 3 min) in fysiologische Ca2 ⁺ buffer (1,2) naar de basislijn van respectievelijk fluorescentiesignalen verkregen in de tijd.
9. Zodra een stabiele basislijn fluorescentie wordt waargenomen, schakelt aan 100 uM ATP of histamine (1 uM of 100 uM) bevattende fysiologische Ca2 ⁺ buffer om cellen te stimuleren 3 min.
   LET OP: EA.hy926 cellen die reageren op de agonisten vertonen een sterke toename van de Fura-2-ratio (fluorescentie aangeslagen bij 340 nm gedeeld door de fluorescentie aangeslagen bij 380 nm) en een duidelijke afname van de G-geNOp fluorescentiesignaal.
10. Terugschakelen naar de fysiologische Ca2 ⁺ buffer zonder histamine of ATP en L-NNA gedurende 5 minuten om de verbindingen uit de cellen te verwijderen. Deze stap kan worden verlengd tot de FLUOREScentie wijzigingen zijn volledig hersteld.
11. Toedien 10 uM NOC-7 in fysiologische Ca2 ⁺ buffer gedurende 2 minuten met het perfusie systeem. De NO-donor sterke invloed G-geNOp fluorescentie die gewoonlijk afneemt met> 20% in reactie op 10 uM NOC-7. In EA.hy926 cellen NOC-7 werkingsduur ongeveer 3 maal sterker vergeleken met de agonist geïnduceerde G-geNOp fluorescentie-quench.
12. Spoel de NO • -releasing compound voor ongeveer 10 min met een fysiologische Ca ²⁺ buffer en stoppen met opnemen zodra basale fluorescentie wordt teruggewonnen.

4. Data Analysis

1. Export verworven gemiddelde fluorescentie-intensiteit gegevens van enkele cellen in de tijd, naar de data-analyse software.
2. Aftrekken respectievelijke achtergrondwaarden en bereken de verhouding van 340 nm met 380 nm van de respectievelijke fura-2 signalen van elke afzonderlijke cel in de tijd.
3. Trek de achtergrondwaarden van de G-geNOp kanaal naar de werkelijke fl verkrijgenfluorescentie-intensiteit van de NO sonde (F) na verloop van tijd met behulp van een berekening software.
4. Neem basislijn fluorescentie waarden F ₀ (F ₀ is de fluorescentie van de probe NO in de tijd zonder stimulatie). Zie ook stap 4.5 en figuur 1C.
5. Bereken een functie in de tijd voor de fluorescentie bleken effecten met behulp van de volgende vergelijking: F ₀ = F _inital • exp (-K • Time) + F _plateau. F _inital: maximale fluorescentiesignaal eenmaal beeldvorming wordt gestart; K: snelheidsconstante van fluorescentie bleken na verloop van tijd; F _plateau: fluorescentie minimum bereikt door bleken na verloop van tijd; Zie ook de stappen 4.3- 4.4 en figuur 1C.
   LET OP: Voor de aanpassing, kunnen alle fluorescentie waarden over de tijd vóór en na cel stimulatie worden gebruikt. Verdere details worden gespecificeerd door Bentley et al. ^27.
6. Het G-signaal geNOp normaliseren tijd Bereken 1-F / F₀ (Stappen 4,3-4,5). Zie figuur 1C en 1D.

Resultaten

Visualisatie van Single-cell NO • Profiles in reactie op transient Applied NO Donors

We gebruikten een HEK-celkloon die stabiel tot expressie G-geNOp (figuur 1A), teneinde NO • signalen op de enkele cel niveau visualiseren als reactie op twee verschillende NO-bevrijdende kleine chemische verbindingen, NOC-7 en SNP. De NO • donoren werden achtereenvolgens aangebracht op en verwijderd van cellen tijdens beeldvorming met een zwaartekrachtmechanisme perfusie systeem dat continue stroom (Figuur 1B) gewaarborgd. Alle cellen die G-geNOp met verschillende intensiteiten toonden een duidelijke vermindering van fluorescentie in reactie op NOC-7 en SNP (figuur 1C), wat aangeeft fast NO • accumulatie in cellen na toevoeging van de NO • donoren. De genormaliseerde fluorescentie-signalen (1-F / F ₀₎ toonde aan dat zowel NO • donoren opgeroepen homogene cellular NO • verhogingen die volledig hersteld na uitwassen van de NO • -releasing verbindingen (figuur 1D). Echter, 10 uM SNP induceerde slechts 50% van de cellulaire NO • signaal (9,63 ± 1,05%, n = 3/38), die werd bereikt met 10 uM NOC-7 (18,10 ± 1,20%, n = 3/38, p < 0,0001). Om een gelijke intracellulaire NO • niveaus met zowel NO • donoren, een concentratie van 1 mM van SNP nodig was (figuren 1C, 1D) te bereiken.

