Methodenartikel

Detectie van microRNA-expressie in peritoneale membraan van ratten met behulp van kwantitatieve real-time PCR

DOI:

10.3791/55505

⸱

27 juni 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Nephrology, Department of Internal Medicine, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor de detectie van microRNA expressie in het peritoneale membraan van de ratten met behulp van kwantitatieve real-time reverse-transcriptie-polymerase kettingreactie. Deze methode is geschikt voor het bestuderen van het microRNA-expressieprofiel in het peritoneale membraan in verschillende pathologische omstandigheden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) zijn kleine niet-coderende RNA's die post-transcriptie van messenger RNA regelen. Het miRNA expressieprofiel is onderzocht in verschillende organen en weefsels in rat. Standaardmethoden voor de zuivering van miRNA's en detectie van hun expressie in het peritoneale membraan van de rat zijn echter niet goed vastgesteld. We hebben een effectieve en betrouwbare methode ontwikkeld om miRNA's te zuiveren en kwantificeren met behulp van kwantitatieve real-time reverse-transcriptie-polymerase kettingreactie (qRT-PCR) in het peritoneale membraan van de rat. Dit protocol bestaat uit vier stappen: 1) zuivering van het peritoneale membraan monster; 2) zuivering van totaal RNA inclusief miRNA uit peritoneale membraanmonster; 3) reverse transcriptie van miRNA om cDNA te produceren; En 4) qRT-PCR om miRNA expressie te detecteren. Met behulp van dit protocol, hebben we met succes vastgesteld dat de expressie van zes miRNA's (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 en miRNA-34a-5p) toegenomenSignificant in het peritoneale membraan van een rat peritoneale fibrose model vergeleken met die in controle groepen. Dit protocol kan gebruikt worden om het profiel van miRNA expressie in het peritoneale membraan van ratten te onderzoeken in veel pathologische omstandigheden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNA's (miRNAs) zijn korte, niet-coderende RNA's die expressie-expressie op messenger RNA (mRNA) expressie 1 regelen. Veranderingen in de expressie van miRNAs regelen de expressie van veel mRNAs die pivotale rollen spelen in verschillende pathologische aandoeningen, waaronder kanker, ontsteking, metabolische aandoeningen en fibrose 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Daarom hebben miRNAs potentieel als nieuwe biomarkers en therapeutische doelen 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Het miRNA expressieprofiel is bepaald in verschillende ratOrganen en weefsels, waaronder lever, hart, long en nier 9 . Echter, standaardmethoden voor de zuivering en detectie van miRNA's in het peritoneale membraan van de rat zijn niet goed vastgesteld.

Het algemene doel van dit protocol is om miRNAs succesvol te zuiveren en te detecteren in het peritoneale membraan van de rat. Ten eerste werd het peritoneale membraanmonster gehomogeniseerd onder gebruikmaking van een glashomogenisator, gevolgd door blootstelling aan een biopolymeer-versnippersysteem in een microcentrifuge spin kolom 10 . Vervolgens werd het totale RNA inclusief miRNA gezuiverd uit het peritoneale membraanmonster onder gebruikmaking van een spin-kolom 10 op siliciumdioxide-membraan. Vervolgens werd cDNA gesynthetiseerd uit het gezuiverde totale RNA onder toepassing van reverse transcriptase, poly (A) polymerase en oligo-dT primer 11 . Tenslotte werd de expressie van miRNA bepaald door qRT-PCR onder gebruikmaking van een intercalerende kleurstof 11 . De reden voor dit protocol is bZoals bij eerdere studies die significante zuivering en detectie van miRNA in weefsels aantoonden door een simpel proces 8 , 10 , 11 . Er is gemeld dat het gebruik van een biopolymeer-versnippersysteem in een microcentrifuge-spinkolom en siliciumdioxide-membraan-gebaseerde spinkolom het totale RNA van hoogwaardig RNA van weefsels 10 kan zuiveren. De werkwijze voor het synthetiseren van cDNA uit gezuiverd totaal RNA onder toepassing van omgekeerde transcriptase, poly (A) polymerase en oligo-dT primer, en de methode om miRNA expressie te detecteren door qRT-PCR onder gebruikmaking van intercalerende kleurstof in dit protocol is aangetoond dat ze hoge nauwkeurigheid en Gevoeligheid 11 . Bovendien is dit een eenvoudig proces, wat tijd bespaart en technische fout voorkomt. Daarom is dit protocol nuttig in studies die zeer nauwkeurige en gevoelige detectie van miRNA in het peritoneale membraan in een breed scala aan pathologische omstandigheden vereisen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierlijke experimentele protocollen werden goedgekeurd door de dieretiek commissie van Jichi Medical University en werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen Gebruik en verzorging van experimentele dieren van de Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.

