Turbidimetrie over menselijke gewassen bloedplaatjes: Het effect van de Pannexin1-remmer Brilliant Blue FCF op collageen geïnduceerde aggregatie

Samenvatting

We beschrijven een eenvoudige methode voor het isoleren van gewassen bloedplaatjes uit menselijk bloed, gevolgd door agonist-geïnduceerde aggregatie van bloedplaatjes metingen door turbidimetrie. Als voorbeeld passen we deze methode voor het bestuderen van aggregatie van humane bloedplaatjes aan collageen na voorincubatie met Pannexin1 kanaal remmer Brilliant Blue FCF.

Samenvatting

Turbidimetrie is een laboratorium techniek die wordt toegepast op de aggregatie van bloedplaatjes gesuspendeerd in hetzij plasma (bloedplaatjes-rijk plasma, PRP) of in buffer (gewassen bloedplaatjes) meten met behulp van een of een combinatie van agonisten. Het gebruik van gewassen bloedplaatjes gescheiden van hun plasma omgeving en in de afwezigheid van anticoagulantia zorgt voor het bestuderen van de intrinsieke bloedplaatjes eigenschappen. Onder het grote paneel agonisten, arachidonzuur (AA), adenosine di fosfaat (ADP), trombine en collageen zijn de meest gebruikte. De aggregatie respons wordt gekwantificeerd door meting van de relatieve optische dichtheid (OD) in de tijd van bloedplaatjes suspensie onder voortdurend roeren. Bloedplaatjes in homogene suspensie beperking van de doorgang van licht na de toevoeging van een agonist, treedt bloedplaatjes vormverandering produceren een kleine tijdelijke stijging van OD. Na deze eerste activeringsstap bloedplaatjes stolsels vormen geleidelijk, waardoor de doorgang van licht door de suspensie als een result verminderde OD. De aggregatie uiteindelijk uitgedrukt als een percentage ten opzichte van de OD van bloedplaatjes-arm plasma of buffer. Strenge kalibratie is dus essentieel bij het begin van elk experiment. In het algemeen: 0% kalibratie wordt door meting van de OD van niet-gestimuleerde bloedplaatjes suspensie tijdens het meten van de OD van het suspensiemedium dat geen bloedplaatjes een waarde van 100% ingesteld. Plaatjesaggregatie wordt meestal voorgesteld als een real-time aggregatie curve. Turbidimetrie is een van de meest gebruikte laboratoriumtechnieken voor het onderzoek van de bloedplaatjes functie en wordt beschouwd als de historische gouden standaard en gebruikt voor de ontwikkeling van nieuwe farmaceutische middelen die gericht zijn op het remmen van de aggregatie van bloedplaatjes. We beschrijven gedetailleerde protocollen 1) Bereiding van humane plaatjes gewassen en 2) turbidimetrische analyse van door collageen geïnduceerde aggregatie van menselijke bloedplaatjes gewassen voorbehandeld met de voedselkleurstof Brilliant Blue FCF die onlangs identiteit wastificeerd als een remmer van Pannexin1 (Panx1) kanalen.

Inleiding

Bloedplaatjes zijn essentiële bestanddelen van het bloed en hun belangrijkste functie-met-stollingsfactoren te stoppen met bloeden na bloedvat letsel. Bloedplaatjes zijn kleine (2-3 um) kernloze fragmenten verkregen van megakaryocyten van het beenmerg ^1. Trombocyten circuleren in niet-geactiveerde toestand, waarbij ze als lensvormig structuren. Bij onderbreking van het endotheel, bloedplaatjes verzamelen op de site van bloedvat letsel aan het gat, een proces genaamd primaire hemostase plug. Aanvankelijk bloedplaatjes hechten aan sub-endotheliale moleculen zoals collageen en von Willebrand factor, die blootgesteld zijn als gevolg van de schade-adhesie stap ^2. Vervolgens zij vorm veranderen en uitscheiden chemische boodschappers-activeringsstap. Tot slot hebben ze met elkaar te verbinden door het overbruggen van receptoren-aggregatie stap. Primaire hemostase wordt gevolgd door een secundair proces waarbij activering van de stollingscascade met fibrine depositie, welke stabiliserenTussen de eerste trombus ^2.

