Methodenartikel

Optimalisatie en Vergelijkende Analyse van Plant Organellaire DNA Verrijkingsmethoden Geschikt voor Volgend Sequencing

DOI:

10.3791/55528

⸱

28 juli 2017

 ,  , 
1Cereal Disease Laboratory, United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service, 2Department of Horticultural Science, University of Minnesota, 3Department of Plant Pathology, University of Minnesota

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De vergelijking en optimalisatie van twee organellaire DNA-verrijkingsmethoden worden voorgesteld: traditionele differentiële centrifugatie en fractionering van het totale gDNA op basis van methyleringsstatus. We beoordelen de resulterende DNA-hoeveelheid en kwaliteit, tonen de prestaties aan bij korte-leesvolgorde-sequencing, en bespreken het potentieel voor gebruik bij langlezen single-molecule sequencing.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plant organellaire genen bevatten grote, herhalende elementen die paren of recombinatie kunnen ondergaan om complexe structuren en / of sub-genomische fragmenten te vormen. Organellaire genen bestaan ​​ook in mengsels binnen een gegeven cel of weefsel type (heteroplasmie), en een overvloed aan subtypen kunnen tijdens de ontwikkeling veranderen of wanneer onder stress (substochiometrische verschuiving). Next-generation sequencing (NGS) technologieën zijn nodig om diepgaand begrip van organellaire genoomstructuur en -functie te verkrijgen. Traditionele sequencing studies gebruiken verschillende methoden om organellair DNA te verkrijgen: (1) Als een grote hoeveelheid startweefsel wordt gebruikt, wordt het gehomogeniseerd en onderworpen aan differentiële centrifugatie en / of gradiëntzuivering. (2) Als een kleiner hoeveelheid weefsel wordt gebruikt ( dwz als zaden, materiaal of ruimte beperkt zijn), wordt hetzelfde proces uitgevoerd als in (1), gevolgd door gehele genoom amplificatie om voldoende DNA te verkrijgen. (3) Bioinformatica analyse kan gebruikt worden om te zoekenHet totale genomische DNA en het analyseren van organellair leest. Al deze methoden hebben inherente uitdagingen en afwijkingen. In (1) kan het moeilijk zijn om zo'n grote hoeveelheid startweefsel te verkrijgen; In (2), zou de volledige genoom amplificatie een sequencing bias kunnen introduceren; En in (3) kan homologie tussen nucleaire en organellaire genen interfereren met assemblage en analyse. Bij planten met grote nucleaire genen is het voordelig om te verrijken voor organellair DNA om sequentiekosten en sequentiekomplexiteit voor bioinformatica analyses te verminderen. Hiermee vergelijken we een traditionele differentiële centrifugatiemethode met een vierde methode, een aangepaste CpG-methyl pulldown-benadering, om het totale genomische DNA in kern- en organellaire fracties te scheiden. Beide methoden leveren voldoende DNA voor NGS, DNA dat sterk verrijkt is voor organellaire sequenties, alhoewel bij verschillende verhoudingen in mitochondriën en chloroplasten. We presenteren de optimalisatie van deze methoden voor tarwebladweefsel en bespreken belangrijke voordelen en dNadelen van elke aanpak in het kader van sample input, protocol gemak en downstream applicatie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genoom sequencing is een krachtig instrument om de onderliggende genetische basis van belangrijke planteigenschappen te ontleden. De meeste genoom-sequencing studies richten zich op het nucleaire genoomgehalte, aangezien de meerderheid van de genen zich in de kern bevinden. Organellaire genen, waaronder de mitochondriën (over eukaryoten) en plastiden (in planten, de gespecialiseerde vorm, de chloroplast, werken in fotosynthese) dragen echter belangrijke genetische informatie die essentieel is voor organisme-ontwikkeling, stressrespons en algemene fitness 1 . Organellaire genen zijn typisch opgenomen in totale DNA-extracties die bestemd zijn voor nucleaire genoom sequencing, hoewel methoden om organelle getallen te verminderen voorafgaand aan DNA-extractie ook 2 gebruikt worden . Veel studies hebben sequentieresultaten gebruikt van totale gDNA-extracties om organellaire genen te combineren 3 , 4 , 5 ,Xref "> 6 , 7. Maar wanneer het doel van de studie zich richt op organellaire genen, verhoogt het gebruik van het totale gDNA de sequencing kosten, omdat veel lezingen" verloren "zijn aan de nucleaire DNA sequenties, met name in planten met grote nucleaire genen Bovendien, door de duplicatie en overdracht van organellaire sequenties in het nucleaire genoom en tussen organellen, is het oplossen van de juiste mapping positie van sequentiebepaling leest op het juiste genoom bioinformatisch uitdagend 2 , 8. De zuivering van organellaire genen uit het nucleaire genoom is bovendien een Strategie om deze problemen te verminderen. Verdere bioinformatica strategieën kunnen worden gebruikt om te scheiden, die kaart leest naar gebieden van homologie tussen de mitochondria en chloroplasten.

