Methodenartikel

Kwantificering van Endosome en Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

7.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55488

⸱

22 mei 2017

 ,  ,  , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2PhD Program in Human Biology, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba, 3Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance (TARA), University of Tsukuba

In dit artikel

Samenvatting

Het onderzoek naar membraanhandel is cruciaal voor het begrijpen van neuronale functies. Hier introduceren we een methode voor het kwantificeren van vesikelmotiliteit in neuronen. Dit is een handige methode die kan worden aangepast aan de kwantificering van membraanhandel in het zenuwstelsel.

Samenvatting

In de hersenen spelen membraanhandelstelsels belangrijke rol bij het reguleren van neuronale functies, zoals neuronale morfologie, synaptische plasticiteit, overleving en glialocommunicatie. Tot op heden hebben tal van studies gemeld dat defecten in deze systemen verschillende neuronale aandoeningen veroorzaken. Zo kan het begrijpen van de mechanismen die de vesiceldynamiek onderbouwen, invloedrijke aanwijzingen verschaffen die kunnen helpen bij de behandeling van meerdere neuronale stoornissen. Hier beschrijven we een methode voor het kwantificeren van vesikelmotiliteiten, zoals de beweeglijkheidsafstand en de snelheid van beweging, met behulp van een software plug-in voor het ImageJ-platform. Om afbeeldingen te verkrijgen voor kwantificering merken we neuronale endosoom-lysosoomstructuren met EGFP-getagde vesikelmarkerproteïnen en observeerde de beweging van blaasjes met behulp van een tijdverloopmicroscopie. Deze methode is zeer nuttig en vereenvoudigt het meten van vesikelmotiliteit in neurieten, zoals axonen en dendrieten, evenals in de som van beide neuronen en gliacellen. FurthermoOpnieuw, deze methode kan worden toegepast op andere cellijnen, zoals fibroblasten en endotheliale cellen. Deze aanpak zou een waardevolle bevordering kunnen bieden van ons begrip van membraanhandel.

Inleiding

Een nauwkeurige controle van endosoom-lysosoomhandel is onontbeerlijk voor het reguleren van de neuronale functie. Met name de dynamische bewegingen van deze blaasjes zijn een belangrijke factor die de regulatie van neuronale morfologie, ontwikkeling en overleving onderstreept. Gebreken in dit systeem veroorzaken ernstige neuronale aandoeningen 1 , 2 . De moleculaire mechanismen die vesicale handel in neuronale aandoeningen vormen, worden beschouwd als ingewikkeld, en meerdere groepen hebben geprobeerd deze relevantie te onderzoeken. Er is bijvoorbeeld gemeld dat versteurde late endosomotiliteit significant is geassocieerd met Niemann-Pick C-ziekte 3 , een geërfde neurodegeneratieve stoornis veroorzaakt door lysosoomdefecten. Een ander voorbeeld is een mutatie in een lysosomaal Ca 2+ kanaal, trpml 1, waardoor de lysosomale motiliteit wordt aangetast, wat resulteert in lysosomale opslagziekten 4 , 5 , 6 . Onze groep heeft gemeld dat dysregulatie van PtdIns (3,5) P 2 omzet de endosome en lysosome motiliteit in neuronen onderdrukt, wat leidt tot een toename van de kwetsbaarheid voor de stressrespons 7 , 8 . De metabolische regulering van PtdIns (3,5) P 2 , die meestal lokaliseert op late endosomen en lysosomen, speelt een belangrijke rol in een grote verscheidenheid aan cellulaire functies, waaronder vesikelhandel en fusie-splitsingsprocessen 9 , 10 . Aangezien de verminderde PtdIns (3,5) P 2 omzet ernstige neurodegeneratie 11 , 12 veroorzaakt , kan de afwijkende regulatie van endosome-lysosoommotiliteit een belangrijke factor zijn voor het begrijpen van de pathogenese van neurodegeneratie. Een onderzoek naar de moleculaire mechanismen die de vesicale motiliteit ten grondslag liggen, kunnen dus veelbelovende aanwijzingen verschaffen die onze unde kunnen verdiepenOpstanding van meerdere neuronale stoornissen.

