Een eenvoudige methode om Kinases te identificeren die de embryonale stamcelpluripotency reguleren door middel van high-throughput inhibitor screening

Samenvatting

Hier presenteren we een kwantitatief en schaalbaar protocol voor het uitvoeren van gerichte kleine molecuulschermen voor kinase-regulatoren van de naïeve-primed pluripotente transitie.

Samenvatting

Embryonale stamcellen (ESC's) kunnen zelf vernieuwen of differentiëren in alle celsoorten, een fenomeen dat bekend staat als pluripotentie. Bepaalde pluripotente staten zijn beschreven, genaamd "naïeve" en "primed" pluripotency. De mechanismen die de naïeve-gepresteerde overgang beheersen zijn slecht begrepen. In het bijzonder blijven we slecht geïnformeerd over proteïne kinasen die naïeve en priide pluripotente staten specificeren, ondanks de toenemende beschikbaarheid van hoogwaardige gereedschapverbindingen om de kinasefunctie te onderzoeken. Hier beschrijven we een schaalbaar platform om gerichte kleine molecuulschermen uit te voeren voor kinase-regulatoren van de naïeve-primed pluripotente transitie in muis-ESC's. Deze aanpak maakt gebruik van eenvoudige celcultuuromstandigheden en standaard reagentia, materialen en apparatuur om kinaseremmers te ontdekken en te valideren met tot nu toe niet-gemarkeerde effecten op pluripotentie. We bespreken potentiële applicaties voor deze technologie, waaronder het screenen van ander klein molecuulCollecties zoals steeds meer geavanceerde kinaseremmers en opkomende bibliotheken van epigenetische hulpmiddelenverbindingen.

Inleiding

Embryonale stamcellen (ESC's) hebben de capaciteit om zichzelf te vernieuwen of te onderscheiden in elk celtype in het volwassen lichaam, een fenomeen dat bekend staat als pluripotentie ¹ . Recent bewijzen wijzen erop dat ontwikkelingsspecifieke pluripotente staten bestaan, genaamd "naïeve" en "primed" pluripotency ² . Naïeve ESC's vertegenwoordigen een ontwikkelingsstaat die vergelijkbaar is met die in het preimplantatieembryo ³ . In tegenstelling hiermee zijn geperforeerde pluripotente ESC's klaar om pluripoten te verlaten en te onderscheiden in gespecialiseerde embryonale afstammingen ^{4 , 5} .

Naïve en priide pluripotente staten worden gekenmerkt door verschillende genregulerende netwerken. Naïve pluripotency wordt gekenmerkt door expressie van belangrijke pluripotentie transcriptiefactoren zoals Nanog, Krueppel-achtige transcriptiefactoren (Klfs), Rex1 ² en Esrrb 6. In muis-ESC's (mESC's) wordt geperfieerde pluripotency gekenmerkt door verminderde expressie van naïeve markers en een specifieke genuitdrukkingshandtekening die de de novo DNA-methyltransferase Dnmt3b ^{7 omvat} . In vivo expressieert de geperforeerde pluripotente postimplantatie-epiblast stamcellen (EpiSCs) ^{4 , 5} ook de Epiblast-marker Fgf5 en markers van lineage priming zoals Brachyury ⁸ .

MESC's verschaffen een tracteerbaar model om mechanismen te onderzoeken die naïef-primitieve pluripotente overgangen in vitro beheersen. Bij cultuur in leukemie-remmende factor (LIF) en foetaal runder serum (FBS) ondergaan mESCs een dynamische overgang tussen naïeve en priide pluripotente staten ^{9 , 10} . LIF-Jak-Stat3 signaleringsfuncties om een ​​naïef genregulerend netwerk te bevorderen ¹¹ , terwijl autocrine signalering via de fibroblastgroeifactor 4 (Fgf4) Erk1 / 2-weg de overgang naar de geperforeerde toestand ¹² overbrengt. Het blijft echter een uitdaging om de rol van proteïnekinasen systematisch te evalueren bij het specificeren van verschillende pluripotente staten.

Hier beschrijven we een kwantitatief en schaalbaar platform waarmee doelgerichte kleine molecuulschermen kunnen worden uitgevoerd voor kinase-regelaars van de naïeve-primed pluripotente overgang. We gebruiken eenvoudige mESC-cultuuromstandigheden en standaard reagentia, materialen en apparatuur om kinase-remmers te ontdekken en te valideren met tot nu toe onverminderd vermogen om naïeve pluripoten te stabiliseren. Daarnaast bespreken we mogelijke uitgebreide applicaties voor deze technologie, inclusief voor het screenen van andere kleine molecuulcollecties zoals opkomende inhibitorbibliotheken die epigenetische regulatoren richten.