Vervolgens testten we de capaciteit van vers bereide versus verlopen NOC-7 intracellulaire NO • niveaus verhogen in HEK cellen. Hiervoor hebben we vier experimentele bereid buffers bevattende 5 pM NOC-7. De NO • donor opgeteld pas vlak voor de meting, of binnen reservoirs bewaard gedurende 1 uur, 2 uur en 3 uur bij kamertemperatuur geroerd vóór de meting. De verschillende buffers werden achtereenvolgens aangebracht op en verwijderd from de G-geNOp expressie brengende cellen met een perfusie systeem (figuur 2B). Deze benadering onthulde de stabiliteit van waterige oplossingen NOC-7 die, zoals verwacht, vertoonden verminderde capaciteit voor de tijd te verheffen intracellulaire NO • niveaus (Figuren 2A, 2C). Interessant NO • signalen aanzienlijk sneller hersteld na het verwijderen van verlopen buffers, in vergelijking met de intracellulaire NO • reactie die werd opgewekt door verse NOC-7 (Figuur 2C), wat een indicatie hechting van het intacte NO • -liberating moleculen aan celcomponenten .

Gelijktijdig Visualisatie van Ca ²⁺ en NO • Signalen in de Single endotheelcellen

Om Ca ²⁺ studeren -triggered NO • vorming in endotheelcellen, de meest gebruikte endotheliale onsterfelijk gemaakte cel-surrogaat, EA.hy926 cellijn, was transiently getransfecteerd met G-geNOp en geladen met Fura-2 / AM (zie Protocol 2.8). Transfectie leverde ongeveer 10% van G-geNOp positieve endotheelcellen (n = 6, figuur 3A), wat voldoende is om Ca2 ⁺ opname -evoked NO • productie op het niveau van afzonderlijke endotheelcellen. Maar we bereikt bijna 100% G-geNOp positieve EA.hy926-cellen met behulp van een adeno-geassocieerde virale vector (n = 6; zie Protocol 2,2). Vóór multichannel metingen werden cellen geïncubeerd gedurende 20 min bij kamertemperatuur in opslagbuffer bestaande L-NNA, een krachtige onomkeerbare NOS-inhibitor ^26. Controlecellen werden op dezelfde opslagbuffer bewaard zonder L-NNA (zie Protocol 1,1) (Figuur 3B). Behandeling van controlecellen met histamine, een krachtige inositol 1,4,5-trifosfaat _(IP3) -generating agonist, direct verhoogde cytosolische Ca2 ⁺ niveaus gevolgd door een geleidelijke toename van intracellulaire NO • tot de agonist was removed (figuren 3C, 3D). Cellen voorbehandeld met de NOS-remmer toonde vergelijkbare cytosolische Ca2 ⁺ signalen, terwijl het intracellulaire NO • niveau vrijwel onaangetast als reactie op histamine (figuur 3E) bleef. EA.hy926-cellen die G-geNOp werden behandeld met 1 uM en 100 uM van de _IP3 -generating agonist ATP om te testen of geNOps geschikt om NO • signalen in reactie controleren om zowel lage fysiologische en supra-fysiologische concentraties van een agonist (Figuur 3F). In de endotheelcellen lijn 1 uM ATP opgeroepen een duidelijke cytosolische NO • signaal, waarvan ongeveer de helft was van het signaal dat wordt verkregen door 100 uM ATP (Figuur 3F).

