Een G-quadruplex DNA-affiniteit Aanpak voor zuivering van enzymatisch actieve G4 Resolvase1

Samenvatting

G4 Resolvase1 bindt aan G-quadruplex (G4) met de kleinste structuren gerapporteerde affiniteit voor een G4-bindend eiwit en vertegenwoordigt het merendeel van de G4-DNA afwikkelen activiteit in HeLa-cellen. We beschrijven een nieuw protocol dat de affiniteit en ATP-afhankelijke afwikkelen activiteit van de G4-Resolvase1 gordels om specifiek te zuiveren katalytisch actieve recombinant G4R1.

Samenvatting

Hogere orde nucleinezuurstructuren genaamd G-quadruplexen (G4, G4 structuren) kunnen vormen in guanine-rijke gebieden van zowel DNA als RNA en zeer thermisch stabiel. Er zijn> 375.000 vermoedelijke G4 vormende sequenties in het humane genoom, en ze zijn verrijkt in promotergebieden, ongetranslateerde gebieden (UTR) en in de telomere repeat. Vanwege de mogelijkheid van deze structuren om cellulaire processen zoals replicatie en transcriptie beïnvloeden, de cel geëvolueerd enzymen te beheren. Een dergelijke enzym G4 resolvase 1 (G4R1), die biochemisch werd mede gekenmerkt door laboratoriumwaarden Nagamine et al. en bleek zeer stevig aan beide G4-DNA en G4-RNA (K _d in de low-pM range) te binden. G4R1 is de bron van de meeste G4 oplossen activiteit in HeLa cellysaten en is sindsdien geïmpliceerd een rol telomeren metabolisme, lymfe ontwikkeling, gentranscriptie, hematopoiese en immune surveillance spelen. De mogelijkheid om efdoende te uiten en te zuiveren katalytisch actieve G4R1 van belang is voor laboratoria geïnteresseerd zijn in het verkrijgen van meer inzicht in de kinetische interactie van G4 structuren en G4 oplossen van enzymen. We beschrijven hier een gedetailleerde werkwijze voor de zuivering van recombinant G4R1 (rG4R1). De beschreven werkwijze omvat de traditionele affiniteit gebaseerde zuivering van een C-eindstandige histidine-gemerkte enzym tot expressie gebracht in humane codon-geoptimaliseerd bacteriën het gebruik van het vermogen van rG4R1 te binden en te ontspannen G4-DNA zeer actieve enzym te zuiveren per ATP afhankelijke elutiestap. Het protocol een kwaliteitscontrole stap waarbij de enzymatische activiteit van rG4R1 wordt gemeten door het onderzoeken van het vermogen van het gezuiverde enzym DNA-G4 ontspannen. Een werkwijze wordt ook beschreven dat zorgt voor de kwantificering van gezuiverde rG4R1. Alternatieve aanpassingen van dit protocol worden besproken.

Inleiding

G4 structuren zijn zeer stabiel nucleïnezuur secondaire structuren die zich vormen binnen guanine-rijke gebieden van DNA en RNA. G4 structuren worden gestabiliseerd via Hoogsteen-waterstofbruggen en coördineren binding binnen de centrale holte met eenwaardige kationen (bijv. K ⁺ en Na ⁺⁾ die aanzienlijk bijdragen aan de opmerkelijke thermische stabiliteit van G4 structuren ^{1, 2.} Vroege bioinformatica studies suggereerden dat het menselijk genoom bevat> 375.000 "potentieel-G4 vormende motieven" ^{3, 4.} Meer recent onderzoek blijkt dat het aantal motieven G4 hoger met een factor van ^02-05 mei, terwijl een andere studie voorspelt 716.310 verschillende potentiaal G4 vormende sequenties in het humane genoom ^6. G4-vormende sequenties zijn evolutionair geconserveerd en niet willekeurig verspreid inhet genoom. G4 motieven zijn verrijkt in genen coderende gebieden en ruim 40% van gen promoters bevatten G4 motieven ^7. Interessant is dat de verrijking van G4 motieven in een gen aangetoond dat het de functie van het gen suggereren. Bijvoorbeeld, proto-oncogenen en genen betrokken bij ontwikkeling aanzienlijk grotere verrijking van G4 structuren dan tumorsuppressorgenen ^{8, 9.}

Met een hoge thermische stabiliteiten, een bijna alomtegenwoordige aanwezigheid in het genoom, en het potentieel aanzienlijk beïnvloeden belangrijke cellulaire processen, is verrassend te vinden dat de cel enzymen geëvolueerd om deze structuren te beheren. Een dergelijke enzym G4 Resolvase1 (G4R1, ook wel Rhau en DHX36), die we gekarakteriseerd als de bron van de meeste tetramolecular G4-DNA oplossen activiteit in menselijke (HeLa) cellen ^10. Sindsdien is aangetoond that G4R1 stevig bindt en katalytisch wikkelt tetramolecular en unimoleculaire DNA-G4 en G4-RNA met de kleinste gemelde KD voor een G4-bindend eiwit ^{11, 12, 13.} Daarnaast heeft de G4 oplossen activiteit van G4R1 betrokken bij een groot aantal biochemische en cellulaire processen, waaronder telomere / telomerase biologie ^{11, 14, 15, 16,} transcriptie en lassen ^{17, 18, 19, 20,} ontwikkeling ^21, hematopoiese ^21, en het immuunsysteem regelgeving ^{22, 23.} Met een overwicht van G4 sequenties specifiek gelegen in het hele genoom en de diverse cellulaire processes dat G4R1 onlangs geïmpliceerd betrokken zijn bij het vermogen om expressie en efficiënt zuiveren zeer actieve rG4R1 daarbij van het grootste belang zijn voor het ophelderen van de biochemische mechanismen en het gedrag van dit eiwit.