In dit artikel introduceren we een waardevolle methode om de vesicale motiliteit in neuronen te kwantificeren met behulp van een gratis softwarepakket met de handmatige tracking. Het doel was om een ​​snelle kwantificeringsmethode te ontwikkelen om vesikelmotiliteit te analyseren. Deze kwantificering is gericht op een standaardaanpak van het klikken op een referentiepunt in elk frame van een time-lapse film. Het gebruik van de Manual Tracking-software maakt deze aanpak vrij eenvoudig en van groot nut, in tegenstelling tot andere applicaties. Bovendien is deze aanpak ook van toepassing op andere cellen, zoals glialcellen. Hoewel deze methode primitief is, kan deze toegepast worden op verschillende analyses, waaronder cellulaire motiliteit en morfologische verandering. Bijvoorbeeld, na het definiëren van een referentiepunt over een reeks afbeeldingen, kan informatie over de posities van de referentiepunten en de tijd in elke positie worden geëxtraheerd uit sequentiële beelden met behulp van data analyse en beeldverwerking zachtware. Samenvattend is deze methode eenvoudig maar krachtig en draagt ​​bij aan de ontwikkeling van verbeterde efficiëntie in studies op basis van membraanhandel, zoals die van endosoom-lysosoomfunctie onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd met goedkeuring van de Universiteit van Tsukuba Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Dissectie

  1. Om embryonale dag 13-14 ICR- of C57BL / 6-foetussen voor te bereiden, euthaniseren zwangere muizen door cervicale dislocatie. Verwijder de baarmoeder en zet het in een petrischaal met Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Spoel het goed om het bloed te verwijderen.
  2. Met behulp van pincet, overdragen de baarmoeder naar een nieuwe petri schotel met 70% ethanol om te steriliseren.
  3. Breng de baarmoeder over naar een nieuwe petrischotel met HBSS. Verwijder de foetussen uit de baarmoeder met behulp van gesteriliseerde dissecterende tang en chirurgische schaar.
  4. Decapiteer de foetussen met behulp van een chirurgische schaar. Plaats ze in een nieuwe petrischotel met HBSS.
  5. Verwijder de huid en de schedel en haal de hersenen uit met behulp van gesteriliseerde dissecterende tang. Zet ze in een petri schotel met HBSS.
    OPMERKING: Uit deze stap is het best om de procedure op een schone manier uit te voerenbank.
  6. Verwijder de meninges met behulp van gesteriliseerde dissecterende tang onder een stereomicroscoop. Knip de basale ganglia, hippocampus en cerebellum af met behulp van tang. Met behulp van gebogen tippennen, breng de cortices over naar een nieuwe petrischotel met HBSS.
  7. Verzamel alle cortices met een wegwerpdrupper of een 25 ml pipet. Zet ze in een 15 ml buis en verwijder de HBSS door pipettering.
  8. Voeg 3 ml cerebrale corticale enzymoplossing toe aan de buis die de cortices bevat. Zet deze buis in een waterbad en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: Bereid een cerebrale corticale cultuurenzym bestaande uit fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) met 0,25% trypsine en 1 mM EDTA. Steriliseer met een 0,22 μm filter.
  9. Voeg nog eens 3 ml cerebrale corticale enzymoplossing toe in de buis die de cortices bevat en incubeer gedurende 37 minuten bij een extra 5 minuten bij 37 ° C in een waterbad.
  10. Verwijder de cerebrale corticale enzymoplossing met een 5 ml pipet en voeg 5 ml Dulbe toeCco's gemodificeerde Eagle Medium (DMEM) die 10% foetale boviene serum (FBS) bevat.
  11. Dissocieer de cortices door zachtjes te pipetteren op en neer met een 5 ml pipet met een steriele P1000 tip. Pipette opnieuw met een 5 ml pipet met een P200 tip.
  12. Zet een 40 μm nyloncelfilter op een 50 ml buis en filter de suspensie om de puin te verwijderen.
  13. Centrifugeer bij 420 xg gedurende 5 min bij RT en verwijder daarna het DMEM-medium.
  14. Voeg 5 ml cerebrale corticale kweekmedium toe en verwijder de celpellet voorzichtig.
    OPMERKING: Bereid een cerebrale corticale kweekmedium bestaande uit basaal-basisch neuron aangevuld met 1x B-27 supplementen, 2 mM L-glutamine en 100 U / ml penicilline streptomycine.
  15. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en stel de celconcentratie (zoals gewenst) aan met behulp van het cerebrale corticale kweekmedium.
  16. Plaat 3,0 × 10 6 corticale neuronen in 2,0 ml per gecoate 35 mm glasbodem.
    OPMERKING: Voordat u plateren, bedek de35mmm glasbodemschotels met 0,1 mg / ml Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) of 0,01% Poly-L-Ornithine (PLO). Incubeer gedurende 3 uur - O / N bij 37 ° C en was minstens 3x met PBS.