1. Peritoneum Monster Collection

  1. Verzamel de volgende items: 50 ml centrifuge buis met katoen doordrenkt in isofluraan, kurkblad, Petri schotel met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), chirurgische schaar en tang.
  2. Euthanize een rat met een overdosis isofluoraan, bespuit de abdominale huid van de rat met 70% ethanol en zet de rat op het kurkblad op zijn rug.
  3. Maak een longitudinale incisie in de buik-, spier- en buikvliesmembraan met behulp van de schaar en de tang.
  4. Breng het peritoneale membraan op met behulp van de tang en maak horizontale incisies op het bovenste gedeelte langs het onderste ribbenbeen onder het diafragma en op zijn lAan de zijkant van het zijkantgebied met behulp van de chirurgische schaar. Maak vervolgens laterale longitudinale insnijdingen om het peritoneale membraan van het lichaam te verwijderen met behulp van de chirurgische schaar. Doe het dan met PBS in een petrischaal.
  5. Knip 20 mg (3-5 mm 2 ) peritoneale membraanmonsters uit en snijd deze af, die geschikt is voor de volgende stappen, met behulp van de chirurgische schaar en de tang.

2. Het zuiveren van totale RNA's uit peritoneale membraanmonsters

OPMERKING: Hier worden peritoneale membraan monsters met een gewicht van 20 mg gehomogeniseerd met behulp van een glashomogenisator en een biopolymeer-versnippersysteem in een microcentrifuge spin kolom. Vervolgens wordt het totale RNA van het peritoneale membraanmonster geïsoleerd door middel van een spin-kolom op siliciumdioxide-membraan.