Hier tonen we een nieuwe expressiesystemen en zuiveringsschema (figuur 1) die gebruik maakt van de ATP-afhankelijke, G4 oplossen activiteit van rG4R1 actieve enzym efficiënt isoleren. Deze regeling kan worden aangepast aan andere ATP-afhankelijke enzymen nucleïnezuur waarvoor het product van de enzymatische reactie is niet langer een substraat voor binding te zuiveren, zoals het geval is voor G4R1.

Protocol

1. Voorbereiding van de G4-DNA-structuren te worden gebruikt voor de zuivering van rG4R1 (Vorming van gebiotinyleerd G4-DNA G-Quadruplex)

1. Bestel de volgende DNA oligomeer, genaamd Z33-Bio, bij een 1 umol-schaal: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotine 3'. Controleer of de biotine-rest aan het 3 'uiteinde van het oligomeer.
2. Bereid 10x G4 buffer: 450 mM Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA en 2,500 mM NaCl.
3. Resuspendeer de Z33 oligomeer in 250 pl water (zodat het oligomeer ~ concentratie 2,5 mM). Voeg 25 ul van 10x buffer G4 en meng. Incubeer het oligomeer bij 50 ° C gedurende ~ 48 uur.
4. Kort spin down de buis om de condensatie (~ 1000 xg, 10 s) te verzamelen. Voeg ~ 50 ul van een hoge massa hydrofiele polysaccharide (30% Ficoll in H ₂ O) en meng. Giet een 10% acrylamide / 1x TBE / 10% glycerol gel (gel afmetingen: 16 cm x 16 cm x 1 mm). Zodra de gel is gepolymeriseerd, was de putten met 1x TBE en loadde gevormde Z33-Bio oligomeer gelijkmatig over het grootste deel van de gel (sample baan belasting kan worden gevisualiseerd met Schlieren lijnen).
   1. In een rijstrook aan het einde van de gel, laadt een kleine fractie van het oligomeer die bij 98 ° C gedurende 10 minuten is opgewarmd (dit zal dienen als een ongestructureerde controle), en een kleine hoeveelheid gel laadkleurstof in andere lane om te controleren hoe ver de gel heeft gelopen.
5. Gebruik 1x TBE als de gel running buffer en laat de gel bij 120 V, totdat de kleurstof voorkant minstens 1/3 van de gel heeft afgelegd.
6. Plaats een dunne laag chromatografie plaat met zijn ruwe zijde naar boven in een blad beschermer (of afdekken met folie). Verwijder een van de glasplaten en breng de gel aan het oppervlak van het vel beschermer. Uitschakelen van de verlichting en UV schaduw van de gel (lange golflengte: 365 nm). Gebruik een nieuw scheermesje uitgesneden en de G-quadruplex-Z33-Bio band, die wordt beschouwd als het draaien hoger in de gel (met langzamere mobiliteit) ten opzichte van de smelted control.
7. Plaats de gelstukje bevattende het gevormde G4-DNA in een 50 ml buis en precies zoveel soaking buffer om de gel slice dekking (weken buffer bestaat uit 1/3 volume 10x TBE, 1/3 volume verzadigde natriumacetaat en 1/3 volume H ₂ O). Plaats de buis in een 37 ° C incubator (nonhumidified) en incubeer O / N.
8. Breng de oplossing aan een 15 ml buis en voeg 1/10 volume glycogeen (glycogeen voorraad bij 20 mg / mL in 10 mM Tris-HCl pH 8, 2,5 mM EDTA pH 8 en 0,05% natriumazide) en ~ 1.2x volume isopropanol .
   LET OP: Natriumazide is acuut giftig, dus wees voorzichtig!
   1. Mengen en de buis bij -20 ° C gedurende ten minste 2 uur. Draai de buis bij 2700 xg in een tafelblad centrifuge gekoeld tot 4 ° C gedurende 12 min. Voorzichtig wordt de oplossing van het gepelleteerde G4-DNA. Was de pellet 3 maal met 70% EtOH + 50 mM NaCl (het zout in de was is van cruciaal belang voor de stabiliteit G4). Wick overtollige vloeistof met niet pluizende tissue papier.
9. Plaatshet gewassen pellet in de koelkast gedurende ten minste 2 uur aan de pellet hydrateren en zorgen voor gemakkelijker resuspensie. Resuspendeer de pellet in 50 pl TNE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl en 0,05 mM EDTA pH 8).
10. Pipetteer 5 ul van het gevormde DNA G-quadruplex in 495 pi _H2O en kwantificeren met behulp van een spectrofotometer waarmee de extinctiecoëfficiënt te bepalen door lopen de nucleotide samenstelling van het oligomeer (de extinctiecoëfficiënt van de Z33 DNA oligomeer met een basensamenstelling van A = 8, C = 3, G = 15 en T = 7 is 341.946 L / mol / cm). Voer de verdunningsfactor, 25 (niet 100), de gevormde G-quadruplex bestaat uit 4 strengen van DNA.
11. Aliquot het volume equivalent van 3 OD (OD ₂₆₀ eenheden) per buis en bewaar bij -20 ° C; bijvoorbeeld als de 5 pi dat voor het 495 pi _H2O werd toegevoegd geeft een OD ₂₆₀ lezing van 3, bereidt vervolgens 5 gl aliquots.