Acute ischemische gebeurtenissen zoals myocardinfarct ³ meestal het gevolg van trombi die worden gevormd door fysische verstoring (breuk) van een atherosclerotische plaque. Huidige anti-bloedplaatjes geneesmiddelen zijn de hoeksteen van de behandeling van deze wijdverspreide ziekte, maar hun klinisch voordeel wordt beperkt door een verhoogd risico op bloedingen. De meest voorgeschreven medicijnen cardiovasculaire patiënten, aspirine en anti-P2Y12 verbindingen, richten de tromboxaan A2 en ADP paden ⁴ getoond, die de belangrijkste routes die tot bloedplaatjes activering. Echter, innovatief onderzoek naar nieuwe targets die optimaal antitrombotische effecten en hemorragische risico zou in evenwicht te brengen is nog steeds noodzakelijk.

Vanaf de jaren 1960 ⁵ tot vandaag, heeft turbidimetrische aggregometrie een cruciale rol in het onderzoek gespeeld, het verbeteren van onze kennis van bloedplaatjes reactiviteit en in de monitoring van de potentie van anti-trombotische reagentia bij de mens. Turbidimetrie werd aanvankelijk toegevoerd aan PRP geëxtraheerd uit bloedmonsters. Inderdaad, bloedafname uitgevoerd in buisjes die citraat maakt een snelle en grote productie van PRP zonder enig effect op bloedplaatjes integriteit en functie. De stabiliteit op korte termijn (ongeveer 3 h) van PRP en de resterende plasmatische enzymen, zoals trombine, en de lage calciumconcentratie in verband met mogelijk artefact aggregatie profielen van groot ongemak voor de toepassing van PRP. Een belangrijke stap voorwaarts is de ontwikkeling van een methode voor bloedplaatjes isoleren met extra centrifugeren en wassen stappen ⁶ geweest. Kortom, PRP geïsoleerd uit volbloed on zuur-citraat-dextrose (ACD) en bloedplaatjes worden geïsoleerd na seriële centrifugatiestappen alvorens opnieuw gesuspendeerd in een iso-osmotische fosfaatbuffer (Tyrode's buffer) bevattende glucose, humaan serumalbumine en tweewaardige caties (Ca ²⁺ en Mg ^2+). Om veranderingen in de bloedplaatjes reactiviteit te vermijden, wordt de pH van buffer Tyrode zorgvuldig bewaard bij 7,35-7,4. Bovendien wordt ongewenste activering van bloedplaatjes voorkomen door toevoeging van prostacycline _(PGI2) vóór sommige centrifugatiestappen. Tenslotte toevoeging van apyrase gewassen plaatjes verhindert van resistent tegen de werking van ATP / ADP. De verkregen suspensie van bloedplaatjes mist coagulant factoren en de stabiliteit van bloedplaatjes met ten minste twee maal in vergelijking met PRP oplossingen. Bovendien, het feit dat bloedplaatjes inactief maar intact garandeert de reproduceerbaarheid van turbidimetrische metingen en biedt de mogelijkheid om de werking van agonisten of antagonisten van bloedplaatjesaggregatie optimaal bestuderen.

Met deze methode, hebben we in een recent onderzoek dat remmen van de vorming van Panx1 kanalen van een genetische benadering (knock-out-muizen) of verlagen Panx1 kanaalactiviteit met farmacologischebenaderingen verlaagde collageen-geïnduceerde bloedplaatjesaggregatie ^7. Panx1 vormt ATP-afgifte kanalen, die alom tot expressie worden gebracht op vele celtypen waaronder menselijke bloedplaatjes ^{7, 8.} In feite hebben we gedemonstreerd door turbidimetrie menselijke gewassen bloedplaatjes dat een 7 min voorincubatie met een panel van meer of minder specifieke chemische blokkers (probenecide, mefloquine en ¹⁰ Panx1 peptiden) voor de toevoeging van verschillende agonisten, remde het bijzonder collageen geïnduceerde aggregatie van bloedplaatjes terwijl bloedplaatjes reacties op AA en ADP niet werden getroffen. We hebben aangetoond dat ATP de afvoer via Panx1 kanalen specifiek ingrijpt in de GPVI signaleringsroute die leidt tot collageen-geïnduceerde aggregatie. Interessant meerdere FDA goedgekeurde verbindingen met toepassingen in andere ziekten (probenecid, mefloquine) invloed op de activiteit van Panx1 kanalen in bloedplaatjes. Aan de ene kant is dit opent nieuwe therapeutische perspectieven te selecterenively wijzigen bloedplaatjes reactiviteit. Aan de andere kant moet men mogelijke secundaire effecten van deze verbindingen te overwegen. In dit verband heeft de veilige voedselkleurstof Brilliant Blue FCF gebruikt op diverse snoep en energiedranken is beschreven als een selectieve remmer van Panx1 ^9. We beschrijven hier een protocol voor de isolatie van menselijke gewassen bloedplaatjes en turbidimetrische metingen van bloedplaatjesaggregatie ingericht om het effect van Brilliant Blue FCF kleurstof als een antagonist van plaatjesaggregatie onderzocht.