Terwijl de organellaire genen van veel plantensoorten zijn gesorteerd, is weinig bekend over de breedte van organellaire genoom diversiteitVerkrijgbaar in wilde populaties of in gekweekte broedplaatsen. Organellaire genen zijn ook bekend als dynamische moleculen die significante structurele herrangschikking ondergaan als gevolg van recombinatie tussen herhaalsequenties 9 . Bovendien bevinden zich meerdere kopieën van het organellaire genoom binnen elke organel, en meerdere organellen bevinden zich in elke cel. Niet alle kopieën van deze genen zijn identiek, die bekend staat als heteroplasmie. In tegenstelling tot het kanonieke beeld van 'mastercircles', is er nu bewijs voor een complexere beeld van organellaire genoomstructuren, waaronder sub-genomische cirkels, lineaire chromosomen, lineaire concatamers en vertakte structuren 10 . De montage van plantorganellaire genen wordt verder gecompliceerd door hun relatief grote maten en substantiële omgekeerde en directe herhalingen.

Traditionele protocollen voor organellaire isolatie, DNA-zuivering en daaropvolgende genen E-sequencing zijn vaak omslachtig en vereisen grote hoeveelheden weefselinvoer, met een aantal gram tot en met honderden grams jong bladweefsel dat nodig is als uitgangspunt 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Dit maakt het sequentieren van het organellair genoom ontoegankelijk wanneer het weefsel beperkt is. In sommige situaties zijn zaadhoeveelheden beperkt, zoals wanneer het nodig is om op generatie of mannelijke steriele lijnen te sequentie die via kruising moet worden gehandhaafd. In deze situaties kan organellair DNA worden gezuiverd en vervolgens onderworpen aan gehele genoom amplificatie. Hele genoom amplificatie kan echter significante sequencing bias introduceren, wat een bijzonder probleem is bij het beoordelen van structurele variatie, sub-genomische structuren en heteroplasmiveaus> 18. Recente vooruitgang in de voorbereiding van de bibliotheek voor korte-lezen sequencing technologieën hebben de laag-input barrières overwonnen om de volledige genoom amplificatie te vermijden. Bijvoorbeeld, de Illumina Nextera XT bibliotheekbereidingskit maakt het mogelijk om zo weinig als 1 ng DNA te gebruiken als ingang 19 . Echter, standaard bibliotheekpreparaten voor langlose sequencing toepassingen, zoals PacBio of Oxford Nanopore sequencing technologieën, vereisen nog steeds een relatief hoge hoeveelheid input DNA, die een uitdaging kan vormen voor organellair genoom sequencing. Recentelijk zijn nieuwe gebruikersgemaakte, langlezen sequentieprotocollen ontwikkeld om de invoerhoeveelheden te verminderen en om genoomsequencing in monsters te helpen vergemakkelijken, waarbij het verkrijgen van microgram-hoeveelheden DNA moeilijk is 20 , 21 . Het verkrijgen van hoogmoleculair gewicht, pure organellaire fracties om in deze bibliotheekpreparaten te voeden blijft echter een uitdaging.

We zochten tO vergelijken en optimaliseren van organellaire DNA-verrijking en isolatiemethoden die geschikt zijn voor NGS zonder de noodzaak van gehele genoom amplificatie. Specifiek, ons doel was om de beste praktijken te bepalen om te verrijken voor organellair DNA met een hoge molecuulgewicht uit beperkte uitgangsmaterialen, zoals een subsample van een blad. Dit werk presenteert een vergelijkende analyse van methoden om te verrijken voor organellair DNA: (1) een gemodificeerd, traditioneel differentiaalcentrifugatie protocol versus (2) een DNA fractioneringsprotocol gebaseerd op het gebruik van een commercieel verkrijgbare DNA-CpG-methyl-bindende domeinproteïne-uitrolmethode 22 toegepast op plantweefsel 23 . Wij adviseren beste praktijken voor het isoleren van organellair DNA uit tarwebladweefsel, dat gemakkelijk kan worden uitgebreid tot andere planten en weefselsoorten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generatie van plantaardige materialen voor organellaire isolatie en DNA-extractie

