Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Fluorescent Dye Etikettering van Erythrocyten en Leukocyten voor het bestuderen van de Flow Dynamics in de retinale circulatie van de muis

11.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55495

⸱

3 juli 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Healthcare Group Eye Institute, Tan Tock Seng Hospital, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore National Eye Center, 3School of Material Science and Engineering, Nanyang Technological University, 4Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University Health Systems, National University of Singapore, 5Ophthalmology Academic Clinical Research Program, DUKE-NUS Graduate Medical School

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Live-imaging van de gelabelde bloedcellen in de oculaire circulatie kan informatie verschaffen over ontsteking en ischemie bij diabetische retinopathie en leeftijdgerelateerde macular degeneratie. Een protocol om bloedcellen te labelen en de gemarkeerde cellen in de retinale circulatie af te beelden is beschreven.

Samenvatting

De retinale en choroidale bloedstroomdynamiek kan inzicht verschaffen in de pathofysiologie en vervolg van diverse oogziekten, zoals glaucoom, diabetische retinopathie, leeftijdgerelateerde macular degeneratie (AMD) en andere oculaire inflammatoire aandoeningen. Het kan ook helpen om de therapeutische reacties in het oog te volgen. De juiste etikettering van de bloedcellen, in combinatie met live-celbeelden van de gelabelde cellen, maakt het mogelijk om de stromingsdynamiek in de retinale en choroidale circulatie te onderzoeken. Hier beschrijven we de gestandaardiseerde protocollen van respectievelijk 1,5% indocyaninegroen (ICG) en 1% natriumfluoresceïne-etikettering van muizen erythrocyten en leukocyten. Scanning laser-oftalmocopie (SLO) werd toegepast om de gelabelde cellen te visualiseren in de retinale circulatie van C57BL / 6J muizen (wildtype). Beide methoden demonstreerden onderscheiden fluorescent gelabelde cellen in de retinale circulatie van de muis. Deze etiketteringsmethoden kunnen bredere toepassingen hebben in verschillende oogziektenmodellen.

Inleiding

Het bestuderen van de stromingsdynamiek van de bloedcellen in de retinale en choroidale circulatie is essentieel voor het begrijpen van de pathogenese van potentieel visiebedreigende oogziekten en andere oculaire inflammatoire aandoeningen. De conventionele angiografietechnieken, die de binding van fluorescerende kleurstoffen aan plasma-eiwitten omvatten, verschaffen echter geen informatie over de dynamiek van de erythrocyten of leukocyten 1 . De erytrocytische retinale stromingsdynamiek is belangrijk voor het bestuderen van metabolisch efficiënte circulatie in het retina, en de leukocytestroomdynamiek, om de celmigratie, herkenning, adhesie en vernietiging in verschillende ontstekingsomstandigheden te begrijpen 2 . Er zijn verschillende fluorescerende moleculen gebruikt bij de identificatie en karakterisering van verschillende celtypen 3 . De hemodynamica van de bloedcellen kan worden gemeten door ze te kleuren met de juiste fluorenCent kleurstoffen en het toepassen van de juiste beeldvormingstechnieken 4 .

De aanwezigheid van ontstekingsreacties bij intraoculaire ziekten zoals leeftijdgerelateerde macular degeneratie (AMD) en diabetische retinopathie (DR) behelst de accumulatie van lymfocyten in het zieke gebied 5 , 6 . Het bijhouden van de immuuncellen in de weefsels kan helpen bij het begrijpen van de complexe gebeurtenissen die betrokken zijn bij het mechanisme van ziektepatogenese. Radioactieve isotopen zoals 51 Cr en 125 I werden in vroege studies gebruikt als cellracers. Deze kleurstoffen zijn giftig en beïnvloeden de levensvatbaarheid van de cellen. Hoewel de radioactieve markers 3 H en 14 C minder giftig zijn voor de cellen, is het moeilijk om hun signalen in het systeem 7 , 8 te detecteren door hun lagere emissie-energieën. Er werden een aantal fluorochroom-kleurstoffen ingevoerd om de mogelijke problemen die verband houden met w te overwinnenMet radioactieve markers en tracklymfocytemigratie in vitro met behulp van fluorescerende microscopie en flowcytometrie 9 , 10 . Hoechst 33342 en thiazoloranje zijn DNA-bindende fluorescerende kleurstoffen, die worden gebruikt om lymfocyten in vivo te volgen. Hoechst 33342 bindt aan AT-rijke gebieden in het DNA, is membraan doorlaatbaar, houdt fluorescentiesignalen gedurende 2 - 4 dagen en is bestand tegen slokkend 9 , 10 . De nadelen van Hoechst 33342 en thiazoloranje zijn de remming van lymfocyt proliferatie 11 en de korte halveringstijd respectievelijk 9 .