  1. Verzamel de volgende items: 1,5 of 2,0 ml microcentrifuge buizen, 100% ethanol, chloroform, glas homogenisator, ijs, biopolymeer-versnippersysteem in een microcentrifuge spin kolom 10 siliciumdioxide membraan gebaseerde spin kolom 10 , fenol / guanidine op basis van lysis reagens, wasbuffer met inbegrip van guanidine en ethanol (wasbuffer 1) en wasbuffer omvattende ethanol (wasbuffer 2).
  2. Zet een 20 mg peritoneale membraanmonster in een glazen homogenisator en voeg 700 μL van het fenol / guanidine-gebaseerde lysisreagens toe.
  3. Homogeniseer het peritoneale membraan monster door de stamper langzaam op het monster te drukken met draaiing. Herhaal dit proces meerdere tientallen keer op ijs totdat het peritoneale membraanmonster volledig is opgelost in het fenol / guanidine-gebaseerde lysisreagens.
  4. Voor verdere homogenisatie, geef gehomogeniseerd lysaat over aan het biopolymeer-versnippersysteem in een microcentrifuge-spinkolom in een collectiebuis van 2,0 ml. Vervolgens centrifugeer het bij 14.000 xg gedurende 3 minuten bij 4 ° C.
  5. Breng het gehomogeniseerde lysaat over naar een nieuwe microcentrifugebuis.
  6. Voeg 140 μl chloroform toe aan het gehomogeniseerde lysaat en doe de doos dichtE veilig. Meng dan de buis door inversie gedurende 15 s.
  7. Incubeer de monsters gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens centrifugeren ze bij 12.000 xg gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
  8. Breng de supernatant (gewoonlijk 300 μL) over naar een nieuwe microcentrifugebuis zonder het neerslag te storen en voeg het volume (meestal 450 μl) 100% ethanol toe. Meng het monster vervolgens gedurende 5 s door vortexen.
  9. Pipetteer tot 700 μL van het monster in een siliciumdioxide-membraan gebaseerde spin kolom geplaatst in een 2,0 ml collectie buis. Sluit de kap van de kolom. Vervolgens centrifugeer het bij 15.000 xg gedurende 15 s. Verwijder na het centrifugeren de doorstroming in de verzamelbuis.
  10. Voeg 700 μl wasbuffer 1 toe aan de op de siliciumdioxide membraan gebaseerde spin kolom om het monster strikt te wassen. Sluit de kap van de kolom. Vervolgens centrifugeer het bij 15.000 xg gedurende 15 s. Verwijder na het centrifugeren de doorstroming in de verzamelbuis.
  11. Voeg 500 μl wasbuffer 2 toe aan de silica-membRane-based spin kolom om elk spoor van zout te verwijderen. Sluit de kap van de kolom. Vervolgens centrifugeer het bij 15.000 xg gedurende 15 s. Verwijder na het centrifugeren de doorstroming in de verzamelbuis.
  12. Herhaal 2.11.
  13. Centrifugeer de siliciumdioxide-membraan-gebaseerde spinkolom opnieuw gedurende 15 minuten bij 15.000 xg. Verwijder na het centrifugeren de doorstroming in de verzamelbuis.
  14. Plaats de siliciumdioxide-membraan-gebaseerde spin kolom in een nieuwe 1,5 ml collectie buis. Vervolgens 25 μL RNase-vrij water in de kolom. Sluit de kap van de kolom. Laat het monster gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur staan. Centrifugeer dan gedurende 15 minuten 15.000 xg.
  15. Breng het 25 μL eluaat met totaal RNA over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Bewaar het dan bij -80 ° C voor gebruik.

3. Reverse transcriptie van Total RNA

OPMERKING: Referentie en naleving van de minimale informatie voor publicatie van kwantitatieve real-time PCR ExperIments (MIQE) richtlijnen stimuleren betere praktijk en helpen bij het verkrijgen van betrouwbare en ondubbelzinnige resultaten 12 .
OPMERKING: hier wordt in totaal 1,0 μg geïsoleerde RNA omgekeerd getranscribeerd onder toepassing van het omgekeerde transcriptase, poly (A) polymerase en oligo-dT primer.

  1. Verzamel de volgende items: 1,5 ml microcentrifuge buizen; Acht-brede stripbuizen; RNase-vrij water; ijs; Reverse transcriptase kit (zie materiaal tabel) 11 .
  2. Bereid een master mix oplossing op die 2,0 μL 10x nucleïnezuurmix, 2,0 μL reverse transcriptase mix (uit de kit) bevat en 4,0 μL 5x hi-spec buffer voor een totaal van 8,0 μL per tube.
  3. Spuit 8,0 μL master mix oplossing (uit de kit) in elke buis.
  4. Meet de hoeveelheid totale RNA's met behulp van een spectrofotometer. Voeg 1,0 μg geïsoleerde totale RNA's gezuiverd van het peritoneale membraanmonster aan elke buis.
    OPMERKING: qRT-PCR kan worden uitgevoerd usiNg totale RNA's als een template zonder reverse transcriptie voor de kwaliteitscontrole van gezuiverde totale RNA's. Als een DNA besmet is, worden onverwachte amplificatieproducten waargenomen door qRT-PCR.
  5. Voeg RNase-vrij water aan elke buis toe aan een totaal van 20 μl. Meng dan grondig door pipettering en centrifugeer deze gedurende 15 s.
  6. Incubeer de monsters gedurende 60 minuten bij 37 ° C. Incubeer 5 minuten bij 95 ° C onmiddellijk.
    OPMERKING: Deze stap kan uitgevoerd worden in een thermische cyclus.
  7. Breng cDNA over naar een nieuwe microcentrifugebuis en verdun tien keer (1:10) met RNase-vrij water.
  8. Bewaar het verdunde cDNA op ijs tijdelijk en bij -80 ° C voor lange termijn voor gebruik.