  1. Standaardgroei van tarwe zaailingen
    1. Plant zaden in vermiculiet in kleine vierkante potten met 4 - 6 zaden per hoek. Overbrengen naar een kas of groeikamer met een 16 uur lange cyclus, 23 ºC dag / 18 ºC nacht.
    2. Water de planten elke dag. Bemest de planten met ¼ theelepel granulaire 20-20-20 NPK meststof bij ontkieming en 7 dagen na ontkieming.
  2. Alternatieve etiolatie van tarwe zaailingen
    1. Volg stap 1.1, maar plaats de potten in een donkere groeikamer gedurende 23 uur bij 23 ° C gedurende 16 uur. Als alternatief, bedek de planten in het kas ( bijv. Met een opslagcontainer, maar de juiste ventilatie moet worden gehandhaafd).
  3. Groei en weefselverzameling
    1. Groei de planten gedurende 12 - 14 dagen. Voor de meeste tarwegenotypeS, 75-100 zaailingen leveren ongeveer 10-12 g weefsel, wat voldoende is voor twee organellaire extracties met behulp van de differentiële centrifugatie methode (sectie 2); Slechts één plant is nodig als het gebruik van de DNA-CpG-methylering-gebaseerde benadering tot fractionering organellair uit nucleair DNA (sectie 3) gebruikt wordt.
    2. Als u gebruik maakt van de differentiële centrifugatie benadering, versamel weefsel vers en ga onmiddellijk door om de monsters te verwerken, zoals beschreven in sectie 2.
    3. Als u gebruik maakt van de CpG-methyl-pulldown-aanpak, oogst u 20 mg secties van jong bladweefsel in microcentrifugebuizen (gebruik het standaardgewassen of gefiltreerde weefsel, zie de representatieve resultaten ). Snapvries op vloeibare stikstof en vries bij -80 ºC tot gebruik. Ga door naar de pulldown fractionering van DNA, zoals beschreven in sectie 3.

2. Methode # 1: DNA-extractie met behulp van differentiële centrifugatie (DC)

OPMERKING: De diffErentiale centrifugatieprotocol werd gemodificeerd uit twee publicaties die geoptimaliseerde omstandigheden om beide organellen te isoleren maar verrijken voor mitochondria 17 , 24 . Het resulterende protocol is minder tijd intensief en gebruikt minder giftige chemicaliën dan de vorige methoden. Specifiek hebben wij wijzigingen aangebracht aan de buffers en wasstappen, inclusief de toevoeging van polyvinylpyrrolidon (PVP) aan de STE-extractiebuffer en de eliminatie van de eindwas in NETF-buffer, die natriumfluoride (NaF) bevat.

Voorzichtigheid: De voorbereiding en het gebruik van STE-buffer dienen onder een chemische afzuigkap te worden uitgevoerd met adequate persoonlijke beschermingsmiddelen, aangezien deze buffer 2-mercaptoethanol (BME) bevat.