Protocol

1. Collatie van Kinase-inhibitorbibliotheken met kleine molecuul

1. Combineer remmerbibliotheken uit publiek toegankelijke kinaseremmerscollecties, bijv. Library of Integrated Network-Based Cellular Signatures (LINCS) van Harvard Medical School, een gerichte verzameling van 228 krachtige en selectieve kinaseremmers (http://lincs.hms.harvard.edu) , En de Protein Kinase Inhibitor Set (PKIS), een collectie van 376 samengesteld door industriële onderzoekers (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) ¹³ . Alternatief, assembleer een op maat gemaakte kinaseremmer collectie uit commercieel verkrijgbare verbindingen.
   OPMERKING: In ons laboratorium hebben we een verzameling van 72 krachtige en selectieve gereedschapskinaseremmers samengesteld die 51 primaire doelkinasen omvatten, die allemaal uit commerciële bronnen verkrijgbaar zijn.
2. Kinase-remmers monteren in platen met 96 putjes voor optimale verwerking met hoge doorvoer bij meerdere concentraties (gebruik 1, 0,1 aNd 0,01 mM). Inclusief in elke plaat controlebronnen die alleen DMSO bevatten en referentie controle inhibitors PD173074 (FGFRi) en Ruxolitinib (JAKi), die bekend zijn om respectievelijk naïeve en priide pluripotente staten te bevorderen. Annoteren in een spreadsheet of soortgelijke software.

2. MESC Cultuur Voorwaarden en Procedures voor Scherm Voorbereiding

1. Bereid 0,1% gelatine gecoate 10 cm schotels door 5 ml 0,1% (w / v) gelatine aan 10 cm platen toe te voegen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Aspirateer de gelatine en laat de plaat gedurende 2 minuten drogen.
2. Cultuur elke standaard mESC lijn bij 37 ° C 5% CO ₂ op 0,1% gelatine beklede 10 cm gerechten in standaard mESC media (zie Material Table ) die 100 ng / ml GST-LIF, 10% Fetaal Kalf Serum en 5% Knockout Serum bevat Vervanging. Vervang media elke dag en plaats de mESC's bij ongeveer 80% confluency elke tweede dag bij een verdunning van 1: 5-1: 10.
3. Om mESC's door te geven, aspireren media en was met 5 ml oF fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) per plaat.
4. Voeg 1 ml trypsine-EDTA (0,05% trypsine, 0,02% EDTA) per plaat mESC's toe en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
5. Resuspendeerde trypsineerde cellen in 4 ml mESC media en centrifuge bij 1200 rpm gedurende 5 min.
6. Cellulaire pellets opnieuw resuspeneren in 5 ml mESC media, pipetteren omhoog en omlaag om een ​​enkele cel suspensie te genereren.
7. Tel cellen met een 10 μL cel suspensie en 10 μl Trypan Blue (0,4%). Plaats in een cel telkamer of gebruik een hemocytometer en lichtmicroscoop.
8. Zaad 3 x 10 ³ mESCs in 0,1% gelatine gecoate 96 putjes platen, eindvolume 100 ul media, met behulp van een multikanaalspipet.
9. Kinase remmers toepassen bij 1: 100 verdunning (1 μL remmer toegevoegd aan 100 μL media) met behulp van een multi-channel pipet. Zachtjes pipette media om remmer en cel suspensie te mengen, laat dan toe dat cellen gedurende 1 uur in een weefselkweekhoofd komen om gelijkwaardige verdeling acro te waarborgenZoals het plating oppervlak. Cultuurcellen gedurende 48 uur zonder de media te veranderen.
   OPMERKING: Voorraadplaten van 1 / 0,1 / 0,01 mM geven respectievelijk een eindconcentratie van 10/1 / 0,1 μM. We raden aan om het scherm te starten bij een eindconcentratie van 1 μM om effectieve remming van primaire doelkinasen te waarborgen, terwijl de off-target effecten worden beperkt.