4. qRT-PCR van miRNA

OPMERKING: qRT-PCR van miRNA wordt uitgevoerd met behulp van intercalerende kleurstof. Hier zijn primers voor RNA, U6 kleine nucleaire 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 en miRNA-34a-5p waren gebruikt.

  1. Verzamel de volgende items: 1,5 ml microcentrifugebuizen, 96-putjes reactieplaat voor qRT-PCR, kleefstof voor de 96-putjes reactieplaat, miRNA-specifieke primers, PCR-kit met groene kleurstof (zie materiaaltabel) 11 en een Real-time PCR instrument.
  2. Bereid een master mix op met 12,5 μL 2x PCR master mix, 2,5 μL van 5 μM elke miRNA primer opgelost in nucleasevrij water en 1,25 μL 10x universele primer voor elke put.
  3. Dispenseer 22,5 μL master mix in elke put van de 96-putjes plaat.
  4. Voeg 2,5 μl sjabloon cDNA toe aan elke put.
  5. Verzegel de plaat met lijmfolie voor de 96-putjes reactieplaat. Centrifugeer dan de plaat bij 1000 xg gedurende 30 s.
  6. Voer het PCR-cyclusprogramma uit met het real-time PCR Instrument en de software als volgt.
    1. Zet de plaat in het real-time PCR instrument. Bepaal in de real-time PCR-software experimentele eigenschappen (input experimentalNaam, kies "96 putten" voor het experimentele type instrument, kies "2 - ΔΔCT methode" voor de kwantificatiewerkwijze, kies "SYBR green reagents" voor het reagens om de doelsequentie te detecteren, kies "standaard oprit snelheid" voor de Instrument run).
    2. Geef dan de namen toe aan de monsters en doe miRNAs in elke put. Monsters worden altijd getest in tweevoud of drievoud om voldoende data te verkrijgen voor de validatie van de resultaten. Selecteer referentiemonster en endogene controle. Selecteer "none" voor de kleurstof die moet worden gebruikt als de passieve referentie.
    3. Voer een reactievolume van 20 μL in en de volgende PCR-cyclische omstandigheden in de real-time PCR-software volgens de instructies: preincubatie bij 15 ° C gedurende 15 minuten en dan 40 cycli van denaturatie bij 94 ° C gedurende 15 s , Annealing bij 55 ° C gedurende 30 s, en verlenging bij 70 ° C gedurende 30 s.
  7. Analyseer qRT-PCR data uZing de software van het real-time PCR instrument. Bevestig dat de drempel en basislijn die automatisch door software worden bepaald, in elke put geschikt zijn.
  8. Controleer de drempelcyclus van doel-miRNA's in elk monster. De drempelcyclus is het snijpunt tussen een versterkingskromme en een drempellijn. Normaliseer dan het expressieniveau van de target miRNAs tegen RNU6-2 als een endogene controle en berekén het relatieve expressieniveau van de target miRNAs met behulp van de 2 -ΔΔCT methode 13 .
    OPMERKING: Opgemerkt moet worden dat de stabiliteit van het expressieniveau van de endogene controle miRNA moet worden gecontroleerd. In dit experiment werd RNU6-2 bevestigd om op hoog niveau en relatief invariant uit te drukken over elke groep.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier weergegeven resultaten zijn gebaseerd op onze eerder gerapporteerde studie 8 . We hebben het miRNA expressieprofiel in peritoneale fibrose onderzocht. Peritoneale fibrose is een belangrijke complicatie bij peritoneale dialyse. Het wordt gekenmerkt door verlies van de mesotheliale cel monolaag en de overmaat accumulatie van extracellulaire matrix componenten, en is geassocieerd met peritoneale membraan falen 14 ,