Calcein-AM, fluoresceendiacetaat (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (en-6) -carboxyfluoresceïne, acetoxymethylester (BCECF-AM), 5- (en-6) Carboxyfluoresceendiacetaat (CFDA) en 5- (en-6) -carboxyfluoresceendiacetaatacetoxymethylester (CFDA-AM)Zijn de cytoplasmatische fluorescerende kleurstoffen gebruikt voor lymfocytemigratie studies. FDA, CFDA en CFDA-AM hebben echter lagere retentie in de cellen 9 . BCECF-AM vermindert de proliferatieve respons en beïnvloedt de chemotaxis en superoxideproductie 9 , 12 . Calcein-AM is een fluorescerende kleurstof en bruikbaar voor korte termijn in vivo lymfocytemigratie studies. Het emitert sterke fluorescerende signalen, verstoort de meeste cellulaire functies niet en houdt fluorescente signalen gedurende maximaal 3 dagen 12 , 13 . Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en carboxyfluoresceendiacetaatsuccinimidylester (CFDA-SE) zijn covalente koppeling fluorescerende kleurstoffen die worden gebruikt voor lymfocytemigratie studies. FITC vertoont geen effect op de cellevendigheid en heeft een sterkere affiniteit met B-lymfocyten dan T-lymfocyten 14 , 15 . De CFDA-SE gelabelde lymfocyten kunnen meer dan 8 weken en tot 8 celafdelingen 9 , 16 in vivo worden gevolgd. C18 DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanineperchloraat), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyanineperchloraat), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 en PKH26 zijn membraan- Het inbrengen van fluorescerende lipofiele carbocyanine kleurstoffen die gebruikt worden om leukocyten en erythrocyten te labelen. C18 Dil en DiO tonen hogere signalen wanneer ze in het celmembraan worden opgenomen en zijn relatief niet giftig 12 , 17 . PKH2-, PKH3- en PKH26-gemerkte cellen tonen een goede retentie van de fluorescerende signalen met minder toxiciteit 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Echter, PKH2 regelt de CD62L expressie en vermindert de ly Mphocyt levensvatbaarheid 23 .

De meeste bovengenoemde studies zijn uitgevoerd voor het bijhouden van de lymfocytemigratie en proliferatie in de lymfatica en het bestuderen van de geëtiketteerde erythrocyten in de niet-oculaire circulatie. Er zijn zeer weinig studies die de etiketteringstechnieken toepassen om de bloedcellen in de oculaire circulatie te bestuderen. Toepassing van scan-laser-oftalmoprofie (SLO) heeft een groot voordeel bij het bestuderen van de gelabelde cellen in de retinale en choroidale circulatie in vivo door fundus angiography 24 . Er zijn verschillende fluorescerende kleurstoffen, zoals ICG, acridine oranje, FITC, natriumfluoresceïne en CFDA die gebruikt worden om de leukocyten in de retinale circulatie door SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . De fototoxiciteit en carcinogeniciteit van acridine oranje 26 , 27 , de interferentie van FITC met de cellulaire activiteit en de eis van een intravascular contrastmiddel voor de oplossing van de retinale en choroidale bloedvaten beperkt hun toepassing in in vivo dierproeven 29 . Natriumfluoresceïne en ICG zijn niet-toxisch, goedgekeurd door de Food and Drug Administration, en veilig voor het testen op mensen 32 , 35 . De meeste dynamische studies zijn gerelateerd aan de etikettering van de leukocyten of erythrocyten en zijn visualisatie in de retinale en choroidale bloedvaten 36 , 37 , 38 , 39 . Hier beschrijven we een gestandaardiseerd protocol van ICG-etikettering van de erythrocyten, natriumfluoresceïne-etikettering van de leukocyten, en het bijhouden van de gevisualiseerde gelabelde cellen in de retinale circulatie van de muis met behulp van SLO.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De dierprotocollen die in deze studie werden gebruikt, werden goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van SingHealth, Singapore en zijn in overeenstemming met de richtlijnen van de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde (ARVO) Verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkunde en visie Onderzoek.