2. Imaging Vesicle Motility

  1. Bereid de plasmiden die elk type vesikel zullen labelen. Gebruik bijvoorbeeld EGFP-Rab5 voor vroege endosomen, EGFP-Rab7 voor late endosomen, LAMP-EGFP voor lysosomen en EGFP-LC3 voor autofagosomen 8 , 13 .
    OPMERKING: Deze plasmiden zijn op aanvraag verkrijgbaar bij tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. Typisch kunnen 3 -5 dagen in vitro (DIV) neuronen worden getransfecteerd met deze plasmiden onder toepassing van transfectie reagentia.
  2. Meng 4,0 μg plasmiden met 200 μl serumvrij medium door pipettering. Verdun in een aparte buis 8 μl transfectie-reagens (zie tabel van materialen ) in 200 μl serumvrij medium. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
  3. Meng de plasmideoplossing en transfectie regent oplossing in stap 2.2 door pipettering. Incubeer gedurende 20 minuten bij RT.
  4. Voeg serumvrij medium en 400 μl van de plasmideoplossing van stap 2.3 toe aan elke bedekte glasbodemschotel. Incubeer de neuronen bij 37 ° C in een 5% C02 incubator gedurende 30 minuten. Vervang het medium met 2 ml cerebrale corticale kweekmedium. Incubeer de neuronen bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator gedurende 1-2 dagen.
  5. Selecteer na 1 - 2 d transfectie de getransfecteerde cellen voor beeldverzameling.
    OPMERKING: Prematuur neuronen minder dan 7 DIV hebben de neiging om dynamische vesikelmotiliteit te tonen. Selecteer neuronen die de fluorescentie sonde matig uitdrukken, omdat duidelijke afbeeldingen niet kunnen worden verkregen wanneer een zeer expressieve neuron is geselecteerd. Selecteer ook een typische neuronale vorm, zoals pyramidale neuronen, die lange axonen en ingewikkelde dendrieten hebben, om het identificeren van de axon en dendrieten te vergemakkelijken (zie figuur 1A).
  6. Beeldverwerving met behulp van een time-lapse beeldvormingssysteem:
    Voor beeldvorming, gebruik een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een CCD-camera (CCD) met 40x Plan Apo 0.95NA of 100X Plan Apo VC NA1.4 objectieve lenzen. Controleer de temperatuur bij 37 ° C met behulp van een incubatie systeem. Verkrijg neuronbeelden in één frame / 5 s gedurende een periode van 100 seconden, gecontroleerd door de beeldverwervingssoftware. Als alternatief kunt u afbeeldingen op kortere intervallen en voor langere perioden verkrijgen, zoals bij één frame per 2 s over een periode van 300 seconden.
    OPMERKING: Er zijn verschillende applicaties beschikbaar voor het nemen van opeenvolgende beelden, waarvan veel geschikt zijn voor deze methode. Daarom wordt geen speciale toepassing aanbevolen; In plaats daarvan moet elke onderzoeker gebruiken welke applicatie beschikbaar is.