Figuur 1: Intracellulair NO profielen in reactie op verschillende NO-Liberati ng moleculen. (A) Breed beelden van HEK cellen die stabiel tot expressie cytosolische G-geNOp. Schaal bar = 20 micrometer. (B) Schematische weergave van een zwaartekracht gebaseerde half-automatische perfusie-systeem voor de gecontroleerde toepassing en verwijdering van NOC-7 en SNP. (C) Representatieve (uit 3 onafhankelijke experimenten) niet-genormaliseerde eencellige fluorescentie-intensiteit sporen in willekeurige eenheden uitgezet tegen de tijd van HEK cellen die stabiel tot expressie cytosolische G-geNOp reactie op 10 uM NOC-7, 10 uM SNP en 1 mM SNP. Gewaagd curve geeft de gemiddelde curve van 26 single-cell sporen (lichtgrijze curves). Gestippelde kromme vertegenwoordigt F _0, dat werd toegepast voor normalisatie. (D) De genormaliseerde en omgekeerde enkele sporen (1-F / F _0, lichtgrijs bochten) en gemiddelde kromme (dikke zwarte lijn) in de tijd in reactie op 10 uM NOC-7, 10 uM SNP en 1 mM SNP onttrokken paneel C.es / ftp_upload / 55486 / 55486fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Stabiliteit test van NOC-7 met behulp van stabiel G-geNOp tot expressie HEK cellen. (A) Vertegenwoordiger NO • concentratie response curve in de tijd van stabiel G-GeNOps tot expressie HEK cellen bij toepassing van verse en oude NOC-7 bufferoplossingen. Alle NOC-7 bevattende buffers werden aanvankelijk bereid met een uiteindelijke concentratie van 5 uM met dezelfde stockoplossing (50 mM). De doorlooptijd van de respectieve oplossingen na bereiding tot beeldvorming bedraagt ​​1 uur, 2 uur en 3 uur zoals aangegeven. (B) Schematische weergave van een zwaartekracht gebaseerde half-automatische perfusie systeem om achtereenvolgens toevoegen en verwijderen van NOC-7 bevattende oplossingen tijdens de beeldvorming. (C) Temporele correlatiescellulaire NO • signalen in reactie op de vers bereid en oud NOC-7 buffers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Gelijktijdig meerkanaals beeldvorming van NO • en Ca ²⁺ signalen in één EA.hy926 cellen. (A) Representatieve wide-field fluorescentie afbeeldingen EAhy.926 cellen die G-geNOp (linker paneel) die worden geladen met fura-2 / AM (middelste en rechter panelen). Schaal bar = 20 micrometer. (B) Schematische weergave van de behandeling van EAhy.926 cellen met 500 pM Nω-nitro-L-arginine (L-NNA) gedurende 20 min in een zes-puts plaat vóór de meting. (C) Vertegenwoordiger tijdsverloop van een gelijktijdige record van Fura-2 (excitatie: 340 nm / 380 nm Emission: 510 nm) en G-signalen geNOp (excitatie: 480 nm, emissie: 520 nm) als reactie op histamine 100 uM. Zoals aangegeven histamine werd na 3 min met behulp van een perfusie systeem. (D) Curves vertegenwoordigen simultane opnames van cytosolische Ca ²⁺ (Fura-2-ratio signalen F ₃₄₀ / F ₃₈₀ is grijs doorgetrokken lijn) en NO • (genormaliseerd en omgekeerde curve, 1-F / F ₀ is groen doorgetrokken lijn) signalen na verloop van tijd van een enkele Fura-2 / aM geladen endotheelcellen transient tot expressie G-geNOp. Cellen werden gestimuleerd met 100 uM histamine gedurende 3 minuten in een Ca2 ⁺ (2 mM CaCl ₂₎ bevattende buffer (n = 8/3). (E) Vertegenwoordiger simultaan opgenomen Ca ²⁺ (grijze doorgetrokken lijn) en NO • (groene ononderbroken lijn) signalen in de tijd van een EA.hy926 cel die werd voorbehandeld met 500 uM Nω-nitro-L-arginine (L-NNA) voorafgaand meting (n = 12/3). Cellen werden behandeld met 100 uM histamine bij aanwezigheid van 2 mMCa2 ^+. (F) Gemiddeld een grafiek van cytosolische NO • signalen in reactie op 1 uM ATP, gevolgd door een tweede cel stimulatie met 100 uM ATP. Bars vertegenwoordigen gemiddelde waarden ± SD van de maximale G-geNOp signalen in reactie op 1 uM ATP (witte balk) en 100 uM ATP (groene balk) van 4 onafhankelijke experimenten; p <0,001 vs. 1 uM ATP. P-waarde berekend onder toepassing van een ongepaarde t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Sinds de ontdekking van NO • een belangrijk signaalmolecuul in de biologie ^28, heeft de real-time meting van de groep in afzonderlijke cellen, weefsels en hele dieren met een hoge resolutie op een haalbare en betrouwbare wijze wordt nagestreefd. Hier melden wij de toepassing van recent ontwikkelde genetisch gecodeerd fluorescerende NO • probes (geNOps), die exact in staat live-cell imaging van NO • signalen met behulp van wide-field fluorescentie microscopie ^1.