1. Etikettering van erytrocyten en leukocyten met fluorescerende kleurstoffen

  1. Bereiding van reagentia
    1. Bereid ICG (1,5 mg / ml) door 3 mg ICG op te lossen in 1800 μL gesteriliseerd gedistilleerd water. Voeg 200 μl 10x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) toe.
    2. Bereid 40% 1x PBS door 4 ml 1x PBS toe te voegen aan 6 ml gesteriliseerd gedestilleerd water. Bereid 1% boviene serumalbumine (BSA) in PBS door 100 mg BSA toe te voegen aan 10 ml 1x PBS. Meng goed tot de BSA is opgelost.
  2. Isolatie van erytrocyten en leukocyten onder toepassing van dichtheidsgradiëntcentrifugatie
    1. Verdoof de muizen (wild tyPe C57BL / 6) met behulp van een combinatie van ketaminehydrochloride (50 mg / kg) en xylazinehydrochloride (0,5 mg / kg) (volgens schema 1, onder ARVO richtlijnen). Bevestig de verdoving door het terugtrekken van de pedaal ( bijv . De knijp).
    2. Steek de 29-gaalsnaald langzaam in (bij een 1 ml spuit) in een kogelhoek gericht naar het hart. Om te bevestigen dat de naald in het hart zit, trek de plunjer een beetje uit en controleer of bloed in de spuit is opgenomen. Blader 0,8 - 1 ml bloed direct uit het hart.
    3. Zet het bloed onmiddellijk over in een ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA) (1,8 mg / ml bloed) met bloedinzamelbuis en meng zachtjes om bloedstolling te voorkomen.
    4. Euthanize de muizen door middel van intraperitoneale injectie van pentobarbital (80 mg / kg).
    5. Laag het gehele bloed op een polysucrose- en natriumdiatrizoaatoplossing (1: 1 verhouding: dichtheid 1,077 g / ml) in een 2 ml microcentrifugebuis en centriFuge (450 xg, 30 min) om de scheiding van de leukocyten en erytrocyten uit het plasma mogelijk te maken.
    6. Verwijder en wis de supernatant (plasma) met behulp van een pipet. Zet de buffy coat (leukocyten) en erythrocyten (rode bloedcellaag) zorgvuldig over in nieuwe en afzonderlijke buizen met behulp van pipetten.
  3. ICG (1,5%) etikettering van erythrocyten
    1. Was de erytrocyten met 1x PBS om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Resuspendeer de erytrocyten in 1x PBS (1: 1) om 50% hematocrit te maken. Aliquot 0,5 ml 50% hematocrit (~ 250 μL verpakte erythrocyten) in microcentrifugebuizen. Centrifugeer de erytrocyten (750 xg, 5 min) en gooi de supernatant weg.
    2. Voeg 200 μl 40% 1x PBS toe aan de gepelleteerde erythrocyten, meng goed en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Voeg 100 μL ICG (1,5 mg / ml) toe aan de erytrocyt suspensie, meng zachtjes door de buis om te keren en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Voeg 300 μl 1x PBS toe en incubeer bij37 ° C in een shaker incubator gedurende 60 minuten.
    3. Centrifugeer de drager erythrocyten (750 xg, 3 min) en resuspendeer in 1 ml 1x PBS.
    4. Was de cellen ~ 3 - 5 keer met 1x PBS totdat de supernatant helder is (stap 1.3.3). Na de laatste was decomponeer de supernatant en voeg 1% BSA PBS (1: 1) toe aan de geëtiketteerde voorgeswelte erythrocyten om een ​​50% hematocrit (1,25 x 10 8 cellen / ml) ICG geëtiketteerde erythrocyten te verkrijgen.
  4. Natrium fluoresceïne (1%) etikettering van leukocyten
    1. Nadat u de buffy coat van het bloed heeft afgescheiden met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie (vanaf stap 1.2.6), wassen de cellen eenmaal met 10 mL 1x PBS door centrifugeren bij 450 xg gedurende 10 minuten om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Resulteer de pellet in 900 μl 1x PBS.
    2. Voeg 100 μl 10% natrium fluoresceïne toe aan 900 μl van de leukocytsuspensie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Was de gelabelde cellen driemaal met 10 ml 1X PBS door centrifugiNg (450 x g, 10 min). Resuspendeer de cellen in 100 μl 1x PBS.