Protocol

Vijf ongerelateerde gezonde vrijwilligers werden gerekruteerd voor het nemen van bloedmonsters voor bloedplaatjes isolatie en aggregatie testen. Schriftelijke informed consent werd verkregen en het protocol werd goedgekeurd door de centrale ethische commissie van de Universiteit van Genève Ziekenhuizen. Alle vrijwilligers gecertificeerd om gezond te zijn en hebben geen bloedplaatjes storende drugs genomen tijdens ten minste de 10 dagen voorafgaand aan de experimenten.

1. Buffer Voorbereiding voor Human Collection Blood and Gewassen bloedplaatjes Isolation

1. Bereid een 100 ml waterige oplossing van zuur-citraat-dextrose (ACD) door het oplossen van 1,4 g citroenzuurmonohydraat (C ₆ H ₈ O ₇ • _H2O, 66,6 mmol), 2,5 g trinatriumcitraat dihydraat (Na _{3C 6H 5 7} O • 2 _H2O, 85 mM) en 2 g watervrij D (+) - glucose. De pH van de oplossing is ongeveer 4,5.
2. Bereid voorraad oplossingen voor buffer Tyrode als volgt
   1. Bereid voorraadoplossing 1 door oplossen van 80 g NaCl, 2 g KCI, 10 g _NaHCO3 en 0,58 g NaH _{2PO 4} * _H2O in 500 ml gedestilleerd _H2O De respectievelijke eindconcentraties zijn 2,73 M, 53,6 mmol, 238 mM en 8,4 mM. Bewaar de oplossing bij 4 ° C.
   2. Bereid voorraadoplossing 2 door het oplossen van 10,15 g _MgCl2 * 6 _H2O (100 mmol) in 500 ml gedestilleerd _H2O Bewaar oplossing bij 4 ° C.
   3. Bereid voorraadoplossing 3 door het oplossen van 10,95 g (100 mmol) _CaCl2 * 6 _H2O in 500 ml gedestilleerd _H2O Bewaar oplossing bij 4 ° C.
3. Bereid Tyrode-buffer door verdunning van 2,5 ml voorraadoplossing 1 in een eindvolume van 50 ml met gedestilleerd _H2O Dit correspondeert met eindconcentraties van 136,5 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 11,9 mmol _NaHCO3 en 0,42 mM NaH _{2PO 4} * _H2O een pH 7,35 en steriliseer filtering met 0,22 um filters.
4. Bereid Tyrode-albumine 0,35% buffer (TA buffer ⁷⁾ door het verdunnen 5 ml voorraadoplossing 1, 1 ml voorraadoplossing 2, 2 ml voorraadoplossing 3, 0,5 ml 1 M HEPES, 1,8 ml 200 g / l humaan serumalbumine en 0,1 g watervrij D (+) - glucose in een eindvolume van 100 ml gedestilleerd _H2O
   1. Breng de pH op 7,35 met 1 N HCl ingesteld en de osmolariteit tot 295 mOsm / l door toevoeging van gedestilleerd _H2 O (10% van het totale volume). Eindconcentraties in deze oplossing zijn: 124 mM NaCl, 2,44 mM KCI, 10,82 mmol _NaHCO3, 0,38 mM NaH _{2PO 4} * _H2O, 0,91 mM _MgCl2 * 6 _H2O, 1,82 mM _CaCl2 * 6 _H2O . Houd TA buffer bij 37 ° C gedurende het gehele experiment.

2. Bloedafname

1. Verzamel 45-50 ml veneus bloed uit de antecubitale ader met behulp van een 19 G naald en geen of lage tourniquet, in 50 ml buizen conTaining ACD anticoagulant (1 volume ACD 6 volumina bloed). Gooi de eerste 1-2 ml bloed op de aanwezigheid van thrombine en weefselfactor voorkomen.
   1. Na het verzamelen, meng het bloed met de ACD door voorzichtig omkeren van de buis. Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij 37 ° C.