3. Kinase Inhibitor Screening Analysis

1. Was 96 ml MESC platen in 200 μL PBS met behulp van meerdere kanalen aspirator en pipetten.
2. Maak celextracten in 150 μl lysisbuffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40 (v / v), 0,5% natriumdeoxycholaat (w / v), 10 mM ß-glycerofosfaat , 10 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM NaF, 2 mM Na3VO4, Cocktail Tabletten van volledige Protease Inhibitor).
3. Verhelder extracten door centrifugeren bij 1.500 xg gedurende 30 minuten in V-bodemplaten met 96 putjes.
4. Immobiliseer 100 μl supernatanten op een nitrocelLulose membraan met behulp van een 96-putjes vacuum dot blot manifold.
5. Droog het membraan en vlek met 40 ml Ponceau S om de consistente overdracht te waarborgen.
6. Was membraan met TBST en blokkeer in TBST / 3% (w / v) melk.
7. Incubeer in Nanog en Dnmt3b antilichamen bij een verdunning van 1: 1000 (v / v) in TBST / 3% (w / v) melkpoeder overnacht.
8. Was membranen in 3 x 10 minuten in TBST en incubeer in 30 ml secundaire antilichamen bij een verdunning van 1: 10.000 (v / v) in TBST / 3% (w / v) melk.
9. Ontwikkel met behulp van een digitaal immunoblottend beeldvormingssysteem.
   OPMERKING: Gebruik indien mogelijk kwantitatieve fluorescentie immunoblotting om Nanog en Dnmt3b te detecteren. Het achterliggende signaal voor Dnmt3b door fluorescentie immunoblotting is echter te hoog. Daarom worden secundaire antilichamen van 800 nm fluorescentie anti-konijn (Nanog) en anti-muis-HRP (Dnmt3b) gebruikt.

4. Analyse van schermdata en validatie van inhibitors als Bona Fide Pluripotency Regulators

OPMERKING: Dit is een kritische stap om ervoor te zorgen dat alleen bona fide pluripotencymodulatoren worden geïdentificeerd. Het is essentieel om triageren op basis van zowel de nanog: dnmt3b verhouding als het algemene signaal te verzekeren, om ervoor te zorgen dat kinase remmers die het mESC-overleving nadelig beïnvloeden, niet worden geselecteerd voor verdere analyse.

1. Kwantificeer Nanog en Dnmt3b signaal met behulp van immunoblotting analyse software, en importeer waarden in een spreadsheet of soortgelijke software. Bereken Nanog: Dnmt3b verhouding voor alle monsters in vergelijking met DMSO controle. Bepaal ook het totale Nanog en Dnmt3b signaal om ervoor te zorgen dat kinaseremmers de nier- en dnmt3b-verhouding niet beïnvloeden door de mESC-levensvatbaarheid te veranderen.
2. Gebruik gerangschikt Nanog: Dnmt3b verhoudingen om remmers te identificeren die naïeve pluripotency (Nanog: Dnmt3b ratio hoger dan controle) en geperforeerde pluripotency (Nanog: Dnmt3b ratio lager dan controle) identificeren. Zet afsnijding bij 2x afwijking van de controlewaarden en filter kinaseremmers uit die een totaal Nanog + Dnmt3b signaal van minder dan dat produceren50% van de DMSO controle waarde om een ​​hoge vertrouwen lijst van kinase remmers te genereren die naïeve stabiliteit (hoge nanog: Dnmt3b ratio) en geperste pluripotentestanden (lage Nanog: Dnmt3b ratio) stabiliseren.
3. Valideer kinase remmers door mESCs te zaaien bij 2 x 10 ⁵ cellen per 6 putjes in 2 ml media, en voeg kinase remmers bij 1 μM gedurende 48 uur toe zonder media te veranderen.
4. Lyse mESC's in lysisbuffer en analyseren Nanog en Dnmt3b expressie door conventionele SDS-PAGE immunoblotting.
5. Verdere valideren van hits door SDS-PAGE immunoblotting voor naïeve pluripotentie markers Klf2 en Klf4 en Oct4 om ervoor te zorgen dat pluripoten wordt gehandhaafd na 48 uur inhibitor behandeling.

Resultaten

Met behulp van de hier geplaatste procedure ( Figuur 1 ), screenen we de LINCS-bibliotheek van 228 krachtige en selectieve kinase-remmers om degenen te identificeren die mESC pluripotency moduleren. De bibliotheek wordt bereid in een concentratie van 0,1 mM voor een verdunning van 1: 100 en eindscreening van 1 uM in mESC's. 48 uur later werden mESC's gelyserd en extracten bereid voor kwantitatieve dot blot analyse van Nanog en Dnmt3b expressie ( Figuur 2 , boven). Resultaten van andere screeningsconcentraties worden hier niet voor kortheid weergegeven. Nanog: Dnmt3b verhouding wordt bepaald voor elke kinaseremmer en verbindingen gerangschikt en een 2x cut-off is toegepast ( Figuur 2 , bodem). Totaal Nanog- en Dnmt3b-signaal ten opzichte van de controle wordt overgebracht op de ranglijst van de inhibitor en onderworpen aan een 0,5x cut-off, om trimmering van remmers mogelijk te maken die significante mESC toxiciteit vertonen. Selecteer kinaseremmers die de naïeve sta stabiliserenTe worden gevalideerd met behulp van conventionele Nanog / Dnmt3b immunoblotting ( Figuur 3 ). De primaire kinase doelen van deze remmers worden weergegeven in tabel 1 . We tonen ook de toepasbaarheid van dit scherm aan om remmers te identificeren die de primed toestand ¹⁴ stabiliseren.