2. Live Imaging van Fluorescently Labelled Cells

  1. Live-imaging van ICG genaamd erythrocyten
    1. Om cellen voor injectie via staartvene of retro-orbitale route voor te bereiden, verdunnen de 50% hematocrit van ICG geëtiketteerde erythrocyten 10 keer en 50 keer met 1x PBS om respectievelijk 5% en 1% hematocritcellen te maken.
    2. Plaats de muis onder het infraroodlicht (250W intensiteit) gedurende 5 minuten om de staartvene te vergroten. Verdoof de muis met ketaminehydrochloride (50 mg / kg) en xylazinehydrochloride (0,5 mg / kg) via intraperitoneale injectie (hier volgens schema 1, onder ARVO richtlijnen).
    3. Dilate elke pupil van de ogen met een daling van 0,5% tropicamide en 2,5% fenylefrine hydrochloride.
    4. Plaats de contactlens op één oog voor beeldvorming. Gebruik oftalmische gel als een medium voor beeldvorming en om droog te voorkomenS van de hoornvlies. Fixeer de camera van de confocal laser scanning ofthalmoscopie (SLO) met een 25-diopterlens om de breking van het muisoog te compenseren.
    5. Plaats de muis op het SLO beeldplatform. Zorg ervoor dat de hoornvlies van de muis recht naar de optische hoofd van de SLO-machine staat.
    6. Schakel de beeldmodule in. Gebruik de bijbehorende beeldmodemsoftware, klik op de knop "Nieuwe patiënt" en voeg de identificatiegegevens van dieren toe, zoals het muisoormerknummer, de geboortedatum, het percentage fluorescerende kleurstof en het gemarkeerde celtype.
      1. Plaats de optische zenuw van het dier in het midden van het beeldscherm door de beeldmodule te manoeuvreren. Gebruik de bijbehorende beeldmateriaal software, klik op de knop 'Acquire' om de infrarood (IR) fundus beelden te maken met de 30 ° of 15 ° hoekweergave instelling. Zorg ervoor dat het midden van het netvlies, de leerling en het optische pad van de laser op elkaar afgestemd zijn om een ​​beste kwaliteitbeeld te verkrijgen.
        OPMERKING: Het optische pad wordt uitgelijnd door de joystick te manoeuvreren om het scherpste beeld en de beste lichtbelichting te verkrijgen.
    7. Neem de ICG fundus video.
      1. Zet het ICG-filter (790 nm) aan, zet de camera in de hoge snelheidsmodus met de 30 ° of 15 ° -hoekweergave en stel de ICG-intensiteit op 85 voor alle aflezingen voor standaardisatie. Op het bedieningspaneel klikt u op de knop 'Acquire' om de video (basislijnregeling) gedurende 8 minuten bij 8,8 / 15 frames / s te maken.
    8. Laad 100 μL ICG geëtiketteerde erythrocyten in een insulinspuit bevestigd aan een 30 gauge naald.
      1. Voor de injectie via de staartaderweg, steek de naaldschuin in de staartader. Bevestig de intraveneuze toegang door de terugstroom van het bloed in de spuit te controleren en de gemerkte cellen in de circulatie te injecteren.
      2. Voor de injectie via de retro-orbitale route, steek de naald naast het oog in de retro-orbitale ruimtee. Bevestig de retro-orbitale toegang door de terugstroom van het bloed in de spuit te controleren en de gemerkte cellen in de circulatie te injecteren.
    9. Plaats na de injectie de muis en gebruik de IR fundus beelden (zie stap 2.1.6.1) en video met behulp van het ICG filter (zie stap 2.1.7.1). De gelabelde cellen in de retinale circulatie kunnen onmiddellijk na de injectie van de cellen worden weergegeven.
    10. Nadat u de videoramen hebt verworven, verwijdert u .tiff-afbeeldingen van de video-sequenties door het .tiff-formaat te kiezen bij het exporteren van de video met behulp van de SLO-weergavemodussoftware. Sla de bestanden op in een gewenste map.
    11. Verwijder de contactlens, plaats het over het andere oog en voltooi de afbeeldingen zoals beschreven in stappen 2.1.4 - 2.1.7.
    12. Plaats na het imago het verdovende dier onder het infraroodlicht (250W) om de lichaamstemperatuur te behouden tot het terugkeert van verdoving. Wanneer het dier volledig is hersteld, plaats de muis terug in de houderkooi.
  2. Live-imaging van 1% natrium fluoresceïne gelabelde leukocyten
    1. Bereid de muis op en stel het instrument op zoals beschreven in paragraaf 2.1.
    2. Plaats de muis en gebruik de IR fundus beelden zoals beschreven in stappen 2.1.4 - 2.1.6.
      1. Verkrijg het fluoresceine-angiogram van de muis met behulp van het fluoresceïnefilter (488 nm) met de hoge-snelheidscamera-modus met de 30 ° of 15 ° -hoekweergave en fluoresceinintensiteit bij 85 voor alle aflezingen voor standaardisatie. Opnemen van de video (basisregeling) op 8,8 / 15 frames / s (zie stap 2.1.7.1).