2. Voorbereiding van de G4-DNA-structuren te gebruiken in een enzymatische activiteit Assay van rG4R1 (Vorming van TAMRA-gelabelde G4-DNA)

1. Bestel de volgende DNA oligomeer, genaamd Z33-TAM, bij een 1 umol-schaal: 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. Controleer of de TAMRA-rest aan het 5 'uiteinde van het oligomeer.
2. Volg dezelfde procedure als beschreven in punt 1 voor de vorming van G-quadruplex, behalve dat ultraviolet (UV) schaduwen is niet nodig omdat de tetramethylrhodamine (TAMRA) -gemerkte G-quadruplex zal gemakkelijk met het blote oog. Nogmaals, zorg ervoor dat u een gesmolten controle op de gel bevatten.
3. Na een spectrofotometer lezing van de TAMRA-gemerkte DNA-G quadruplex, zoals in stap 1 verdunnen gevormde G-quadruplex tot 0,2 pmol / ul met TNE buffer. Voeg als glycerol tot 10% eindconcentratie en bewaar bij -20 ° C.

3. Transformatie (DE3) pLysS Competent Cells met PTRiEx4-DHX36 (Plasmid Encoding Human G4R1) en Grow / Laten Large bacterieculturen

1. Het verkrijgen van de TriEx4-DHX36 plasmide.
2. Aliquot de bacteriën in 20 pi aliquots en bewaar ze bij -80 ° C. Aliquot de SOC medium (2% trypton, 0,5% gistextract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 10 mM _MgCl2, 10 mM _MgSO4 en 20 mM glucose) in 80 pl porties en bewaar bij -80 ° C.
3. Bereid carbenicilline (CARB) / chlooramfenicol (CAM) LB-agar-platen. De concentraties van CARB en CAM zijn 50 mg / ml in H ₂ O en 35 mg / mL in 70% EtOH, respectievelijk, en deze zijn gericht 1000x; Het uiteindelijke concentraties in LB agar selectie platen 50 ug / ml en 35 ug / ml, respectievelijk.
4. Plaats 1 portie van bacteriën op ijs en plaats 1 portie van SOC medium bij kamertemperatuur. Voeg 1 ug pTriEx4-DHX36 plasmide om de bacteriën en schud zachtjes met de pipetpunt te mengen. Incuberen op ijs gedurende nog eens 5 min en vervolgens hitteschok bij 42 & #176; C gedurende 30 s. Plaats op ijs gedurende 2 minuten en voeg de SOC medium.
5. Plate de getransformeerde bacteriën op voorverwarmde borden selectie (meestal plaat een klein volume, zoals 5-10 pi, lage kolonie dichtheid te waarborgen, zodat enkele kolonies gemakkelijk in grote culturen kunnen worden geënt) en incubeer bij 37 ° CO / N.
6. Bereid Terrific Broth volgens de instructies van de fabrikant ^24. Maak 500 ml per grote fles (zorg ervoor dat glycerol toe te voegen) en de autoclaaf op een korte vloeistof cyclus.
7. Voeg CARB / CAM (50 gg / ml / 35 ug / ml) aan de brij en vervolgens beënt de kweken door middel agarproppen (met een P1000 pipet) die een bacteriële kolonie en pipetteren in de bouillon. Zwenk de culturen krachtig om hen te beluchten en vervolgens incubeer de culturen bij 37 ° CO / N zonder schudden.
8. De volgende dag, plaatst de kweken in een 37 ° C schudder en schudden bij ~ 225 tpm. Groeien de kweken totdat de OD ₆₀₀ is ongeveer 0,4 -0,6, die kenmerkend ongeveer 4-6 uur, afhankelijk van de initiële celdichtheid.
   LET OP: Dit zal periodieke monitoring dichtheid via spectrofotometrische metingen vereisen, en het is van cruciaal belang voor de culturen niet groeien tot veel boven 0,5 ods. Als een blanco voor spectrofotometrische lezingen, spin down 1 ml van bacteriën en het gebruik van de geklaarde bouillon als blanking oplossing.
9. Zodra de juiste OD ₆₀₀ wordt verkregen, onmiddellijk in zijn kweken op ijs en snel afkoelen ze 10 ° C. Bewaken van de temperatuur met een thermometer schoongeveegd met 70% EtOH. Versnellen van de koeling sneldraaiende de kolven terwijl op ijs, zoals verder bacteriegroei vóór recombinant eiwit inductie zal beperken.
10. Voeg IPTG aan een 1 mM uiteindelijke concentratie (~ 120 mg / 500 ml cultuur) en vervolgens te schudden op 80 rpm bij 14 ° C voor ~ 17-18 uur. De ideale temperatuur voor eiwit inductie werd gevonden dat 14 ° C; om dit het beste te bereiken, gebruik dan een gekoeld waterbad shaker located in een conventionele koude kamer en handmatig de temperatuur van het waterbad met een thermometer controleren.
    OPMERKING: U gebruikt een luchtgekoelde schudder / incubator, hoewel het noodzakelijk is om te testen wat digitaal ingesteld temperatuurinstelling de gewenste vloeistoftemperatuur (test dit oplevert door incubatie van een kolf van water met een thermometer erin en schudden bij 80 rpm enkele uren, het aanpassen van de digitale temperatuurinstelling daarvan tot 14 ° C is bereikt).
11. Plaats de kweken op ijs en snel koelen ze, zoals in stap 3,9. Neem een kleine hoeveelheid bacteriën en neem een OD ₆₀₀ lezing; idealiter de kweken tijdens inductie verdubbeld tot ongeveer 0,8-1,2 OD _600.
12. Breng de bacterie tot 500 ml centrifugebuizen en ze handmatig in evenwicht te brengen met behulp van bacteriecultuur om het gewicht tussen de buizen gelijk. Zodra evenwicht, centrifugeer ze op 3840 g gedurende 20 min bij 4 ° C. Giet de geklaarde bouillon en bevriezing van de bacteriële peltermijn bij -80 ° C tot het moment van eiwitzuivering.

