Detectie van ligand-geactiveerde G-proteïne gekoppelde receptor internalisatie door confocale microscopie

Samenvatting

Dit protocol beschrijft confocale microscopie detectie van G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) internalisatie in zoogdiercellen. Het omvat de basis-celkweek, transfectie, en confocale microscopie procedure en zorgt voor een efficiënte en gemakkelijk te interpreteren methode om de subcellulaire lokalisatie en de internalisering van-fusion uitgedrukt GPCR detecteren.

Samenvatting

Confocale laserscanningmicroscopie (CLSM) is een optische beeldvormingstechniek voor beeldvorming met hoog contrast. Het is een krachtige benadering om fluorescente fusie-eiwitten, zoals groen fluorescent eiwit (GFP), te visualiseren om hun expressie, lokalisatie en functie te bepalen. De subcellulaire lokalisatie van doeleiwitten is belangrijk voor identificatie, karakterisering en functionele analyses. Internalisatie is een van de overheersende mechanismen die G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR)-signalering regelen om de juiste cellulaire reacties op stimuli te garanderen. Hier beschrijven we een experimentele methode om de subcellulaire lokalisatie en internalisatie van GPCR in HEK293-cellen met confocale microscopie te detecteren. Bovendien biedt dit experiment enkele details over celcultuur en transfectie. Dit protocol is compatibel met een verscheidenheid aan algemeen beschikbare fluorescente markers en is toepasbaar voor de visualisatie van de subcellulaire lokalisatie van een meerderheid van eiwitten, evenals van de internalisatie van GPCR. Deze techniek zou onderzoekers in staat moeten stellen de GPCR-genexpressie in zoogdiercellijnen efficiënt te manipuleren en studies over subcellulaire lokalisatie en internalisatie van GPCR moeten vergemakkelijken.

Inleiding

Cellen bezitten lading handel machines te transporteren materialen extracellulaire-liganden zoals, micro-organismen, nutriënten en transmembraaneiwitten-in de cel informatie, energie en andere doelen ^{1, 2.} Het is van cruciaal belang voor de cellulaire homeostase, de functie weefsel, en de algehele overleving cel. De cellen gebaseerde expressie van fluorescente fusieproteïnen is een krachtige manier om de lokalisatie en de internalisering van transmembraan receptoren zoals G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR), studeren signaalroutes ^3.

De expressie van fusie-eiwitten gelabeld met groen fluorescent eiwit (GFP) vanaf kwal Aequorea Victoria, gecombineerd met directe fluorescentie detectie technieken is algemeen geaccepteerd in proteïnerichtsignaalsequentie onderzoek ^{4, 5, 6.} -GFP gebaseerde detectiOp heeft het voordeel dat de real-time beeldvorming van levende cellen met vermijding fixatie artefacten ^7. Een reeks veelzijdige kloneringsvectoren is geconstrueerd om de expressie van eiwit fusies met GFP in verschillende cellen ⁸ te ^{vergemakkelijken, 9.} De pEGFP-N1 vector is een veel gebruikte en in de handel plasmidevector die codeert voor een versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP), die is geoptimaliseerd van wildtype GFP voor helderdere fluorescentie en hogere expressie in zoogdiercellen. Waarnemen het fluorescentiesignaal van EGFP expressie in zoogdiercellen dient de fluorescentiemicroscopie verricht met excitatie bij 488 nm en emissie bij 507 nm, bij voorkeur met confocale microscopie.

Bewaken van de subcellulaire lokalisatie en ligand-gemedieerde internalisatie van receptoren is een gebruikelijke techniek om de signaaltransductie en functie van GPCRs ¹⁰ onderzoeken up>, ^11. In de meeste gevallen leidt tot internalisatie desensitisatie van de GPCR (de verzwakking van de stimulusresponsie ondanks de aanwezigheid van agonisten) ^{12, 13.} De geïnternaliseerde receptoren kunnen in het lysosoom worden opgenomen en afgebroken, of ze kunnen naar het celoppervlak worden gerecycleerd, afhankelijk van de aard van de receptoren en de cellijnen gebruikt in de experimenten.