Om ingewikkelde en invasieve transfectie procedures te omzeilen HEK cel kloon die stabiel uitdrukt green fluorescent G-geNOp werd gebruikt voor het kwantificeren van exogeen geproduceerde single-cell NO • profielen. Zoals HEK cellen normaliter niet NO • endogeen ²⁹ produceren, dit celtype geschikt voor het genereren van een geNOp-gebaseerde sensor cellijn, die nuttig zijn voor vele andere toepassingen in co-kweekomstandigheden misschienmet NO • het produceren van primaire cellen of zelfs in levende dieren ^30. In deze studie demonstreren we het vermogen van diverse NO • -liberating verbindingen, verschillende concentraties en stabiliteiten, intracellulaire NO • signalen roepen met de G-geNOp expressie brengende HEK celmodel. Onze gegevens is de NO • -donor concentratie kwaliteit en toepassingsmethode uiteindelijk de patronen van intracellulaire NO • profielen bepalen. Dergelijke informatie is onmisbaar voor de in situ farmacokinetische karakterisering van verschillende NO • donoren, die indicatief zijn voor verschillende ziekten zijn. Met name zijn geNOps aangetoond om stabiel te reageren op meerdere herhaalde toepassingen van NO • -donor pulsen gedurende een zeer lange tijd ^1. Bijgevolg heeft de experimenten met NO • -liberating verbindingen die hierin gepresenteerd, laat semi-kwantitatieve conclusies over de verschillende amplitudes en kinetiek van de respectieve cellulaire NO226; signalen (figuren 1 en 2).

Hoewel de stabiele wijze HEK-cel kloon waarschijnlijk uit een enkele cel, werd een brede heterogeniteit van G-geNOps expressieniveaus waargenomen (figuur 1). Dit is een algemeen kenmerk van stabiele celklonen de transcriptie van het (-genoom geïntegreerd) gen van belang onder de controle van veel factoren, zoals diverse omgevingsstress ³¹ dat celgroeisnelheden ³² beïnvloeden en de celcyclus status van ^33. De single FP-gebaseerde geNOps niet-ratiometrische probes en dus de NO • geïnduceerde verlies van fluorescentie-intensiteit toeneemt met de geNOp expressieniveau ^1. Dienovereenkomstig normalisatie van de geNOps signalen essentieel voor het kwantificeren van cellulaire NO • signalen vooral bij een vergelijkende analyse. Zoals getoond in onze recente studie, strikt lineaire correlatie between de basale fluorescentie-intensiteit van geNOps en de sterkte van de NO • geïnduceerde fluorescentie quenching over een breed scala van fluorescentie-intensiteiten gevonden ^1. Dit is een belangrijk kenmerk van geNOps voor de absolute kwantificering van cellulaire NO • signalen. Zoals getoond in figuur 1, normalisatie van de G-geNOps signalen in responsie op NOC-7 en SNP bleek homogeen NO • signalen in verschillende HEK cellen van dezelfde plaat, wat aangeeft dat HEK cellen niet verschillend met betrekking tot hun vermogen te nemen en degraderen de NO • radicaal dat afkomstig is van de NO • donor. Daarentegen gebruiken geNOps in HeLa-cellen toonde duidelijke heterogeniteit van cellulaire NO • signalen tussen verschillende cellen in reactie op NOC-7. Deze verschillen wijzen op celtypespecifieke NO • metabolisme en afbraaksnelheden, die meerdere gevolgen celfysiologie en pathologie hebben, en kunnen worden ontdekt met behulp van de geNOps-technologie.