        OPMERKING: hier zijn meerdere tracks van video's (1 min video's) bij verschillende tijdsintervallen aangeschaft.
    3. Spuit 100 μL gemerkte leukocyten in de muis door de staartvene of retro-orbitale injectie zoals beschreven in paragraaf 2.1.8.
    4. Plaats de muis direct na de injectie en gebruik de IR fundus beelden (zie stap 2.1.5 en 2.1.6) en de fluoRescein angiogram van de muis (zie paragraaf 2.2.2).
    5. Let op de gelabelde cellen in de retina of choroidale bloedvaten door het brandpuntspunt van de aftastlaser aan te passen door de focusknop op de beeldmodule te draaien.
    6. Verkrijg de videolijsten en afbeeldingen met behulp van de SLO-kijkmodulesoftware (zie stap 2.1.10) en sla het op in een gewenste map.
    7. Volg de procedure, volg stap 2.1.12 voor de verzorging van dieren.
  3. Beeldanalyse door MtrackJ software
    1. Open de beeldsequentie in ImageJ door op "File" te klikken. Selecteer 'Import' en kies 'Beeldvolgorde', selecteer de gewenste afbeeldingsmap en klik op 'Openen'. Op het scherm verschijnt een pop-up venster genaamd "Sequence Options". Klik op "Ok"; De beeldsequentie wordt geopend.
    2. Stel het frame interval van de beeldvideo in door op "Afbeelding" te klikken en selecteer "Eigenschappen" voor snelheidsmetingen. Hier is het 8,8 frames / s.
    3. Open de MTrackJ plugin door "Plugins" te selecteren. Selecteer "Tracking" en selecteer dan "MtrackJ". Er moet een menu verschijnen.
    4. Als u de tracking-instellingen wilt aanpassen, selecteert u 'Tracking' (onder menu) en selecteert u het vak 'Verplaats naar de volgende tijdlijstindex na het toevoegen van punt'.
    5. Volg de eerste cel.
      1. Zoek een cel en volg dezelfde cel in de volgende frames. Klik op het menu op 'Toevoegen' om een ​​nieuw nummer toe te voegen.
      2. Schuif de cursor over de afbeelding (+ teken) en klik op de betreffende cel.
        OPMERKING: MTrackJ zal automatisch naar het volgende tijdstip springen en een kleine cirkel toevoegen, waarbij de positie van het eerste punt in het traject wordt gemarkeerd.
      3. Blijf doorgaan met klikken op de huidige positie van de cel terwijl u door de frames van de beeldvolgorde beweegt.
        OPMERKING: soms worden de cirkels die de vorige punten in het traject markeren, de mogelijkheid om de huidige locatie te bekijken, beïnvloed. Als dit gebeurt,Ga verder naar stap 2.3.5.3.1.
        1. Wijzig de weergaveoptie voor het traject door op "Weergeven" in het menu te klikken en selecteer de optie "alleen trackpunten weergeven op de huidige tijd". Om alle trajecten te zien, deselecteer deze optie.
      4. Blijf doorgaan tot het traject van de eerste cel wordt gezien. Sla dan het spoor op door op "Opslaan" te klikken.
    6. Volg de tweede cel.
      1. Klik in het menu op 'Toevoegen' om een ​​nieuw nummer te starten. Herhaal stappen 2.3.5.1 - 2.3.5.4 voor het bijhouden van de nieuwe cel. Klik op "Save" om het tweede spoor op te slaan.
      2. Ga door met deze stappen voor alle waarneembare cellen waargenomen. Nadat u de cellen hebt gevolgd, klikt u op "Meet" en "OK" in het menu tab om de resultaten te krijgen.
        OPMERKING: een resultaatvenster wordt automatisch geopend, die kan worden opgeslagen en geopend in een spreadsheet voor verdere analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Erythrocyten gemarkeerd met 1,5% ICG werden gevisualiseerd in de retinale circulatie van C57BL / 6J muizen (wild type). Beide 1% en 5% hematocriet van 1,5% ICG gelabelde erythrocyten waren onderscheiden in de retinale circulatie. De afzonderlijke gemerkte cellen werden echter duidelijker met 1% hematocriet van 1,5% ICG gelabelde erythrocyten ( Figuur 1 ). In 5% hematocrit, door het grote aantal gelabelde cellen in de retinale vaten, was het niet mogelijk om ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het bestuderen van de hemodynamica in de retinale en choroidale circulatie is essentieel voor het begrijpen van de pathofysiologie van veel oogziekten. De bloedstroomdynamiek in de retinale circulatie kan worden bestudeerd door Fourier-domeine optische coherentie-tomografie (FD-OCT), laserspotflowgrafie (LSFG) en retinale oximetrie. Hoewel deze methoden verschillende benaderingen gebruiken om de totale bloedstroom in de retinale circulatie 40 , 41 , <...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen. Geen financieel of belangenconflict.