4. Zuivering van Human rG4R1

1. Ontdooien en lyseren bacteriële pellets.
   1. Ontdooi de bacteriële pellet in 3 ml TN-buffer bij kamertemperatuur (TN buffer omvat 100 mM Tris pH 7,5 en 50 mM NaCl). Houd de flessen in de hand en krul te ontdooien / resuspendeer de bacteriële pellet. Ontdooide en relatief gelijkmatig gesuspendeerd, breng het volume tot 5 ml met TN-buffer (verder suspensie kan worden bereikt via en neer te pipetteren met een 5 ml pipet).
      NB: Het is typisch te ontdooien / prep 2 of 4 flessen op de dag van de voorbereiding, afhankelijk van het niveau van de gebruiker van comfort met de zuivering procedure.
   2. Los op 20 mg lysozym in 250 pl _H2O (per cultuur) en aan de geresuspendeerde bacteriën. Laat de lysozym aan de bacteriën verteren voor ~ 5-10 min, terwijl wervelende de flessen in de hand.
      OPMERKING: De kleur van de suspensioen begint iets lichter de vertering verloopt, en de suspensie relatief niet viskeus. Als de culturen te vol (dwz veel groter dan 1,2 OD ₆₀₀₎ en bacterieel chromosomaal DNA ongewenste viscositeit in dit stadium veroorzaakt.
   3. Voeg 250 ul van proteaseremmer cocktail (PIC) en een 10 pi aliquot van leupeptine. Meng grondig.
   4. Plaats op ijs en voeg 10 ml koud TN buffer en 22 pi van BME. Over te dragen aan een 50 ml buis.
   5. Ultrasone trillingen de bacteriën op ijs met een digitaal ultrasoonapparaat ingesteld op 30% amplitude. Puls op 2 s AAN en 2 s UIT gedurende 1 min. Herhaal de sonicatie 3 maal, waarbij de monsters afkoelen op ijs gedurende ten minste 2 minuten tussen de stappen sonicatie.
      LET OP: Met meerdere culturen, ultrasone trillingen ieder op zijn beurt voor het herhalen van de ultrasoonapparaat iteraties. Tijdens sonicatie, wees voorzichtig om de ultrasoonapparaat tip voldoende ondergedompeld in de bacteriële lysaat te houden, maar niet aanraken van the zijden van de buis, omdat dit overtollige warmte genereren.
   6. Voeg een gelijk volume (15 ml) koud 4x SSC + 20 pl van BME + 50 ui PIC + 1 aliquot van leupeptine en meng.
   7. In een tafelblad centrifuge voorgekoeld tot 4 ° C, gecentrifugeerd lysaten bij 2300 xg gedurende 20 min. Breng de bovenstaande om verse, pre-gekoelde 50 ml buizen (1 tube per grote cultuur worden klaargestoomd).
2. Bereid G4-magnetische korrels.
   1. Neem 1 ml streptavidine paramagnetische kralen (SPB) suspensie (per 1 liter cultuur) en overbrengen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Pellet de SPB met een magneet en was 2x met 2x SSC + 5 mM EDTA pH 8. Resuspendeer de gewassen SPB in 200 pi van dezelfde oplossing voor het wassen van de parels.
   2. Voeg een 3 OD hoeveelheid van G4-DNA (Z33-Bio G4 bereid in paragraaf 1) om de SPB schorsing en meng snel door en neer te pipetteren meerdere malen. Plaats de buizen op een rotator en roteren bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten (en tot 60 min).
   3. achteruiter deze periode van rotatie, blokkeren de G4-gebonden SPB door toevoeging van 1 ml 0,4% lactalbumine, en blijf op ijs totdat het nodig is. Verdun de 0,4% lactalbumine van de 4% lactalbumine voorraad met behulp van 1x Tris-glycine.
      Opmerking: Het aandeel 4% lactalbumine (w / v) wordt normaliter bereid door oplossen in 2 M glycine pH 7,5, met de verdere toevoeging van 1 x PIC en 0,05% natriumazide.
3. Bind histidine-tag rG4R1 kobalt kralen (CB) (vervolg van stap 4.1).
   1. Voeg 1 ml CB slurrie (equivalent aan een 0,5 mL kraal volume) aan elk 50 ml buis met bacterieel lysaat geklaard. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur op een rotator.
      OPMERKING: 0,5 ml kraal volume wordt per 1 L van geklaard lysaat; bijvoorbeeld als twee 500 ml bacterieculturen bereid, alleen CB toevoegen 50 ml buis met geklaarde lysaat van één van de kweken op dit punt, zoals lysaat van de tweede cultuur serieel verbonden met dezelfde 0,5 ml CB in step 4.3.3).
   2. Spin down CB bij 110 g gedurende 5 min in een 4 ° C tafelblad centrifuge. Zuig de vloeistof voorzichtig, en een paar ml vloeistof teneinde de gepelleteerde CB niet storen. Wassen met 10-15 ml koud 4x SSC + BME (0,5 pl van BME / mL 4x SSC).
      OPMERKING: wassen, giet 10-15 ml direct op het kobalt gepelleteerde korrels in plaats van pipetteren, zoals pipetteren maakt dat de korrels om vast te zitten aan de binnenkant van de pipet en eiwit verloren.
   3. Pellet de CB opnieuw via centrifugeren en giet de volgende geklaarde lysaat (30 ml, die de 2 ^e grote geïnduceerde bacteriecultuur) op het ingehulde CB. Incubeer nogmaals 20 minuten bij kamertemperatuur op de rotator en was daarna tweemaal met 10-15 ml van 4x SSC + BME. Pellet bij 110 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