Niettemin twee belangrijke kenmerken van geNOps moeten zorgvuldig de juiste gebruik van de sensoren en data interpretaties beschouwd: i) geNOps hebben voldoende ijzer (II) om volledig aan NO • ¹ en ii) afhankelijk van de FP variant geNOps kan zijn pH-gevoelige ^1. Hier beschrijven we een protocol dat geschikt is bevonden voor toxische ijzer (II) aanvulling van geNOps die worden uitgedrukt in HEK, HeLa-cellen of EA.hy926 (zie protocol 2,6) te zijn. Terwijl is aangetoond dat cellen behandeld met ijzer (II) / vitamine C had geen invloed op celmorfologie, cel levensvatbaarheid en metabolische activiteit van cellen ^1, kan het noodzakelijk om deze belangrijke stap voor andere celtypen en weefsels optimaliseren. In bepaalde experimentele omstandigheden, de eis van ijzer (II) geladen kan de toepasbaarheid van geNOps beperken. Met name is gebleken dat ascorbaat N kan verminderenO • ³⁵ ascorbaat en ijzer (II) complexen kunnen vangen NO • ^{36, 37.} Bovendien kan overtollige ijzer (II) ascorbaat en ontstekingsreacties ³⁹ en loskoppelen eNOS ⁴¹ induceren. Dergelijke effecten moeten worden overwogen bij gebruik van de geNOps technologie. Er is aangetoond dat onder bepaalde experimentele omstandigheden, de intracellulaire pH wordt beïnvloed significant ^34, die het potentieel om de fluorescentie geNOps ¹ invloed heeft. Met name de cyaan en groene geNOps varianten relatief pH-gevoelige afname laat zien van fluorescentie na aanzuring ^1. Vandaar misschien acute veranderingen in de (sub) cellulaire pH simuleren valse NO • signalen bij gebruik van de pH-gevoelige geNOps. Zoals voorgesteld in ons eerdere werk, de parallelle gebruik van NO • ongevoelig geNOps (geNOps ^mut) als negatief controls is aan te raden om te ontleden echte cellulaire NO • signaal van pH overstappen ^1. Bovendien kan de cellulaire pH-wijzigingen worden geïnspecteerd door pH-sondes zoals Sypher ^34.

Verder gevisualiseerd we de endogene enzymatische NO • vorming in reactie op een fysiologische Ca2 ⁺ -mobilizing agonist in de endotheelcellen surrogaat EA.hy926. De EA.hy926 cellijn is een veelgebruikte modelsysteem consequent uiting van eNOS ^38. Het gebruik van geNOps tijdelijk tot expressie gebracht in EA.hy926 cellen, bevestigde dat _{IP-3-gemedieerde} Ca ²⁺ signalen roepen diepe NO • vorming in dit type cel, die bijna volledig werd geblokkeerd door L-NNA. Om tijdelijk correleren Ca ²⁺ met NO • signalen werden G-geNOp expressie cellen opgeladen met het UV-prikkelbaar chemische Ca ²⁺ -indicator Fura-2 / uur. De spectrale scheiding van de Ca ²⁺ gebonden en ongebonden Fura-2 fluo cerend van de G-geNOp signaal kan gemakkelijk worden bereikt met in de handel verkrijgbaar filter sets ^40. Beeldvorming beide probes onthulde dat de Ca2 ⁺ -triggered enzymatische NO • vorming komt veel trager in vergelijking met de cytosolische Ca2 ⁺ stijging van dit type endotheelcellen. Soortgelijke kinetiek van eencellige NO • signalen endotheelcellen van runderen longslagader bij celtherapie met de _IP3 -generating agonist bradykinine, en schuifspanningen gemeld middels NOA-1, een indirecte sterk NO • -gevoelige sensor ¹² . Dienovereenkomstig, deze gegevens benadrukken dat de Ca ²⁺ -evoked eNOS afgeleide NO • formatie vereist een zekere starttijd totdat het volledige enzymatische activiteit is bereikt. Hoewel de kinetiek van cellulaire NO • vorming, diffusie en afbraak kan worden gewonnen uit andere gegevens, zoals spanning metingen van NO • geïnduceerde relaxatie verblijfss = "xref"> 26, het grote voordeel van fluorescente NO • probes is dat ze direct omzetten cellulaire NO • fluctuaties in zichtbare signalen in real-time. Vandaar beeldvorming cellulaire NO • signalen geNOps biedt een hoge ruimtelijke en temporele resolutie, en biedt unieke mogelijkheden in (her) onderzoek naar de (sub) cellulaire NO • homeostase. Bijvoorbeeld beeldvorming eNOS pendelen ⁴² in combinatie met de technologie geNOps één endotheelcellen zou geschikt NO • formatie met de subcellulaire lokalisatie en translocatie van het NO • producerende enzym of andere relevante eiwitten zoals calmoduline en caveolin ⁴³ correleren zijn.