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van het protocol dat in dit manuscript wordt gepresenteerd, werden miRNAs in het peritoneale membraan van de ratten succesvol gezuiverd en gedetecteerd met behulp van qRT-PCR. De betrouwbaarheid van qRT-PCR data analyse hangt af van de kwaliteit van gezuiverde miRNAs. Daarom kan de zuiverheid van miRNA's worden gecontroleerd vóór qRT-PCR door de verhouding van absorptie bij 260 nm tot die bij 280 nm, die kan worden gemeten met behulp van een spectrofotometer. Wanneer significante amplificatie van miRNA ni...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Miyako Shigeta voor haar uitstekende technische ondersteuning. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door JSPS KAKENHI (subsidie ​​nummer 25461252).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
QIA shredderQiagen79654biopolymer-vernielingssysteem in een microcentrifuge-spinkolom
miRNeasy Mini kitQiagen217004op silica-membraan gebaseerde spinkolom
QIAzol Lysis ReagensQiagen79306fenol/guanidine-gebaseerd lysereagens
Buffer RLTQiagen79216wasbuffer 1
Buffer RWTQiagen1067933wasbuffer 2
miScript II RT kit Qiagen218161bevat 10× Nucleics Mix met deoxynucleotiden, ribonucleotidetrifosfaten en oligo-dT-primers; miScript Reverse Transcriptase Mix met poly(A)-polymerase en reverse transcriptase en; miScript HiSpec-buffer
miScript SYBR Green PCR kitQiagen218073bevat QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix en miScript Universal Primer
RNU6-2 primer  QiagenMS00033740niet bekend
miRNA-142-3p primerQiagenMS000314515'-UGUAGUGUUUCC
UACUUUAUGGA-3'  
miRNA-21-5p primerQiagenMS000090795'-UAGCUUAUCAG
ACUGAUGUUGA-3'
miRNA-221-3p primerQiagenMS000038575'-AGCUACAUUGU
CUGCUGGGUUUC-3'
miRNA-223-3p primerQiagenMS000333205'-UGUCAGUUUG
UCAAAUACCCC-3'
miRNA-34a-5p primerQiagenMS000033185'-UGGCAGUGUCU
UAGCUGGUUGU-3'
miRNA-327 primerQiagenMS000008055'-CCUUGAGGGG
CAUGAGGGU-3'
MicroAmp Optical 96 well reactieplaat voor qRT-PCRThermo Fisher Scientific431681396-well reactieplaat
MicroAmp Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific4311971kleeffilm voor 96-well reactieplaat
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR systeemThermo Fisher Scientific4472380real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software versie 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380real-time PCR instrument software
methylglyoxalSigma-AldrichM0252
MidpericTerumonot assign peritoneal dialysevloeistof
Sprague–Dawley rattenSLCnot assign 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
  2. Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
  3. Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
  4. Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
  5. Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
  6. Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
  7. Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
  8. Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
  9. Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005(2014).
  10. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  11. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  12. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  13. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  14. Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, Suppl 4. S22-S42 (2000).
  15. Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. The pathophysiology of the peritoneal membrane. J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).
  16. Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
  17. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate? BMC Genomics. 6, 59(2005).
  18. Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary? Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

MicroRNA ExpressionQuantitative Real time PCRPeritoneal MembraneRNA PurificationReverse TranscriptionmiRNA DetectionPeritoneal FibrosisRat ModelTotal RNA IsolationqRT PCR Protocol

Gerelateerde artikelen