Dankbetuigingen

Het onderzoeksproject werd gefinancierd uit New Investigator grant van de National Medical Research Council (NMRC), Singapore. Het team wil graag de onderzoeksopleiding ontvangen die aan Dr Agrawal bij het Institute of Ophthalmology (IoO), University College London (UCL) is verstrekt aan de National Medical Research Council (NMRC) overzeese onderzoeksopleiding van november 2012 tot oktober 2014 onder mentorschap van prof. David Shima. Dr. Agrawal verwierf het concept en de vaardigheden om de cellen te labelen en live imaging te produceren in het lab van Dr. Shima. Het team zal bijgevolg het toezicht en de begeleiding tijdens de training van prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh en Dr. Daiju Iwata erkennen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green)Sigma Aldrich12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mLNovartisU1705A/H-1330292
10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade1st BASEBUF-2040-10X1L
Bovine serum albuminSigma AldrichA7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of bloodBD, USAREF 365974
Histopaque 1077 solutionSigma Aldrich10771
Centrifuge 5810 REppendorf05-413-401
Microcentrifuge tubes 2 mLAxygenMCT-200-C-S
Vortex mixerInsta BioAnalytik pte. ltdFINE VORTEX
Shaker incubatorLab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL)CevaKETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml)Troy Laboratories PTY. LimitedLI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%)Alcon Laboratories, Inc. USANDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%)Alcon Laboratories, Inc. USANDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1 cc/mL TuberculinTerumo (Philippenes) Corporation, PhilippinesSS-01T2613
Vidisic Gel 10 GDr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabsAssure medical disposables7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2)Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscopeZEISSModel: axio imager z1