Het gonadotropine afgevende hormoon receptoren (GnRHRs) behoren tot de GPCR-familie en een typische GPCR eiwitstructuur, met een extracellulair aminoterminaal, een intracellulaire -COOH terminal, zeven transmembraan (TM) domeinen ^14. De transfectie van de recombinante plasmide Sj GnRHR-EGFP (met GnRHR gen uit Sepiella japonica) en confocale microscopie detectie van EGFP gelabeld Sj GnRHR (tot expressie gebracht in HEK293-cellen) gemeld Previously en GFP fluorescentie werd vastgesteld als een reporter voor transmembraan eiwit lokalisatie ¹⁵ assays. Nu, de internalisatie van Sj GnRHR, geactiveerd door S. japonica gonadotropine afgevende hormoon (GnRH Sj), werd aangetoond in tijd- en dosisafhankelijke manieren met confocale microscopie.

Protocol

1. Celbereiding

1. Cell herstel
   1. Breng de gecryopreserveerde menselijke embryonische nier 293 (HEK293) cellen van een vloeibare stikstof tank naar een 37 ° C waterbad en schud continu gedurende 1-2 min.
   2. Voeg 10 ml geëquilibreerd kweekmedium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine-oplossing) tot 10 cm celkweekschaal. Voorzichtig de ontdooide cellen toe te voegen aan de geëquilibreerde groeimedium.
   3. Incubeer de cellen in een 37 ° C watermantel _CO2 incubator met een vochtige atmosfeer die 95% lucht en 5% _CO2 gedurende 2-4 uur.
   4. Na 2-4 h, controleer dat de cellen gevoegd. Vervang de geëquilibreerde groeimedium en cultuur voor een ander 24-48 uur.
      LET OP: Het veranderen van de geëquilibreerde groeimedium is nuttig omdat het verwijdert dimethylsulfoxide (DMSO) en beschermt tegen celbeschadiging.
2. Cell passage
   1. Na 24-48 uur, wanneer de cellen zijn gegroeid tot bijna confluentie, gooi de geëquilibreerde groeimedium en was de cellen met 2 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Zwenk de schaal voorzichtig.
   2. Gooi de PBS en voeg 1 ml trypsine-EDTA (saline, 0,25% trypsine en 0,02% EDTA). Om de cellen volledig te verteren, wervelen de schotel voorzichtig en zuig van de trypsine-EDTA-oplossing. Zet de schaal in de 37 ° C watermantel _CO2 incubator gedurende 3 min.
      LET OP: Tijdens deze periode, voor te bereiden drie nieuwe 10-cm celkweekschaaltjes en voeg 10 ml in evenwicht gebracht groeimedium aan elk.
   3. Met behulp van een lichtmicroscoop, bepalen of de cellen van de bodem van de schaal zijn opgeheven. Voeg 2 ml in evenwicht gebracht groeimedium aan het gerecht. Meng door pipetteren en direct pipet 0,6 ml van de celsuspensie aan elk van de nieuwe gerechten. Meng door pipetteren en de cellen te laten incuberen bij 37 ° C en 5% _CO2.

2. Cel zaaien

1. Na 24-48 uur, wanneer de passage onderworpen cellen gekweekt tot bijna confluentie, gooi de geëquilibreerde groeimedium en was de cellen met 2 ml PBS. Zwenk de schaal voorzichtig.
2. Gooi de PBS en voeg 1 ml trypsine-EDTA. Om de cellen volledig te verteren, wervelen de schotel voorzichtig en zuig van de trypsine-EDTA. Zet de schaal in de 37 ° C watermantel _CO2 incubator gedurende 3 min.
   Opmerking: In deze periode stelt een 6-wells plaat door toevoeging van 2 ml geëquilibreerd kweekmedium aan elke well.
3. Voeg 1 ml geëquilibreerd groeimedium om de schotel, indien onder microscopische waarneming, de cellen hebben de schaalbodem opgeheven. Meng door pipetteren en direct pipet 0,1 ml celsuspensie (het volume is aangepast aan de groei celdichtheid) aan elk putje van de bereide 6-well plaat (cell-less 6-wells plaat met 2 ml geëquilibreerd kweekmedium). Meng door pipetteren en laten de cellenincuberen bij 37 ° C en 5% _CO2.