Figuur 1: Workflow voor het screenen van kinase remmers die naïeve-primed transitie moduleren. MESC werden behandeld met een 228 samengestelde kinase-inhibitor bibliotheek bij een uiteindelijke concentratie van 1 uM. Lysaten werden bereid en overgebracht op nitrocellulosemembranen voor immuno dot-blot analyse, en nanog en Dnmt3b niveaus bepaald (Figuur aangepast van Williams et al. ¹⁴ ). Klik hier om al te zien Arger versie van deze figuur.

Figuur 2: Naïeve-primed pluripotencyscreen analyse en inhibitor identificatie. (Top) Representatieve Nanog en Dnmt3b immunotip-blot beelden. (Bottom) Nanog- en Dnmt3b-waarden voor elke kinaseremmer werden bepaald ten opzichte van de DMSO-controle en de nanog: Dnmt3b-verhoudingen en het totale relatieve Nanog + Dnmt3b-signaal werden bepaald en de remmers werden gerangschikt in vergelijking met DMSO-controle. Inhibitors gevonden om de nanog: Dnmt3b verhouding te veranderen na een tweevoudige drempel boven of onder DMSO controle werden geïdentificeerd als bestuurders van naïeve of priide pluripotency. Een drempel van 2x onder DMSO-controle werd ingesteld op triage-remmers die het mESC-overleving in gevaar brengen. Inhibitors geselecteerd voor verdere validatie worden gemarkeerd. (Figuur aangepast van Williams et al., ¹⁴ ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Validatie van geselecteerde trefverbindingen geïdentificeerd. MESC's werden behandeld met ofwel 1 μM AZD4547 (een selectieve FGFR-remmer) of de aangegeven remmers geïdentificeerd uit het scherm in Figuur 2. Nanog: Dnmt3b niveaus bepaald door standaard SDS-PAGE en immunoblot analyse. Numerieke waarden van relatieve Nanog: Dnmt3b en Nanog + Dnmt3b zijn aangegeven in de onderstaande tabel, en remmers die de naïeve pluripotente toestand stabiliseren die in groen worden gemarkeerd. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

samenstelling	Primaire doelstellingen		Andere doelstellingen
AV-951	VEGFR
HG-6-64-01	ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K
WH-4-023	Lek		src
R406	Syk
GW-572016	HER2		EGFR
KIN001-244	PDK1
WZ-4-145	CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2
WZ-7043	CSF1R, DDR1, FGFR en TAO1
GW786034	VEGFR1		VEGFR2, VEGFR3 &# 160;
AZD-1480	JAK2

Tabel 1: Geselecteerde hitverbindingen en hun primaire kinase target (s).

Discussie

Hier tonen we een wijd toegankelijke methodologie om de rol van kinase signaalwegen te onderzoeken bij het reguleren van naïeve-primed pluripotente transitie. Dit behandelt een sleutelvraag in het ESC-veld. Hoewel de doorstromingsgenetica en transcriptomics benaderingen routinematig worden gebruikt om belangrijke transcriptie-regulatoren van naïeve en primitieve pluripotente staten te identificeren, blijkt uit te leggen dat pluripotentie-signaleringsnetwerken uitdagend zijn. We bieden nu een flexibele strategie aan die chemische remmers gebruikt om kinases te identificeren die de naïeve-primed pluripotente overgang in mESC's beheersen. Dit is gebaseerd op eenvoudige apparatuur, reagentia en materialen die beschikbaar zijn voor de meeste laboratoria die celsignalen en ESC-biologie bestuderen. Kritisch voor het succes van dit platform is onze ontwikkeling van een robuuste analyse om de overgang tussen naïeve en priide pluripotente staten te kwantificeren. Het vaststellen van deze analyse vereist significante iteratieve wijzigingen van celplatformIngedichtheid, tijd van inhibitor incubatie en immunoblottende condities.