Referenties

  1. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
  2. Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. J Fluoresc. 23 (5), 975-987 (2013).
  3. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
  4. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
  5. Nowak, J. Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacol Rep. 58 (3), 353-363 (2006).
  6. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366 (13), 1227-1239 (2012).
  7. Rannie, G. H., Thakur, M. L., Ford, W. L. An experimental comparison of radioactive labels with potential application to lymphocyte migration studies in patients. Clin Exp Immunol. 29, 509-514 (1977).
  8. Ford, W. L. The preparation and labeling of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 3, Blackwell Scientific Pubs. Oxford. (1978).
  9. Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Meth. 133, 87-97 (1990).
  10. Brenan, M., Parish, C. R. Intracellular fluorescent labeling of cells for analysis of lymphocyte migration. J Immunol Meth. 74, 31-38 (1984).
  11. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  12. DeClerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J Immunol Meth. 172, 115-124 (1994).
  13. Chiba, K., et al. FTY720, a novel immunosuppressant, induced sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. I. FTY720 selectively decreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing. J Immunol. 160, 5037-5044 (1998).
  14. Butcher, E. C., Weissman, I. L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J Immunol Meth. 37, 97-108 (1980).
  15. Butcher, E. C., Scollay, R. G., Weissman, I. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. II. Potential application to studies of lymphocyte migration and maturation. J Immunol Meth. 37, 109-121 (1980).
  16. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Meth. 171, 131-137 (1994).
  17. Unthank, J. L., Lash, J. M., Nixon, J. C., Sidner, R. A., Bohlen, H. G. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 45, 193-210 (1993).
  18. Slezak, S. E., Horan, P. K. Fluorescent in vivo tracking of hematopoietic cells. Part I. Technical considerations. Blood. 74, 2172-2177 (1989).
  19. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: The migration of PKH-labeled lymphocytes. Cell Immunol. 134, 157-170 (1991).
  20. Johnsson, C., Festin, R., Tufveson, G. T., Tötterman, T. H. Ex vivo PKH26-labeling of lymphocytes for studies of cell migration in vivo. Scand. J Immunol. 45, 511-514 (1997).
  21. Khalaf, A. N., Wolff-Vorbeck, G., Bross, K., Kerp, L., Petersen, K. G. In vivo labeling of the spleen with a red-fluorescent cell dye. J Immunol Meth. 165, 121-125 (1993).
  22. Albertine, K. H., Gee, M. H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J Leukoc Biol. 59, 631-638 (1996).
  23. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  24. Manivannan, A., et al. Digital fundus imaging using a scanning laser ophthalmoscope. Physiol Meas. 14, 43-56 (1993).
  25. Okanouchi, T., Shiraga, F., Takasu, I., Tsuchida, Y., Ohtsuki, H. Evaluation of the dynamics of choroidal circulation in experimental acute hypertension using indocyanine green-stained leukocytes. Jpn J Ophthalmol. 47 (6), 572-577 (2003).
  26. Zdolsek, J. M., Olsson, G. M., Brunk, U. T. Photooxidative damage to lysosomes of cultured macrophages by acridine orange. Photochem Photobiol. 51, 67-76 (1990).
  27. Molnar, J., et al. Antiplasmid and carcinogenic molecular orbitals of benz[c]acridine and related compounds. Anticancer Res. 13, 263-266 (1993).
  28. Fillacier, K., Peyman, G. A., Luo, Q., Khoobehi, B. Study of lymphocyte dynamics in the ocular circulation: technique of labeling cells. Curr Eye Res. 14 (7), 579-584 (1995).
  29. Horan, P. K., et al. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking. Methods Cell Biol. 33, 469-490 (1990).