3. Cel Transfectie

1. Transfectiemethode 1, met liposoomformuleringen
   OPMERKING: Zie de tabel van materialen voor transfectiereagens 1.
   1. De volgende dag, ervoor te zorgen dat de cellen 85 zou moeten zijn - 95% confluent.
   2. Voeg 3 ug plasmide DNA (500 ng / ul) en 100 ui gereduceerd serum medium in een steriele microcentrifugebuis en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   3. Bereid 9 pl reagens 1 en 100 pl verminderde serum media in een microcentrifugebuis en meng voorzichtig. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Combineer het verdunde plasmide mengsel verdund Reagens 1 (totaal volume = 215 ul). Meng voorzichtig en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
   5. Aspireren medium uit cellen gekweekt plaat en voeg 1,5 ml vers DMEM zonder FBS.
   6. Voeg 215 ul van DNA-transfectie reagensmengsel aan elk putje druppelsgewijs en meng voorzichtig door zwenken de plaat.
   7. Incubeer bij 37 ° C en 5% _CO2 gedurende 4-8 uur. Vervang met verse DMEM met 10% FBS.
   8. Incubeer cellen bij 37 ° C en 5% _CO2 gedurende nog 24-48 uur voordat u enige experimenten.
2. Transfectiemethode 2, met liposoomformuleringen
   OPMERKING: Zie de tabel van materialen voor transfectiereagens 2.
   1. Voeg 2 ug plasmide DNA (500 ng / pl), 4 pi van Reagens 2, en 100 ul gereduceerd serum medium in een steriele microcentrifugebuis. Meng voorzichtig en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   2. Voeg het transfectiemengsel aan de cellen op druppelsgewijze wijze.
   3. Na transfectie incubeer cellen voor 24-48 uur bij 37 ° C en 5% _CO2, voordat u enige experimenten.

4. Cell Culture on Cover Slips

1. Opnieuwbeweegt het groeimedium uit de kweek 6-wells plaat.
2. Was de celmonolaag met 1 ml PBS zonder calcium en magnesium.
3. Voeg 0,5 ml trypsine-EDTA. Swirl de schotel voorzichtig en zuig off trypsine-EDTA. Incubeer de kweekplaat gedurende 3 min bij 37 ° C en 5% _CO2. De werkelijke incubatietijd afhankelijk van de gebruikte cellijn.
   Opmerking: In deze periode stelt een nieuwe 12-wells plaat en voeg 15 mm diameter steriele dekglaasjes aan elk putje. Dekglaasjes bedekt met lysine, laminine of collageen kan celhechting te HEK293 cellen die gemakkelijk los te verbeteren.
4. Wanneer de cellen losgemaakt, voeg 1 ml voorverwarmd compleet kweekmedium aan elke well. Meng door pipetteren en geeft de vereiste aantal cellen dragen aan de 12-well plaat met dekglaasjes. Voeg vers compleet kweekmedium aan elke put om het totale volume op 1 ml te passen
5. Incubeer de cellen gedurende 16-24 uur bij 37 ° C en 5% _CO2.
   NB: Na 30 -60 min, zal de meerderheid van de cellen gehecht zijn aan de steriele dekglaasjes.