  1. Dingen om te doen voordat u begint
    1. Zorg ervoor dat alle apparatuur extreem schoon is en autoclaaf alle apparatuur die autoclaaf kan worden ( bijv. Slijpcilinders, high-speed centriVuilbuizen, enz. ).
      OPMERKING: Filtertips worden aanbevolen voor alle stappen die pipettering nodig hebben om kruisbesmetting te vermijden.
    2. Zie de lijst met benodigde apparatuur en reagentia en berei de vereiste buffers en werkvoorraden voor methode # 1 ( tabel 1 ) op. Koel de cryogene slijpblokken tot -20 ºC en de rotoren en buffers tot 4 ºC, zet de microcentrifuge op tot 4 ºC, en draai een waterbad van 37 ºC aan.
  2. Isolatie van organellen
    1. Oog 5 g vers weefsel op en spoel het in koud, steriel water in een gekoelde beker op ijs.
      OPMERKING: Bewaar de monsters altijd op ijs tijdens alle werkzaamheden en transporten van en naar de centrifuges, dampkasten, enz. Alternatief, werk in een koude kamer als er voldoende ruimte en apparatuur beschikbaar zijn om het protocol uit te voeren.
    2. Met behulp van een schaar, snijd het bladweefsel in 1 cm-stukken rechtstreeks in een 50 ml buis met twee keramische slijpencilinders.
      OPMERKING: Reinig of vervang de schaar tussen monsters om kruisbesmetting te vermijden.
    3. Als er geen weefselhomogenisator is, gebruik dan een mortel en stamper en volg dan stap 2.2.4 - 2.2.9.
      1. Knip het bladweefsel in een voorgekoeld mortel op ijs. Maal de monsters gedurende 2 - 3 minuten in 15 ml STE (in de afzuigkap).
      2. Giet de buffer uit (laat het weefsel in het mortel) door een trechter die een laag pre-natte, steriele filtratie doek bevat (~ 22 tot 25 μm poriegrootte, zie het hoofdprotocol voor details) in een andere 50 ml buis . Voeg nog eens 10 ml STE toe aan de mortel en stamper en homogeen opnieuw.
      3. Giet het gehomogeniseerde weefsel en de buffer in dezelfde trechter. Spoel de mortel en stamper met 10 ml STE en giet het in de trechter. Druk de filtratielijm in de trechter en draai deze uit om zo veel mogelijk vloeistof te herstellen.
        OPMERKING: Vervang handschoenen tussen monsters om kruisbesmetting te vermijden. Ga verder met de proTocol in stap 2.2.10.
    4. Voeg 20 ml STE (in de dampkap) toe aan elke 50 ml buis.
    5. Plaats de monsters in voorgekoelde cryogene slijpblokken in een weefselslijpapparaat en grind de monsters gedurende 2 x 30 s bij 1.750 rpm. Draai de steekproefposities en plaats de monsters op ijs voor ~ 1 min tussen de grinds.
      OPMERKING: In deze stap kan een mortel en stamper, blender of ander weefselslijp / homogeniseringsapparaat gebruikt worden. Echter, elke methode zal de resulterende DNA-kwaliteit beïnvloeden tot verschillende graden, en daarom moet de lengte en de kwaliteit van de DNA worden beoordeeld voordat ze verder gaan met downstream toepassingen.
    6. Steek een trechter in een schone buis van 50 ml in ijs. Plaats een laag filtratie doek in de trechter en pre-nat met 5 ml STE. Doe de doorstroming niet weg.
    7. Giet het gehomogeniseerde weefsel in de trechter. Spoel de slijpbuis af met 15 ml STE, herhaal en draai de buis om de muren en deksel te spoelen en giet in de funnel.
    8. Verwijder de keramische stenen voorzichtig en druk vervolgens de filterdoek in de trechter.
      OPMERKING: Vervang handschoenen tussen monsters om kruisbesmetting te vermijden.
    9. Wikkel de buisdoppen met parafilm om spleten te vermijden. Centrifugeer bij 2000 xg gedurende 10 minuten bij 4 ºC.
    10. Zuig de supernatant zorgvuldig door met behulp van een serologische pipet (vermijd de pellets te verstoren) en plaats deze in een 50 ml hoge centrifugebuis (indien de buizen niet afdichte afdichtingen hebben, draai de buisdoppen met parafilm om spleten te vermijden). Gooi de pellets weg.
    11. Bal de buizen bij binnen 0,1 g met STE en centrifugeer het resulterende supernatant gedurende 20 minuten bij 18.000 xg en 4 ºC. Om de buizen in evenwicht te brengen, plaats een kleine beker ijs op de balans, doe de schaal af en weeg de monsters op ijs om ze koud te houden. Alternatief, gebruik een evenwicht en een dampkap in een koude kamer.
    12. Gooi de supernatant weg. Voeg 1 ml ST toe aan de pellet en zet ons voorzichtig opEen zachte penseel geven. Voeg 24 ml ST (eindvolume van 25 ml) toe en meng / wervel ( dwz druk de verfborstel aan de zijkant van de buis om alle vloeistof te verwijderen).
    13. Bal de buizen in binnen 0,1 g met behulp van ST. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 18.000 xg en 4 ºC. Ondertussen bereiden DNaseI-oplossing (zie tabel 1 voor voorraad- en werkoplossingsrecepten). Voor elk monster maak één 200 μl aliquot in een 1,5 ml buis.