3. Beeldanalyse

  1. Open alle sequentiële afbeeldingen in ImageJ-software met Manual Tracking 14 .
    OPMERKING: Tot op heden is Manual Tracking wiDely gebruikt bij het bijhouden van experimenten 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Manual Tracking is ontwikkeld door Dr. Fabrice Cordelières. Gedetailleerde schriftelijke instructies zijn online beschikbaar 20 . Voor de analyse wordt de kwaliteit van de beeldgegevens verbeterd met een voldoende aantal afbeeldingen. Het wordt aanbevolen om meer dan 20 beelden te gebruiken.
  2. Om de sequentiële afbeeldingen te combineren, kiest u → → . Klik op .
  3. Kies → ; Een tracking venster zal verschijnen.
  4. Klik op het selectievakje En bepaal de trackingparameters in het parametersectie.
    OPMERKING: Er kunnen verschillende parameters worden ingesteld, inclusief tijdsinterval, x / y-kalibratie, z-kalibratie, zoekgrootte voor het middenIng, puntgrootte, lijnbreedte en lettergrootte. In deze vereenvoudigde analyse werden zowel tijdsinterval als x / y-kalibratie gedefinieerd. Onder andere experimentele omstandigheden kan het ook nodig zijn om andere parameters te definiëren. De hier gebruikte parameters zijn: de is 5 s en de is 0,26642 μm voor een objectieflens van 40X Plan Apo 0.95NA of 0.10657 μm voor een 100X Plan Apo VC NA1.4 objectieve lens.
  5. Nadat de parameters zijn gedefinieerd, klikt u op om een ​​nieuw nummer te starten.
  6. Nadat u de blaasjes van belang hebt vastgesteld (bijvoorbeeld de blaasjes aangegeven door blauwe en rode pijlpunten in figuur 1A (rechter paneel)), klikt u op het midden van de signalen in de opeenvolgende afbeeldingen om de xy-coördinaten op te nemen. De resultaten van de opgenomen xy-coördinaten, afstand en snelheid worden weergegeven in een nieuw venster.
    OPMERKING: In het geval van lysosomen kunnen grote, fel fluorescerende signalen ( bijv. FigUur 1A (rechter paneel), oranje pijlkop) worden vaak waargenomen in neuronen. Aangezien deze signalen soms geaccumuleerde blaasjes of pathologische varicositeiten vertonen, dienen deze signalen te worden vermeden om de beweeglijkheid te kwantificeren.
  7. Herhaal stap 3.6 om de xy-coördinaten van blaasjes te verzamelen van alle sequentiële afbeeldingen; Elke afbeelding wordt automatisch doorgevoerd naar het opeenvolgende beeld nadat het referentiepunt is geselecteerd.
  8. Exporteer deze gegevens naar een nieuwe tabel (bijvoorbeeld een spreadsheet). Gebruik een geschikte software om een ​​geschikte grafiek te maken (zie tabel van materialen ).
    OPMERKING: Om de gegevens te analyseren, selecteer de kolom , vul alle waarden van deze kolom op en laat een bewegingsafstand zien als een staafdiagram, zoals in Figuur 1B . Herhaal deze stap ook, berekén het gemiddelde van de totale motiliteitsafstand en toon als een staafdiagram, zoals in Figuur 1C . De software om een ​​staafgrafiek en golfvormgegevens te maken wordt getoond inDe tabel van materialen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deze analyse werd ontworpen om de vesiceldynamiek in de in vitro- cultuur te meten. Deze bepaling werd gebruikt om de vesikelmotiliteit die geassocieerd werd met neuronale morfologie en overleving te bepalen. Figuur 1A en B tonen representatieve gegevens die de lysosoommotiliteit in neuronen tonen. Cortische neuronen werden getransfecteerd met de lysosoommarkering, LAMP-EGFP, en waargenomen met behulp van een standaard fluorescentiemicroscoop. E...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol introduceert de procedure voor het kwantificeren van vesikelmotiliteit. In primaire neuronen hebben endosomen en lysosomen de neiging om hoge motiliteit te tonen bij jongere neuronen (4-6 DIV). Aangezien neuronen bepaalde componenten aan de voorste randen moeten leveren om neurale processen te verlengen, moet membraanhandel dynamisch optreden tijdens dit stadium. Zo is het belangrijk om jongere neuronen te gebruiken om dynamische motiliteit in neuronale dendriten te waarnemen. Bovendien hebben grotere blaas...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij bedanken dr. Ricardo Dolmetsch (Stanford University School of Medicine, huidige affiliatie: Novartis Institutes for Biomedical Research) om deze analyse te ontwikkelen en Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara en Dongsook Kim voor hun kritische lezing van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Neurobasal mediumThermo Fisher21103-049
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)Wako044-29765
Opti-MEMThermo Fisher31985070Serumvrij medium
Hank's balanced salt solution (HBSS)Thermo Fisher14170112
Penicilin StreptmycinThermo Fisher15140122
L-GlutamineThermo Fisher25030081
B-27 SupplementsThermo Fisher17504044
2.5% TrypsineThermo Fisher15090046
Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL)SigmaP7280
Poly-L-Ornithine (PLO)SigmaP4957
Nylon cell strainerCorning431750
Lipofectamine 2000Thermo Fisher11668027Transfectie reagens
Polyethyleenimine "Max" (PEI)polysciences24765Transfectie reagens. Als alternatief voor Lipofectamine2000 is 0,1 mg/mL polyethyleenimine opgelost in gesteriliseerde water beschikbaar. Maar het is laag efficiëntie en hoge toxiciteit.
BIOREVO BZ-9000KeyenceNA
Incubatie systeem INUG2-K13Tokay HitNA
GraphPad Prism versie 6.0GraphPad SoftwareNA
Excel versie 15MicrosoftNA
ImageJ versie 1.47NANA