   4. Na de tweede wasbeurt, zuig de vloeistof en laat ongeveer 2 ml kralen / vloeistof op de bodem van de buis. Breng de eiwitgebonden CB een voorgekoelde 2 ml buisjemet behulp van een 1 ml "wide-bore" pipet tip.
      OPMERKING: Gebruik een nieuw scheermesje tot het einde van de punt vóór de overdracht snijden, het gebruik van deze "wide-bore" pipetpunt het verlies van eiwitgebonden kobalt korrels verminderen.
   5. Kort Centrifugeer de kralen in de 2 ml buis met hoge snelheid (~ 18.000 xg) in een microcentrifuge bij 4 ° C (~ 5-10 s is alles wat nodig is om snel pelleteren). Verwijder voorzichtig en gooi de supernatant door pipetteren, voorzichtig om niet te verliezen het eiwit gebonden CB.
4. Elueer rG4R1 van CB.
   1. Incubeer de CB in 0,5 ml histidine elutiebuffer (HEB) op een rotator gedurende 5 minuten in een koude kamer. Nogmaals, bij het toevoegen van HEB, net pipet van 0,5 ml op de korrels (CB verlies te elimineren) en resuspendeer de kralen door het omkeren van de buis. HEB 0,7 M L-histidine pH 6 (de pH wordt aangepast met azijnzuur).
   2. Centrifugeer bij 18.000 xg bij 4 ° C een microcentrifuge gedurende 1 minuut. Breng de bovenstaandeeen voorgekoelde 15 mL buis. Verwijder en breng de eiwitbevattende supernatant door voorzichtig pipetteren, waardoor een kleine hoeveelheid vloeistof op het CB.
   3. Herhaal stap 4.4.1 en 4.4.2 voor een totaal van 3 HEB eluties.
   4. Elueer eenmaal met 0,2 M EDTA pH 6,0; de kleur van het CB zal veranderen van roze naar wit als het EDTA chelaten het kobalt.
   5. Na deze vierde en laatste elutie is overgedragen aan de 15 mL buis, pipet de resterende elutiebuffer uit de CB door een gel-lading-punt aan het uiteinde van een 1 ml pipet tip; door dompelen tip aan de bodem van de buis, kan residuele eiwithoudende elutiebuffer verzameld.
5. Binden rG4R1 naar G4 gebonden SPB en elueer recombinant enzym in een ATP-afhankelijke wijze.
   1. Bereid 5x Res Buffer: 250 mM Tris-acetaat pH 7,8, 250 mM NaCl, 2,5 mM _MgCl2 en 50% glycerol. Bereid 3x Res Buffer: 0,915 ml _H2O, 2 ml 5x Res Buffer, 0,33 ml 0,4% lactoalbumine (diluted van 4% lactalbumine met 1x Tris-glycine), 0,010 ml BME, 0,015 ml 1 M _MgCl2, 0,050 ml PIC en 0,010 ml leupeptine. Houd op het ijs.
      Opmerking: Het aandeel 4% lactalbumine (w / v) wordt normaliter bereid door oplossen in 2 M glycine pH 7,5, met de verdere toevoeging van 1 x PIC en 0,05% natriumazide.
   2. Pellet G4-SPB aan de zijkant van de buis met een magneet Verwijder de bovenstaande vloeistof (G4-SPB, zoals bereid in stap 4,2). Voeg 1 ml 3x Res Buffer naar de G4-SPB en pipet te mengen.
   3. Pipetteer deze 1 ml G4-SPB gesuspendeerd in 3x Res buffer in de 15 ml buis met ~ 2 ml eiwithoudende HEB / EDTA (eluaat van stap 4.4). Incubeer gedurende 15 minuten in een 37 ° C waterbad met af en toe roeren, zodat de korrels geen genoegen.
   4. Op ijs, de pellet eiwitgebonden G4-SPB aan de zijkant van de buis met een magneet. Te wassen, voeg 1 mL 4x SSC + 0,4% lactalbumine (+ 0,5 ul / ml BME) en pipet om de kralen resuspenderen. Pellet kralen met thij magneet op ijs. Herhaal deze te wassen voor een totaal van 2 wasbeurten.
      OPMERKING: geduld is vereist tijdens de wasprocedure zodat alle magnetische korrels werden gepelleteerd tussen wasbeurten. Dit geldt met name gezien de toegenomen viscositeit van de oplossing door de glycerol in de Res buffers.
   5. Was de G4-SPB 1x met 1 ml 3x Res Buffer.
   6. Bereid elutiebuffer (EB): 0,5 ml 3x Res buffer, 0,1 ml 0,1 M ATP en 0,4 ml _H2O
   7. Voorverwarmen 1 ml EB tot 37 ° C in PCR-buizen verdeeld over het verwarmingsblok van een thermische cycler ingesteld op 37 ° C.
   8. Pellet G4-SPB met de magneet op ijs en resuspendeer de kralen in 100 ul voorverwarmde EB. Onmiddellijk over de kralen een voorverwarmde PCR-buis en incubeer gedurende 30 s bij 37 ° C.
   9. Onmiddellijk voeg 12 ul 5 M NaCl en pipet op en neer krachtig 20 - 30 maal. De combinatie van de hoge zout en ATP in de EBdient om rG4R1 elueren uit de G4-kralen.
      Opmerking: Het is zeer belangrijk om het aantal bellen gevormd tijdens het pipetteren te minimaliseren, zoals bellen het eiwit denatureren.
   10. Onmiddellijk pellet G4-SPB met een magneet en breng de eiwithoudende eluaat een nieuwe PCR buis op ijs (gemerkt met datum).
   11. Herhaal de elutie en de overdracht in stappen 4.5.8-4.5.10 beschreven; het eindproduct van deze werkwijze is derhalve ~ 200 pl EB met gezuiverde rG4R1. Gereserveerd twee 7 uL aliquots (in PCR buizen voorzien van de juiste datum) bestemd voor de kwaliteitscontrole enzymatische activiteit test die testen of zeer actieve rG4R1 inderdaad gezuiverd.
   12. Bewaar de gezuiverde rG4R1 bij -80 ° C tot het tijdstip van de activiteitstest.