Kleine molecuulbenaderingen krijgen tractie voor rationeel gebruik in therapeutische ESC applicaties ^{15 , 16} . Een belangrijke kracht van screening met kleine moleculen is dat hulpmiddelenverbindingen zijn ontworpen en / of aangepast voor efficiënte cellulaire opname. Transfectie-efficiëntie is niet beperkend en het gebruik van gevaarlijke afleveringssystemen, zoals lentivirus, is niet nodig. Bovendien remmen remmers vaak meerdere isoformen in een kinasefamilie (bijvoorbeeld Fgfr1-4, Jak1-3), die functionele redundantie overwint die genetische / genomische interferentie technieken zoals RNAi en CRISPR / Cas9 voorkomt. Aangezien krachtiger en selectieve hulpmiddelverbindingen verkrijgbaar zijn bij zowel academische als farmaceutische geneesmiddelenontdekkingsprogramma's, worden ondergeschikte en slecht begrepen kinases naar de voorhoede van het ESC-onderzoek geduwd. Daarom stellen wij voor dat deze high-thRoughput screening benadering zal openstellen nieuwe mogelijkheden voor onderzoek naar core ESC regulerende netwerken.

Een kleine beperking van deze technologie is dat zelfs de meest krachtige en selectieve kleine-molecuul-remmers in vivo meerdere onverwante kinasen induceren en remmen. Echter, steeds meer uitgebreide kinaseremmers profileringsgegevens maken het mogelijk om functionele doelen van kinaseremmers gemakkelijk te identificeren (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -remmers). Tenslotte kan ons platform in principe toegepast worden om een ​​kleine molecuulverzameling en / of cellulaire test te onderzoeken waarvoor een hoge kwaliteit immunobloterende antilichamen beschikbaar zijn. Dit zal toelaten studie van meerdere regulerende systemen in pluripotenheidsregulering en het faciliteren van identificatie van kleine moleculair remmers die diverse cellulaire processen modificeren. Specifiek, we overwegen die toepassing van opkomende collecties van kleine moleculen zoals de epigeneTic probes die worden ontwikkeld door het Structural Genomics Consortium (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) heeft de mogelijkheid om verdere nieuwe regelgevers van pluripotente transities te ontdekken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
mESC media
CCE mESCs	ATCC	ATCC SCRC-1023
DMEM Media	Gibco	11965092
L-Glutamine	Gibco	25030081	Eindconcentratie: 2 mM
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Eindconcentratie: 50 U/ml
2-mercaptoethanol	Sigma	M6250	Eindconcentratie: 0,1 mM
Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion)	MRC-PPU reagents and services		Eindconcentratie: 100 ng/mL
Leukemia Inhibitory Factor	Thermo	PMC9484	Eindconcentratie: 100 ng/mL
Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140050	Eindconcentratie: 0,1 mM
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070	Eindconcentratie: 1 mM
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	Eindconcentratie: 5%
Defined Fetal Bovine Serum	Fisher	10703464	Eindconcentratie: 10%
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
TC-materialen
Trypsin-EDTA (0,05%), fenol rood	Thermo	25300054
Gelatine uit varkenshuid	Sigma	1890
Nunc MicroWell 96-wells microplates	Thermo	156545
DPBS, geen calcium, geen magnesium	Gibco	14190136
V-bodem 96-wells platen	Greiner Bio-one	651261
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Lysebuffer
Tris buffer	VWR	103157P
Natriumchloride	VWR	97061
EDTA	Sigma	E4884
1% NP-40	Sigma	9016-45-9
Natriumdeoxycholaat	Sigma	D6750-100g
β-glycerofosfaat	Sigma	G9422
Natriumpyrofosfaat	Sigma	13472-36-1
Natriumfluoride	Sigma	450022
Natriumorthovanadate	Sigma	450243
Roche Complete Protease Inhibitor Cocktailtabletten	Sigma	CO-RO
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chemicaliën
Tween	Sigma	P1379-1L
Melkpoeder	Marvel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Western Blotting
Protran BA 85 Nitrocellulose 0,45 µM  Poregrootte (20 cm x 20 cm vellen) (25 vellen)	GE	10401191
Ponceau S	Sigma	P7170-1L
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Laboratoriumapparatuur
Minifold I System	GE	10447850
ChemiDoc imager	BioRad	1708280
LiCor Odyssey Imager	LiCor
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Antilichamen
Anti-muis Nanog	Reprocell	RCAB001P
Anti-Dnmt3b	Imgenex	IMG-184A
IRDye 800CW Ezel anti-Konijn	Licor	926-32213
Anti-muis-HRP	Cell Signalling Technology	7076S
Anti-Klf2	Millipore	09-820
Anti-Klf4	R&D Systems	AF3158
Anti-Oct4	Santa Cruz	sc-5279