Referenties

  1. Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
  2. De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
  3. Lebrand, C. Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7. EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).
  4. Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. E. Abnormal transport along the lysosomal pathway in mucolipidosis, type IV disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6373-6378 (1998).
  5. Venugopal, B. Neurologic, gastric, and opthalmologic pathologies in a murine model of mucolipidosis type IV. Am J Hum Genet. 81 (5), 1070-1083 (2007).
  6. Li, X. A molecular mechanism to regulate lysosome motility for lysosome positioning and tubulation. Nat Cell Biol. 18 (4), 404-417 (2016).
  7. Tsuruta, F., Green, E. M., Rousset, M., Dolmetsch, R. E. PIKfyve regulates CaV1.2 degradation and prevents excitotoxic cell death. J Cell Biol. 187 (2), 279-294 (2009).
  8. Tsuruta, F., Dolmetsch, R. E. PIKfyve mediates the motility of late endosomes and lysosomes in neuronal dendrites. Neurosci Lett. 605, 18-23 (2015).
  9. McCartney, A. J., Zhang, Y., Weisman, L. S. Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate: low abundance, high significance. Bioessays. 36 (1), 52-64 (2014).
  10. Shisheva, A., Sbrissa, D., Ikonomov, O. Plentiful PtdIns5P from scanty PtdIns(3,5)P2 or from ample PtdIns? PIKfyve-dependent models: Evidence and speculation (response to: DOI 10.1002/bies.201300012). Bioessays. 37 (3), 267-277 (2015).
  11. Chow, C. Y. Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J. Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).
  12. Zhang, Y. Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).
  13. Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
  14. Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet]. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html (2017).
  15. Hu, W. Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus. PLoS One. 6 (1), e16102(2011).
  16. Tan, Z. Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus. PLoS One. 8 (9), e75105(2013).
  17. Choi, S. A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).
  18. Dahirel, M. Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome. J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).
  19. Hu, W. Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus. Sci Rep. 6, 17790(2016).
  20. Cordelières, F. P. Manual Tracking [Internet]. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual Tracking plugin.pdf (2017).
  21. ImageJ Tracking plug-in [Internet]. , Available from: https://imagej.net/Category:Tracking (2017).
  22. Tinevez, J. Y. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. , (2016).
  23. Ekvall, M. T. Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles. PLoS One. 8 (11), e78498(2013).
  24. Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Endosoom lysosoommotiliteitkwantificering van vesikelmotiliteittime lapse microscopiehandmatige tracking in ImageJneuronale endosomen en lysosomencorticale neuronencultuuranalyse van membraantransportsoftware voor vesikeltrackingLAMP EGFP vesikels

Gerelateerde artikelen