5. confocale microscopie Detection

1. cellulaire lokalisatie
   1. Na 16-24 uur, wanneer de cellen op steriele dekglaasjes in de 12-well plaat tot bijna confluentie gegroeid, voeg het membraan probe, Dil, aan elk putje, hetgeen een uiteindelijke concentratie van 5 uM. Laat de cellen te incuberen gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% _CO2.
   2. Na 30 minuten, verwijder het geëquilibreerd kweekmedium en was de cellen tweemaal in koude PBS (2-8 ° C).
   3. Fixeer de cellen door toevoeging van 1 ml van een 4% paraformaldehyde oplossing (in PBS) aan elk putje. Schud gedurende 15 minuten.
      Voorzichtig: paraformaldehyde matig toxisch bij contact met de huid of inhalatie, en aangeduid als mogelijk carcinogeen. Chemische afzuigkappen, geventileerde kasten balans of andere beschermende maatregelen tijdens het wegen en behandeling van paraformaldehyde worden toegepast.
   4. Was de gefixeerde cellen tweemaal in PBS. Voeg 200-300 ui DAPI (4' , 6-diamino-2-fenylindool) (0,5 ug / ml) aan elk putje en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Was de cellen tweemaal met PBS. Verwijder voorzichtig de dekglaasjes van de plaat en lont overtollige PBS. Inverteer op microscoopglaasjes geplaatst met een druppel montage medium (50% v / v glycerol / water). Verwijder overtollige montage medium van de dia's.
2. Cellular internalisatie
   1. Na 16-24 uur, wanneer de cellen op steriele dekglaasjes in de 12-well plaat tot bijna confluentie gegroeid, verwijder de geëquilibreerde kweekmedium vervangen door vers, warm DMEM-medium (37 ° C). Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C en 5% _CO2.
   2. Behandel de cellen met verschillende concentraties (0, 10 ^{-12, -9} 10 en 10 ^-6 M) van ligand gedurende 30 minuten en te behandelen met 10 ^-6 M ligand voor verschillende tijdstippen (0,10, 30 en 60 min).
   3. Was de cellen tweemaal met koud PBS (2-8 ° C). Fixeer de cellen door toevoeging van 1 ml van een 4% paraformaldehyde oplossing (in PBS) aan elk putje. Schud gedurende 15 minuten.
   4. Was de cellen tweemaal in PBS. Verwijder voorzichtig de dekglaasjes van de plaat en de pit van de overmaat PBS. Inverteer op microscoopglaasjes geplaatst met een druppel montage medium (50% v / v glycerol / water). Verwijder overtollige montage medium van de dia's.
3. Confocale microscopie
   1. Zet de hardware van de confocale microscoop, met inbegrip van de kwiklamp macht, PC microscoop, scanner en laser. Meld u aan besturingssysteemaccount, start u de software, controleert u de configuratie en selecteer laser. Zet de verschillende eenheden van confocale microscopie systeem in de volgorde volgens de instructies.
   2. Plaats de voorbereide dia's op de microscoop podium. Plaats het monster via objectieflens via de platformbesturing. Voeg een druppel van cederhout olie opmet dekglaasje als de olie immersielens is geselecteerd. Plaats het deksel slips op dia's met uitzicht op de lens.
   3. Vind de cellen van belang in het kader van de fluorescentie microscopie.
   4. Schakelen naar de scanmodus. Kies het laservermogen en het spectrale gebied van de emissie fluorofoor. Leg de hoge kwaliteit confocale beelden door tuning intensiteit van de laser en andere parameters.

Resultaten

Figuur 1 toont een voorbeeld van een confocale microscoop systeem. Figuur 2 toont de expressie van pEGFP-N1 in HEK293 cellen. Het GFP-signaal werd gedetecteerd in het cytoplasma en de kern. Figuur 3 toont de subcellulaire lokalisatie van GnRHR van S. japonica in HEK293-cellen, consistent met onze eerder gepubliceerde resultaten ^15. De fusie-eiwit met de EGFP tag aan het C-uiteinde van Sj GnRHR

Discussie

De hier gepresenteerde protocol verschaft een efficiënte en eenvoudig te interpreteren methode om de subcellulaire lokalisatie en internalisatie van tot expressie gebracht GPCR fusie-eiwit in HEK293-cellen te detecteren. De techniek kan eenvoudig worden aangepast voor verschillende genen en celtypes, zoals de cellulaire lokalisatie en internalisatie van de receptor corazonin van Bombyx mori in HEK293 cellen ¹⁶ en BMN.

De succesvolle toepassing van deze kracht...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
HEK293 cellijn
DMEM/Hoge glucose	Hyclone	SH30022.01	Hoge glucose 4,0 mM L-glutamine
Fetaal runderserum (FBS)	PuFei	1101-100
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)	Genom	GNM10010
Penicilline-Streptomycine	Genom	GNM15140
0,25% Trypsine & 0,02% EDTA	Genom	GNM25200
Opti-MEM (1x)	GIBCO, by Life Technologies	31985-062	medium met verminderd serum
Lipofectamine 2000 Transfectiereagens	Invitrogen	11668027	Reagens 1
X-tremeGENE HP DNA Transfectiereagens	Roche	6366236001	Reagens 2
DAPI-kleuringsoplossing	Beyotime	C1006
DiI	Beyotime	C1036
Antifade montagemedium	Beyotime	P0126
Paraformaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC)	80096618
100 mm celcultuur	CORNING	430167
6-well plaat	ExCell Bio	CS016-0092
12-well plaat	ExCell Bio	CS016-0093
Dekglas	NEST	801007
Microscoopglaasjes	Citoglas	10127105P-G
Thermo Scientific Forma CO2 Incubator	Thermo	3111
TCS SP5II laser scanning confocal microscope	Leica	5100001311