Live-imaging van de gelabelde bloedcellen in de oculaire circulatie kan informatie verschaffen over ontsteking en ischemie bij diabetische retinopathie en leeftijdgerelateerde macular degeneratie. Een protocol om bloedcellen te labelen en de gemarkeerde cellen in de retinale circulatie af te beelden is beschreven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fluorescent Dye Etikettering van Erythrocyten en Leukocyten voor het bestuderen van de Flow Dynamics in de retinale circulatie van de muis
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De retinale en choroidale bloedstroomdynamiek kan inzicht verschaffen in de pathofysiologie en vervolg van diverse oogziekten, zoals glaucoom, diabetische retinopathie, leeftijdgerelateerde macular degeneratie (AMD) en andere oculaire inflammatoire aandoeningen. Het kan ook helpen om de therapeutische reacties in het oog te volgen. De juiste etikettering van de bloedcellen, in combinatie met live-celbeelden van de gelabelde cellen, maakt het mogelijk om de stromingsdynamiek in de retinale en choroidale circulatie te onderzoeken. Hier beschrijven we de gestandaardiseerde protocollen van respectievelijk 1,5% indocyaninegroen (ICG) en 1% natriumfluoresceïne-etikettering van muizen erythrocyten en leukocyten. Scanning laser-oftalmocopie (SLO) werd toegepast om de gelabelde cellen te visualiseren in de retinale circulatie van C57BL / 6J muizen (wildtype). Beide methoden demonstreerden onderscheiden fluorescent gelabelde cellen in de retinale circulatie van de muis. Deze etiketteringsmethoden kunnen bredere toepassingen hebben in verschillende oogziektenmodellen.
Inleiding
Het bestuderen van de stromingsdynamiek van de bloedcellen in de retinale en choroidale circulatie is essentieel voor het begrijpen van de pathogenese van potentieel visiebedreigende oogziekten en andere oculaire inflammatoire aandoeningen. De conventionele angiografietechnieken, die de binding van fluorescerende kleurstoffen aan plasma-eiwitten omvatten, verschaffen echter geen informatie over de dynamiek van de erythrocyten of leukocyten 1 . De erytrocytische retinale stromingsdynamiek is belangrijk voor het bestuderen van metabolisch efficiënte circulatie in het retina, en de leukocytestroomdynamiek, om de celmigratie, herkenning, adhesie e....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De dierprotocollen die in deze studie werden gebruikt, werden goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van SingHealth, Singapore en zijn in overeenstemming met de richtlijnen van de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde (ARVO) Verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkunde en visie Onderzoek.
1. Etikettering van erytrocyten en leukocyten met fluorescerende kleurstoffen
- Bereiding van reagentia
- Bereid ICG (1,5 mg / ml) door 3 mg ICG op te lossen in 1800 μL gesteriliseerd gedistilleerd water. Voeg 200 μl 10x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) toe.
- Bereid 40% 1x PBS ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Erythrocyten gemarkeerd met 1,5% ICG werden gevisualiseerd in de retinale circulatie van C57BL / 6J muizen (wild type). Beide 1% en 5% hematocriet van 1,5% ICG gelabelde erythrocyten waren onderscheiden in de retinale circulatie. De afzonderlijke gemerkte cellen werden echter duidelijker met 1% hematocriet van 1,5% ICG gelabelde erythrocyten ( Figuur 1 ). In 5% hematocrit, door het grote aantal gelabelde cellen in de retinale vaten, was het niet mogelijk om .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het bestuderen van de hemodynamica in de retinale en choroidale circulatie is essentieel voor het begrijpen van de pathofysiologie van veel oogziekten. De bloedstroomdynamiek in de retinale circulatie kan worden bestudeerd door Fourier-domeine optische coherentie-tomografie (FD-OCT), laserspotflowgrafie (LSFG) en retinale oximetrie. Hoewel deze methoden verschillende benaderingen gebruiken om de totale bloedstroom in de retinale circulatie 40 , 41 , <.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen. Geen financieel of belangenconflict.
Dankbetuigingen
Het onderzoeksproject werd gefinancierd uit New Investigator grant van de National Medical Research Council (NMRC), Singapore. Het team wil graag de onderzoeksopleiding ontvangen die aan Dr Agrawal bij het Institute of Ophthalmology (IoO), University College London (UCL) is verstrekt aan de National Medical Research Council (NMRC) overzeese onderzoeksopleiding van november 2012 tot oktober 2014 onder mentorschap van prof. David Shima. Dr. Agrawal verwierf het concept en de vaardigheden om de cellen te labelen en live imaging te produceren in het lab van Dr. Shima. Het team zal bijgevolg het toezicht en de begeleiding tijdens de training van prof. David Shima, Pro.f K....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) | Sigma Aldrich | 12633-50MG | |
| Fluorescein 100 mg/mL | Novartis | U1705A/H-1330292 | |
| 10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade | 1st BASE | BUF-2040-10X1L | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood | BD, USA | REF 365974 | |
| Histopaque 1077 solution | Sigma Aldrich | 10771 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 05-413-401 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Axygen | MCT-200-C-S | |
| Vortex mixer | Insta BioAnalytik pte. ltd | FINE VORTEX | |
| Shaker incubator | Lab Tech | ||
| Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) | Ceva | KETALAB03 | |
| ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) | Troy Laboratories PTY. Limited | LI0605 | |
| 1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0355-15 | |
| 2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) | Alcon Laboratories, Inc. USA | NDC 0998-0342-05 | |
| Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin | Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines | SS-01T2613 | |
| Vidisic Gel 10 G | Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany | ||
| Alcohol swabs | Assure medical disposables | 7M-004-L-01 | |
| Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 | Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| Fluorescent microscope | ZEISS | Model: axio imager z1 |
Referenties
- Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
- Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent lab....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