3. Bereiding van menselijke Gewassen bloedplaatjes

1. Verwarm de centrifuge tot 37 ° C. Alle centrifugatiestappen hieronder worden uitgevoerd bij deze temperatuur.
2. Verzending van de verzamelde bloed in buizen van 15 ml (5 ml per buis) en gecentrifugeerd bij 250 xg gedurende 13 min PRP verkrijgen.
   Opmerking: Deze centrifugatiestap resulteert in de productie van drie lagen in de steekproef: 1) De bovenlaag, bestaande uit plasma, bloedplaatjes, en een klein deel van de witte bloedcellen. 2) De tussenlaag een deel rijk aan witte bloedcellen. 3) De onderste laag, die in hoofdzaak bestaat uit rode bloedcellen.
3. Verzamel de PRP door pipetteren de bovenste layer voorzichtig in een nieuwe buis van 15 ml tot maximaal verontreiniging te voorkomen met rode en witte bloedcellen, en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
4. Centrifugeer de PRP bij 2200 xg gedurende 12 min (5 ml PRP).
   Opmerking: Deze centrifugatiestap worden uitgevoerd met lage rem of zonder rem.
5. Verwijder het supernatant (bloedplaatjes-arm plasma) en voorzichtig resuspendeer de pellet met 10 ml TA buffer met 2 pl / ml heparine (5000 U / ml) en 2,5 pl / ml 25 uM _PGI2 met een plastic Pasteur pipet. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
6. Voeg 2,5 ul / ml 25 uM _PGI2 en centrifugeer gedurende 8 minuten bij 1900 xg (met lage rem of zonder rem).
7. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 5 ml TA buffer die 2,5 ul / ml 25 uM _PGI2 met een plastic Pasteur pipet. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
8. Gedurende de incubatieperiode Pipetteer 150 ul van de suspensie in bloedplaatjeseen 1,5 ml buis en tel plaatjes, onder toepassing van een geautomatiseerde celteller (die detecteert de grootte van bloedcellen door het meten van de veranderingen in de gelijkstroom weerstand).
9. Na 10 min incubatie, voeg 2,5 ul / ml 25 uM _PGI2 de bloedplaatjessuspensie en onmiddellijk gecentrifugeerd bij 1900 xg gedurende 8 minuten.
10. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet tot een concentratie van 250.000 bloedplaatjes / ul met een adequaat volume van TA buffer (dat wil zeggen als het celgetal 500.000 per uL, resuspendeer in 10 ml TA buffer) met 32 ul / ml apyrase 0.01 U / mL (uiteindelijke concentratie 0,32 U / ml).
    OPMERKING: Hoge concentratie van apyrase wordt gebruikt voor de desensibilisatie van P2X1 receptoren geïnduceerd door spontane afscheiding van ATP ^{10, 11} bij afwezigheid van agonisten te voorkomen. Dit is belangrijk omdat collageen geïnduceerde responsen geïnduceerd door snelle paracriene / autocriene activering van P2X1 door ATP vrijgegeven frOM geactiveerde bloedplaatjes. Indien de plaatjes signaleringsroute behoud van P2X1 functie niet kritisch vereist, gebruikt 0,02 U / ml apyrase. Verschillende studies (besproken in Mahaut-Smith et al. ¹⁰⁾ toonde dat 0,02 U / ml apyrase vermijdt ADP receptor P2Y1 desensitisatie met verwaarloosbare P2X1 reacties.
11. Incubeer de celsuspensie gedurende ten minste 30 minuten bij 37 ° C alvorens de aggregometric metingen. Het preparaat is stabiel gedurende 5-8 uur.