5. Quality Control enzymatische activiteit Assay van gezuiverde rG4R1

1. Voor elke bereiding van rG4R1 te testen Bereid 300 ulvan resolvase assay buffer (RAB), waarbij elke 30 pi bevat 0,2 pmol gelabelde TAMRA Z33 G4-DNA (bereid in stap 2); de samenstelling van de RAB is als volgt: 0,1 ml 3x Res buffer, 0,01 ml 0,2 pmol / ul G4-Z33-TAM, 0,03 ml 0,1 M ATP en 0,16 ml H ₂ O. In een strook 6 PCR buizen Pipetteer 40 ul van RAB in de eerste buis en 30 pi van RAB in de overige buizen (houd de buizen op ijs bij dit punt).
2. Ophalen één van de 7 pl rG4R1 porties (uit stap 4.5.11) en plaats het op ijs. Met een p20 pipet ingesteld op 5 pl, voorzichtig pipet op en neer een paar keer om de rG4R1 te mengen in de hoeveelheid en de overdracht 5 pi van de eerste buis van de strook van 6 PCR buizen (degene die 40 ul van RAB bevat). Stel vervolgens het pipet 10 pi en serieel over te dragen 10 pi om de resterende PCR-buisjes met RAB.
3. Onmiddellijk incuberen deze strook PCR buizen bij 37 ° C gedurende 30 min in een thermische cycler, gevolgd door een greep 4 ° C.Open de tubes terwijl ze worden vastgehouden bij 4 ° C en voeg 2 pl 0,5 M EDTA pH 8 aan elke buis (om de enzymatische reactie te stoppen).
4. Giet een 10% acrylamide / 1x TBE / 10% glycerol gel. Na het verwijderen van de kam, wassen de putten met 1x TBE. Voeg 5 ul van een hoge massa hydrofiele polysaccharide (30% Ficoll in _H2O) aan elke buis en de belasting 15 pi van elke buis (het laden van putjes kan weer waargenomen door gebruik Schlieren lijnen).
   1. Als controle voor G4-DNA mobiliteit, voeg 4 pi van een hoge massa, hydrofiele polysaccharide 20 pl RAB en load 15 pi; als controle voor afgerold monomere Z33, warmte 20 pl RAB bij 98 ° C gedurende 10 minuten, voeg 4 pi van een hoge massa, hydrofiele polysaccharide en load 15 pi.
5. Voer de elektroforese bij 120 V gedurende 2 uur met 1x TBE als loopbuffer. Het imago van de gel op een multimodale imager met fluorescentie-imaging mogelijkheid gebruik TAMRA-specifieke filters (prikkelen met een 532 nm groene laser en gebruik een 580 nm band pas 30-filter (580 BP 30)).
   OPMERKING: Een zeer actieve bereiding van rG4R1 zal volledig verdwijnen van de TAMRA-gemerkt Z33 op in de eerste 3 lanen die werden geladen op de gel, zoals weergegeven in figuur 2.

6. Pooling van Highly Active rG4R1 Preps, aliquoting en opslag

OPMERKING: Deze stap vereist 2 personen. Het aantal en enzymatische behoeften van de downstream assays die de gezuiverde rG4R1 wordt gebruikt bepaalt hoeveel preparaten vóór aliquoteren nodig. Een typische grote bereiding wordt gevormd door de samenvoeging van 8 zeer actieve preparaten (dus met een totaal van 16 geïnduceerd 500 ml bacterieculturen), maar dit is een willekeurig getal en laboratorium-specifiek.

1. Berekent het totale volume van zeer actieve, zuivere rG4R1 dat moet worden porties. Typisch worden 7 ul aliquots gebruikt downstream assays. Vul het blok van een thermische cycler ingesteld op 4 ° C met strip PCR buizen (deze worden verdeeld in, als de vaste aard van het blok de snelle sluiting van de PCR strips versnellen).
2. Haal de PCR-buisjes met zeer actieve rG4R1 van -80 ° C en snel ontdooien de buizen in de hand; wanneer een kleine hoeveelheid ijs wordt gelaten in de buis, plaats de buizen op ijs. Combineer alle van de snel-ontdooide bereidingen in een voorgekoeld, 15 ml buis en meng goed, en zorg ervoor dat bubbels te minimaliseren.
3. Een automatisch herhalen pipet afzien de gewenste hoeveelheid volume in de voorgekoeld PCR strip buisjes in de thermische cycler. Zodra 1-2 strips zijn voltooid, hebben de tweede persoon sluit de deksels en overbrengen naar 96-well wafers die zweven in vloeibare stikstof (Snelkoeling is nodig om enzymatische activiteit te behouden).
   OPMERKING: langer duren dan ongeveer 200 pi van rG4R1 in de punt van de automatische pipet tegelijk om de tijd te verminderen dat het enzym niet bij 4° C.
4. Zodra de voorgekoelde PCR strip buisjes in de thermische cycler zijn gevuld met aliquots en goed bevroren snel meer voorgekoeld PCR strip buizen overbrengen van ijs om de thermische cycler en verder aliquoteren. Ga zo door tot de rest van het enzym werd in porties verdeeld, snel bevroren in vloeibare stikstof en overgebracht naar droog ijs. Breng tenslotte de monsters tot -80 ° C voor langdurige opslag.