Hier beschrijven we de haalbaar toepassing van G-geNOp expressie HEK en EA.hy926 cellen exogeen visualiseren en endogeen geproduceerde cellulaire NO • signalen op de single-celniveau en in real-time een conventionele breed fluorescentie microscope. Onze gegevens impliceren dat geNOps geschikt zijn om specifiek te volgen (sub) cellulaire NO • dynamiek onder verschillende experimentele omstandigheden met behulp van allerlei interessante celtypen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
NaCl	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	3957.20	natriumchloride
KCl	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	6781.1	kaliumchloride
CaCl2·2H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	T885.1	calciumchloride dihydraat
MgCl2·6H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	2189.2	magnesiumchloride hexahydraat
HEPES	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	9105.3	4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
NaHCO3	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8551.1	natriumwaterstofcarbonaat
KH2PO4	Merck, Darmstadt, Germany	104873	kaliumdiwaterstoffosfaat
Na2HPO4·2H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	4984.1	natriumwaterstoffosfaat dihydraat
D(+)-Glucose monohydrate	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	6780.1	>99,5%; voor celcultuur, endotoxine vrij
EGTA	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	3054.2	ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N⁠,⁠N⁠,⁠N⁠′⁠,⁠N⁠′⁠-tetraazijnzuur; calciumchelerend middel
NaOH	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	6771.1	natriumhydroxide
HCl	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	4625.1	zoute zuren, 37% (~10 N)
DMSO	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	4720.1	dimethylsulfoxide;  zeer polair, aprotisch organisch oplosmiddel
L-Glutamic acid hydrochloride	Sigma Aldrich, Vienna, Austria	G2128	(S)-2-Aminoglutaric acid
DMEM, low glucose	Sigma Aldrich, Vienna, Austria	D5523	Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose; met 1.000 mg/L glucose en L-glutamine, zonder natriumbicarbonaat, poeder, geschikt voor celcultuur
MEM Vitamin solution (100x)	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11120037	100x de vitaminen gevonden in het standaard Minimum Essential Medium (MEM)
MEM Amino acids solution (50x)	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11130036	50x de essentiële aminozuren (behalve L-glutamine) gevonden in het standaard Minimum Essential Medium (MEM)
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15140122.00	antibiotica om bacteriële besmetting van celculturen te voorkomen
Amphotericin B	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15290026.00	Gibco Amphotericin B bevat 250 µg amphotericin B (Fungizone) en 205 µg natriumdeoxycholaat; voorkomt de besmetting van celculturen door gist en meercellige schimmels
FCS	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270106	Fetaal Runderserum, gekwalificeerd, EU-goedgekeurd, Zuid-Amerikaanse oorsprong
PBS, pH 7.4	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10010031.00	fosfaat-gebufferde zoutoplossing
Fura-2 (AM)	Teflabs, Austin, TX, USA	102	fluorescente cytosolische calcium indicatoren
Histamine dihydrochlorid	Sigma Aldrich, Vienna, Austria	H7250	2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-genererende agonist
Nω-Nitro-L-arginine	Sigma Aldrich, Vienna, Austria	N5501	N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA;  remmer van nitric oxide synthase
NOC-7	Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany	487952	3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; stikstofmonoxide (NO) donor met korte halfwaardetijd van NO-afgifte
Sodium nitroprusside dihydrate	Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA	sc-203395A	natriumnitroferricyanide(III) dihydraat; stikstofmonoxide afgifte compound
30 mm Cover slips	Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany	41001130	glazen dekglas, HECHT "Assistent", maat 1, rond, 30 mm, (VE: 100 stuks.)
Iron(II) booster solution	Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria	n.a.	Iron(II) bevattende fysiologische buffer voor niet-toxische iron(II) belasting van cellen;  http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/
G-geNOp plasmid	Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria	n.a.	plasmid DNA coderend voor groene NO gevoelige sonde (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product/g-genop/
G-geNOp AAV5	Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria	n.a.	adenovirus coderend voor groene NO gevoelige sonde (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/
G-geNOp sensor cell line	Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria	n.a.	menselijke embryonale niercellijn (HEK293) die stabiel de groene NO gevoelige sonde (G-geNOp) tot expressie brengt;  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/
HEK293A cell line	Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	R70507	subclone van menselijke embryonale niercel