    14. Verwijder de supernatant, vlek de buis en schuif de pellet (nog steeds in een centrifugebuis met hoge snelheid) in 300 μL ST met een zachte penseel. Plaats de penseel in de eerder voorbereide 1,5 ml buis die 200 μl DNaseI oplossing bevat en draai de verfborstel om eventuele resterende pelletjes in de penseel vast te houden. Pipetteer de DNaseI-oplossing terug in de hogesnelheidssentrifuge-buis en zwenk zachtjes om te mengen.
    15. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een waterbad (wikkel parafilm om de bovenkant van de buis om condensatie lekine te voorkomenG in de pet). Meng zachtjes door 2 keer wervelen tijdens incubatie.
    16. Pijp het pelletmengsel voorzichtig uit de buis met een pipettaart met een brede opening en plaats het in een 1,5 ml buis. Voeg 500 μL 400 mM EDTA, pH 8,0, aan de centrifugebuis met hoge snelheid en zachtjes pipet om alle resterende pellet uit de buis te krijgen. Breng de EDTA over op dezelfde 1,5 ml, laagbindende buis als het pelletmengsel en meng zachtjes door inversie.
    17. Centrifugeer bij 18.000 xg gedurende 20 minuten bij 4 ºC. Verwijder de supernatant, vlek de buis en gebruik tegelijkertijd voor DNA-isolatie. Indien nodig, pellets bevriezen bij -20 ºC, maar dit kan resulteren in een rendement vermindering, aangezien resterend DNaseI het monster DNA kan degraderen als het niet onmiddellijk wordt verwerkt.
  3. DNA-extractie uit geïsoleerde organellen met behulp van een commerciële kolom gebaseerde aanpak
    OPMERKING: Zie het kitshandboek voor het volledige protocol 25 , en zie hieronder voor wijzigingen. PrHet overbrengen van directe organische isolatie tot DNA-extractie heeft de voorkeur. Herhaalde bevriezing en ontdooien zullen DNA fragmentgroottes verminderen en leiden tot DNA-afbraak door residueel DNaseI. Beperk vortexing of krachtige pipettering, omdat dit het DNA kan scheren. Het gebruik van microcentrifugebuizen met een lage binding wordt aanbevolen om DNA-herstel te maximaliseren.
    1. DNA-extractie procedure
      OPMERKING: Lees het gedetailleerde handelsprotocol 25 voordat u begint ervoor te zorgen dat de buffers goed gemaakt / opgeslagen zijn en dat de spin-column procedures worden begrepen.
      1. Voeg 180 μL Buffer ATL direct in de buis toe met de pellet (ontdooid indien eerder bevroren en geëquilibreerd tot kamertemperatuur op de benchtop).
      2. Ga verder met stap 3 in het protocol voor "DNA-zuiveringen van weefsels" in het kitshandboek, met de volgende wijzigingen: een 30 minuten lysis in stap 3, inclusief de optionele RNase A-spijsvertering, en eluteren in 3 x 200 μL AE ( Elk in een seParate tube en combineer dan de elutions).
      3. Bewaar een aliquot (minstens 20 μL) voor qPCR (zie stap 4.1). Om te kwantificeren alvorens te concentreren, bespaar nog 1 μL voor kwantificatie met hoge gevoeligheid.
      4. Indien gewenst, ga verder met monsterconcentratie.
  4. Monsterconcentratie met commerciële filtereenheden
    OPMERKING: Zie het commercieel protocol 26 voor meer details. Afhankelijk van het stroomafwaartse gebruik is het wellicht niet nodig om de monsterconcentratie uit te voeren ( bijvoorbeeld voor eindpunt PCR en qPCR toepassingen). Voor NGS bibliotheekconstructie is het echter waarschijnlijk nodig om verdund organellair DNA te concentreren dat verkregen wordt na DNA-extractie.
    1. Concentratie kolom procedure
      1. Voorzichtig voorweeg (zie tabel 2 ) de lege filtereenheid (zonder buis) op een schoon stuk weegpapier op een digitaal analytisch evenwicht. Noteer het gewicht.
      2. PiPette de gecombineerde elutions in de filterunit en weeg weer goed.
        OPMERKING: De commerciele handleiding 26 zegt dat het maximale volume van de filtereenheid 500 μL is, maar maximaal 575 μL kan onmiddellijk worden toegevoegd aan het apparaat zonder overloop.
      3. Plaats de gevulde filtereenheid zorgvuldig in een buis (voorzien van de kolommen). Centrifugeer bij 500 xg voor de gewenste tijd om het vereiste concentraatvolume te bereiken. Voor een monstervolume van ~ 575 μL resulteert een 20-minuut-spin gewoonlijk in een concentratievolume van 15 - 30 μl.
      4. Verwijder de filterunit uit de buis en weeg opnieuw. Gebruik de tabel om te bepalen of het gewenste concentratievolume is bereikt. Zo niet, centrifugeer opnieuw bij 500 xg voor een kortere tijd en weeg opnieuw; Herhaal tot het gewenste concentratievolume is bereikt.
      5. Plaats een nieuwe buis (voorzien van de kolommen) boven op de filterunit en draai in omgekeerde richting. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 1.000 xg om de co te overbrengenNcentreer naar de buis.
      6. Bepaal het teruggevorderde volume. Dit zal meestal ~ 3 - 5 μL minder zijn dan het berekende volume, door filterretentie. Als overconcentreerd, verdund met steriel water of TE om het gewenste volume te bereiken.
      7. Kwantificeer het DNA met behulp van kwantificatie met hoge gevoeligheid (per fabrikant instructies).