7. Kwantificering van gezuiverde rG4R1 Concentratie

1. Giet een standaard 5% stacking / 12% oplossing van acrylamide / SDS gel voor eiwit scheiding.
2. Dooi ongeveer 50 pl porties verdeeld rG4R1, combineren in één buis en meng. Meet het juiste volume met een pipet en voeg een gelijke hoeveelheid 2x Laemmli monsterbuffer (65,8 mM Tris-HCl pH 6,8, 26,3% (w / v) glycerol, 2,1% SDS en 0,02% broomfenolblauw) + BME (50 uL / 950 pl 2x Laemmli buffer). Denatureren de eiwitten bij 98 ° C gedurende 10 minuten.
3. Bereid verdunningen van breed bereik MW markers in 1 x monsterbuffer + BME zodat de volgende hoeveelheden eiwit kunnen worden geladen op de gel als standaarden: 31,3, 62,5, 125, 250 en 500 ng.
   OPMERKING: Elk eiwit standaard in het brede bereik MW merkers aanwezig in 0,1 ug / ul, met uitzondering van het 50 kDa eiwit, dat aanwezig is in 0,3 ug / ul. Deze merkers hoeft geen warmte denatureren.
4. Verwijder de kam uit de gel en spoel de putjes met standaard 1x SDS / glycine loopbuffer. Laad het equivalent van 25 en 12,5 pl rG4R1 (die 50 en 25 pi gedenatureerd eiwit), maar de optimale hoeveelheid enzym geladen moet worden bepaald door de gebruiker, als de concentratie van de enzympreparaten variëren (bijvoorbeeld 35 ui werd geladen op de gel in figuur 3). Plaats het eiwit standaards bereid in stap 7.3. Zorg ervoor dat de pipetten goed worden geijkt, en zorg ervoor dat zo nauwkeurig possib te zijnle met pipetteertechniek om nauwkeurige kwantificering te verzekeren.
5. Voer de gel bij 120 V, totdat de kleurstof voorkant ongeveer 2/3 van de gel heeft doorlopen (om een ​​goede scheiding van de eiwitten die deel uitmaken van de brede range MW markers te verzekeren).
6. Verwijder de gel en gooi het gedeelte van de gel die geen eiwit bevatten snijden veranderen met een scheermesje. Plaats de gel in een glas schotel of gelijkwaardige opvangbak. Vlekken op de gel met Coomassie kleurstof (50 mg Coomassie R-250 per 100 ml 50:10:40 v / v methanol: azijnzuur: H ₂ O die door middel van een filter-paper trechter heeft gefilterd) O / N bij kamertemperatuur op een rondschudapparaat set voldoende roeren van de gel te waarborgen.
7. De-vlekken op de gel met 30:10:60 v / v methanol: azijnzuur: H ₂ O met behulp van gebald-up, niet-pluizende papieren zakdoekje te ontkleuren bespoedigen. Wijzig de ontkleuroplossing indien nodig. Doorgaan ontkleuren totdat de achtergrond is voldoende laag is om rG4R1 en eiwit normen te visualiseren; een typische gel in ditfase is weergegeven in figuur 3.
8. Plaats de ontkleurd gel in tussen een blad beschermer en scan de gel bij ≥300 dpi resolutie. Open de gescande afbeelding in een beeldanalyse software (zoals Fuji Multiguage of equivalent) en bereiden standaardcurven van proteïnestandaarden die overeenkomen met 75, 100 en 150 kDa (de curven vertegenwoordigen gram bedragen versus densitometrische aflezingen). Zorg ervoor dat u aftrekken van de achtergrond van elke baan wordt gekwantificeerd tijdens het proces van het verkrijgen van densitometrische waarden.
9. Aangenomen dat de volumehoeveelheid rG4R1 dat op de gel werd geladen bevat een hoeveelheid eiwit die binnen het lineaire bereik van deze standaard curves, de gram hoeveelheid eiwit per microliter rG4R1 geladen kunnen worden geëxtrapoleerd.
10. Zetten de geëxtrapoleerde gram hoeveelheid rG4R1 in een molaire hoeveelheid met het molecuulgewicht van G4R1, die 120.000 g / mol.
    LET OP: Voor elke gel, zal drie geëxtrapoleerd waardengegenereerd (een voor elk van de drie proteïne markers gebruikt om de standaard curves genereren: 75, 100 en 150 kDa). Run twee andere gels en vlekken en kwantificeren van hen door het herhalen van stappen 7,1-7,10. Met de resultaten van de kwantificering van de eerste gel, zal de gebruiker in staat te schatten hoeveel rG4R1 moet over verdere gels te laden tot een bedrag dat binnen het lineaire bereik van de eiwitstandaarden verkregen. Al met al, extrapoleren negen waarden vertegenwoordigen de concentratie van zeer actieve, gezuiverd rG4R1. Gemiddelde van deze waarden om de uiteindelijke batch-specifieke rG4R1 concentratie die typerend in het traject van 20-100 nM. Bepaal de standaardafwijking van deze waarden (n = 9).