4. aggregometrie

1. Bereid fibrinogeen (56 mg / ml) in Tyrode's buffer.
2. Pipet 260 pi bloedplaatjes suspensie in glazen cuvetten (figuur 1A; links cuvet) bevattende 10 pl van fibrinogeen (56 mg / ml) en een magnetische roerstaaf, daarna incubeer de suspensie gedurende 2-3 minuten bij 37 ° C in incubatie onderhavige putjes in de aggregometer (figuur 1B en 1C).
3. Pre-incubeer met de Panx1remmer Brilliant Blue FCF door toevoeging van 10 pi van een 2,8 mM of 28 mM voorraadoplossing (eindconcentratie 100 pM en 1 mM, respectievelijk) gedurende 7 minuten bij 37 ° C.
4. Kalibreer de aggregometer een assumptive 100% aggregatiewaarde door meten van de OD van een cuvette die 10 pi fibrinogeen (56 mg / ml), 10 pl Brilliant Blue FCF (2,8 mM of 28 mM) en TA buffer zonder bloedplaatjes.
   1. Plaats de cuvette in een combinatie goed onder automatisch roeren en op de betreffende toets op het toetsenbord van de computer verbonden met de aggregometer (dwz druk op F1 als aggregatie put 1 wordt gebruikt).
      LET OP: Deze hieronder beschreven experiment omvat Brilliant Blue FCF. De verbinding voor kalibratie moet worden aangepast aan de experimentele conditie.
5. Kalibreer de aggregometer een assumptive 0% aggregatiewaarde door hetzelfde monster bloedplaatjes die wordt gebruikt voor het experiment onder automatische Stirring.
   1. Plaats de cuvette in de aggregatie goed en druk op de bijbehorende knop op het toetsenbord van de computer verbonden met de aggregometer. Wacht ongeveer 20-30 s voordat u verder gaat. Deze vertraging dient om ervoor te zorgen dat er geen aggregatie gebeurt voordat u de agonisten.
      OPMERKING: Aangezien verschillen in aantal plaatjes van invloed op de gemeten OD kan hebben, 0% ijkingsstap moet worden herhaald voor iedere afzonderlijke meting.
6. Voeg 20 ul van gewenste agonist, bijvoorbeeld 15 ug / ml collageen (1 ug / ml eind) en 1,125 mM arachidonzuur (75 pM uiteindelijk) in de cuvette. Onmiddellijk start de opname onder voortdurend roeren automatisch door op de betreffende knop op het toetsenbord van de computer verbonden met de aggregometer.
   LET OP: De toevoeging van de agonist induceert activering van bloedplaatjes. Bloedplaatjes aggregaten kan duidelijk worden onderscheiden in het glas cuvet aan het einde van het experiment (figuur 1A; right cuvet).
7. De opname stopt automatisch na 6 min. Op dit punt, de gegevens opslaan door te klikken op het icoon te redden van de computer.
   Opmerking: De berekening van de snelheid van aggregatie wordt uitgevoerd door de computer, die de eindresultaten van het aggregatie proces als een percentage uitdrukt.
8. Analyseer de gegevens.
   1. Voor meer uitgebreide informatie over protocollen voor de bereiding van gewassen bloedplaatjes suspensies en turbidimetrische bepaling van bloedplaatjesaggregatie, verwijzen naar andere documenten geschreven door deskundigen op het gebied ^{12, 13.}

Resultaten

De aggregometer software produceert automatisch de aggregatie rondingen en geeft de waarden voor maximale aggregatie in percentage. De waarden kunnen met het oog op statistische analyses uit te voeren en te visualiseren maximale aggregatie waarden in de vorm van staafdiagrammen worden gekopieerd naar een data-analyse software. Eventueel kan elk individueel punt van de aggregatie krommen achtereenvolgens worden uitgevoerd in een spreadsheet software en statistische software (GraphPad ...

Discussie

Er is veel belangstelling voor het vinden van nieuwe geneesmiddelen in staat tot het moduleren van de functie van bloedplaatjes om trombose te voorkomen, zonder het verhogen van het risico van bloeden. Hiertoe kunnen in vitro laboratoriumtests die betrouwbaar en reproduceerbaar kunnen controleren aggregatie reacties bij menselijke bloedplaatjes absoluut noodzakelijk. Turbidimetrische aggregometrie is een eenvoudige techniek uit te voeren. Echter, moet een aantal voorzorgsmaatregelen in acht te worden gehouden. ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O)	Roth	5949-29-1	gevaar voor oogbeschadiging/oogirritatie
trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O)	Sigma-Aldrich	S1804	-
D(+)-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	-
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	-
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	-
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014	-
Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	-
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	M9272	-
Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	442909	gevaar voor oogbeschadiging/oogirritatie
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes)	ThermoFisher Scientific	15630	-
human serum albumin	CSL Behring	00257/374	-
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331	Corrosiefd en irriterend voor de luchtwegen. Kan ernstige huid- en oogbeschadigingen veroorzaken.
Eppendorf 5810 R	Fisher Scientific	-	-
heparin	Drosspharm AG/SA	20810
prostacyclin I2 (PGI2)	Cayman	18220	-
apyrase from potatoes	Sigma-Aldrich	A6535	-
fibrinogen (Haemocomplettan)	CSL Behring	HS 73466011	-
thrombo-aggragometer SD-Medical	SD-Innovation	TA8V	-
Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich	80717	Schadelijk voor aquatisch leven met langdurige effecten (Mijd vrijlating in het milieu)
collagen	Horm, Nycomed		-
arachidonic acid	Bio/Data corporation	C/N 101297	-
cell counter Sysmex KX-21N	Sysmex Digitana	-	-
HEPES	Gibco	15630-056	-
glass cuvettes	SD-Innovation	THCV1000	-
magnetic stirrers	SD-Innovation	THA100	-