  30. Hossain, P., et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (10), 1879-1887 (1998).
  31. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Visualization of retinal and choroidal blood flow with fluorescein leukocyte angiography in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235 (1), 27-31 (1997).
  32. Kim, J., Yang, Y., Shin, B., Cho, C. Visualization and flow of platelets and leukocytes in vivo in rat retinal and choroidal vessels. Ophthalmic Res. 29 (6), 374-380 (1997).
  33. Le Gargasson, J. F., et al. Scanning laser ophthalmoscope imaging of fluorescein-labeled blood cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, 56-58 (1997).
  34. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology. 104 (10), 1670-1676 (1997).
  35. Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am J Ophthalmol. 151 (5), 745-751 (2011).
  36. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30 (2), 140-145 (1999).
  37. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. J Neurosci. 34 (34), 11504-11513 (2014).
  38. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
  39. Matsuda, N., et al. Visualization of leukocyte dynamics in the choroid with indocyanine green. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37 (11), 2228-2233 (1996).
  40. Wang, Y., Lu, A., Gil-Flamer, J., Tan, O., Izatt, J. A., Huang, D. Measurement of total blood flow in the normal human retina using Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Br J Ophthalmol. 93 (5), 634-637 (2009).
  41. Wang, Y., Fawzim, A., Tan, O., Gil-Flamer, J., Huang, D. Retinal blood flow detection in diabetic patients by Doppler Fourier domain optical coherence tomography. Opt Express. 17 (5), 4061-4073 (2009).
  42. Srinivas, S., Tan, O., Wu, S., Nittala, M. G., Huang, D., Varma, R., Sadda, S. R. Measurement of retinal blood flow in normal Chinese-American subjects by Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1569-1574 (2015).
  43. Sugiyama, T., Araie, M., Riva, C. E., Schmetterer, L., Orgul, S. Use of laser speckle flowgraphy in ocular blood flow research. Acta Ophthalmol. 88 (7), 723-729 (2010).
  44. Nakano, Y., Shimazaki, T., Kobayashi, N., Miyoshi, Y., Ono, A., Kobayashi, M., Shiragami, C., Hirooka, K., Tsujikawa, A. Retinal Oximetry in a Healthy Japanese Population. PLoS One. 11 (7), 0159650(2016).
  45. Turksever, C., Orgul, S., Todorova, M. G. Reproducibility of retinal oximetry measurements in healthy and diseased retinas. Acta Ophthalmol. 93 (6), 439-445 (2015).
  46. Sharp, P. F., Manivannan, A., Xu, H., Forrester, J. V. The scanning laser ophthalmoscope-a review of its role in bioscience and medicine. Phys Med Biol. 49 (7), 1085-1096 (2004).
  47. Clermont, A. C., Aiello, L. P., Mori, F., Aiello, L. M., Bursell, S. E. Vascular endothelial growth factor and severity of nonproliferative diabetic retinopathy mediate retinal hemodynamics in vivo: a potential role for vascular endothelial growth factor in the progression of nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol. 124 (4), 433-446 (1997).
  48. Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16 (1), 25(2016).
  49. Schumann, J., Orgül, S., Gugleta, K., Dubler, B., Flammer, J. Interocular difference in progression of glaucoma correlates with interocular differences in retrobulbar circulation. Am J Ophthalmol. 129 (6), 728-733 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Erytrocytlabelingleukocytenlabelingscanning laser ophthalmoscopieindocyaninegroennatriumfluoresce neisolatie van bloedcellenfluorescentiemicroscopieceltrackinganalysemodellen voor oogziekten
Fluorescent Dye Etikettering van Erythrocyten en Leukocyten voor het bestuderen van de Flow Dynamics in de retinale circulatie van de muis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.