Resultaten

Dit protocol (figuur 1) routinematig levert bijna pure, katalytisch actieve rG4R1. Als maat voor de enzymatische activiteit wordt meestal waargenomen dat 50% van 0,2 pmol TAMRA-gemerkt tetramolecular G4-DNA in monomeren omgezet in het 0,2-0,013 ul reeks rG4R1, zoals bepaald door de G4 activiteitstest hierboven (figuur geschetste 2). Coomassiekleuring gezuiverd rG4R1 markeert een afzonderlijke band bij het verwachte 120 kDa groot, met een ondergeschikte verontreinigende ...

Discussie

Dit protocol is een zeer efficiënte expressie, zuivering en kwantificering regeling voor de isolatie van het DHX36 genproduct, G4-Resolvase1 (G4R1, ook wel Rhau en DHX36) (figuur 1). Dit protocol maakt gebruik van twee zuivering stappen: His-tag affiniteit zuivering op kobalt affiniteit kralen en enzymatische zuivering op G4-DNA-geconjugeerde kralen. De laatste stap is uniek omdat het profiteert van de strakke affiniteit, hoge specificiteit en afwikkelen katalytische activiteit die rG4R1 heeft voor G4 s...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
TriEx4-DHX36 plasmid	Addgene	68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cells	Novagen	71403-4
S.O.C medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
Difco Terrific Broth	Becton Dickinson	243820
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919	35 µg/mL in bacteriële platen/grote culturen
Carbenicillin (getest voor plantencelcultuur)	Sigma-Aldrich	C3416	50 µg/mL in bacteriële platen/grote culturen
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)	Sigma-Aldrich	I6758
Lysozyme (uit kippeneiwit)	Sigma-Aldrich	L6876
1 M Tris-HCl, pH 8	Universal Scientific Supply Co.	1963-B	of uit standaardbron
1 M Tris-HCl, pH 7	Universal Scientific Supply Co.	1966	of uit standaardbron
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8			Voor het gieten van het resolutie-gel (voor eiwitkwantificeringsgel); Uit standaardbron
1 M Tris-HCl, pH 6.8			Voor het gieten van het stacking-gel (voor eiwitkwantificeringsgel); Uit standaardbron
1 M Tris-Acetaat, pH 7.8	Universal Scientific Supply Co.	1981	of uit standaardbron
70% Ethanol			Uit standaardbron
Magnesiumchloride (1 M oplossing)	Life Technologies	AM9530G
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	S7653
Natriumacetaat	Sigma-Aldrich	S8750
20x SSC	Universal Scientific Supply Co.	1665	of uit standaardbron
β-mercaptoethanol (2-BME)	Sigma-Aldrich	63689
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8849
Leupeptine hemisulfaat	Sigma-Aldrich	L8511
Streptavidine paramagnetische kralen	Promega	Z5482
0.5 M EDTA, pH 8	Universal Scientific Supply Co.	0718	of uit standaardbron
0.2 M EDTA, pH 6	Universal Scientific Supply Co.		Uit standaardbron; pas pH aanvankelijk aan met NaOH, pas vervolgens de pH terug naar beneden met HCl.
A-lactalbumine (Type 1 uit rundermelk)	Sigma-Aldrich	L5385
Kobaltmetaal affiniteitkralen	Clonetech	635502
L-Histidine	Sigma-Aldrich	H8000
Ijsazijnzuur	Fisher Scientific	A38-500
Adenosine 5'-Trifosfaat (uit bacteriële bron)	Sigma	A7699
40% acrylamide/Bis oplossing (37,5:1)	Biorad	161-0148
Glycine	Sigma-Aldrich	50046	om eiwitgel-loopbuffer te maken (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0,1% SDS)
10% Natriumdodecylsulfaat (SDS)	Universal Scientific Supply Co.	1667	om eiwitgel-loopbuffer te maken (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0,1% SDS); of uit standaardbron
10x TBE	Sigma-Aldrich	11666703001	of uit standaardbron
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	om eiwitgel-loopbuffer te maken (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0,1% SDS); Uit standaardbron
TEMED	Sigma-Aldrich	411019
Ammoniumpersulfaat (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
Broad Range Protein MW markers	Promega	V8491
Gebiotineerde Z33 oligo ("Z33-Bio")	Oligos Etc		5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotine 3’
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM")	Oligos Etc		5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
Fluor-gecoate TLC-plaat	Life Technologies	AM10110
Ficoll	Sigma-Aldrich	F2637	30% in H2O
Coomassie R-250	Sigma-Aldrich	27816
Methanol	Fisher Scientific	A412
Multiband UV-lamp			In staat om UV-licht uit te zenden bij 365 nm
Centrifuge voor op tafel (met roterende emmerrotor)			In staat om afgekoeld te worden tot 4 °C
Microcentrifuge			In staat om afgekoeld te worden tot 4 °C
Digital Sonfier	Branson		Of equivalent dat in staat is om sonificatiepulsen te leveren (30% amplitude, 2 s AANWEZIG/2 s UIT)
50 °C waterbad			Voor de vorming van Z33 in quadruplex
37 °C incubator voor bacteriën			Voor bacteriële transformaties en initiële overnachtelijke groei van grote culturen van Rosetta2 E. coli getransformeerd met TriEx4-DHX36
37 °C/14 °C schuddende incubator voor bacteriën			Voor groei en eiwitinductie van grote culturen van Rosetta2 E. coli getransformeerd met TriEx4-DHX36
Spectrofotometer			in staat om OD600 te lezen; in staat om oligomeerconcentraties te lezen op basis van basesequentie (zoals Biorad SmartSpec 3000)