3. Methode # 2: Methylefractie (MF) Aanpak om te verrijken voor organellair DNA uit totaal genomisch DNA

OPMERKING: Dit protocol is gewijzigd van een door DEI ontwikkeld DNA-extractie protocol voor planten en schimmels 27 en het commerciële Microbiome DNA Enrichment Kit Protocol 28 . In theorie kan elk DNA-isolatieprotocol dat DNA met een hoog molecuulgewicht oplevert, gebruikt worden voor de pulldown. Voor korte-lezen sequentiebepaling is elke extractie die overwegend> 15 kb fragmenten leidt voldoende geschikt voor gebruik bij de uitrol. Voor loNg-read sequencing, grotere fragmenten kunnen wenselijk zijn. Daarom hebben we dit protocol geoptimaliseerd om DNA met hoog molecuulgewicht te produceren.

  1. Isolatie van totaal DNA
    OPMERKING: zie de lijst met benodigde apparatuur en reagentia en berei de vereiste buffers en werkvoorraden voor methode # 2 op ( tabel 1 ). Voeg lysende enzymen toe aan de lysisbuffer voorraad om de lysis buffer werkoplossing te maken. Zet de thermomixer aan en zet deze op 37 ° C. Zet het waterbad aan op 50 ° C en plaats de QF-buffer in het bad. Plaats 70% EtOH in de vriezer en zet de microcentrifuge op 4 ° C.
    1. Totale DNA-extractie met behulp van commerciële DNA-extractiekolommen
      OPMERKING: Lees voordat u begint het commerciele handboek 29 voor gedetailleerde informatie over het gebruik van de zwaartekracht-anion-uitwisselingszuilen. De kolommen kunnen worden opgesteld met behulp van een gespecialiseerd rek of over de buizen geplaatst met behulp van de meegeleverde plastic ringen. Alle stappen, inclusief de gEnomische tips, mogen door de zwaartekrachtstroom doorgevoerd worden, en restvloeistof mag NIET gedwongen worden.
      1. Maal 20 mg bevroren weefsel in vloeibare stikstof in een 2 ml-laag buis met behulp van handgeslepen slijpstammen, ontworpen voor 2 ml buizen.
      2. Voeg 2 ml lysisbuffer werkoplossing toe (de buizen zijn erg vol).
      3. Incubeer in een thermomixer bij 37 ° C gedurende 1 uur met zachte roering bij 300 rpm. Als een thermomixer niet beschikbaar is, incubatie op een hitteblok en het mengen met zacht vlokken om de 15 minuten is een geschikt alternatief.
      4. Voeg 4 μL RNase A (100 mg / ml, uiteindelijke concentratie van 200 μg / ml) toe. Inverteer om gedurende 30 minuten bij 37 ° C te mengen en in een thermomixer te incuberen, met zachte roering bij 300 rpm.
      5. Voeg 80 μl eiwitase K (20 mg / ml, eindconcentratie 0,8 mg / ml) toe, omgekeerd om te mengen en incubeer 2 uur bij 50 ° C in een thermomixer met zachte roeren bij 300 rpm.
      6. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C en 15.000 xg om de onoplosbare puin te pelletiseren.
      7. Terwijl de monsters centrifugeren, equilibreren de kolommen met 1 ml Buffer QBT en laat de kolom leeg worden door de zwaartekrachtstroom.
      8. Gebruik een pipette-tip met breedboring om het monster (vermijd de pellet) onmiddellijk aan de geëquilibreerde kolom toe te passen en laat het door de kolom volledig doorlopen. Als het monster bewolkt wordt, filter dan of centrifugeer opnieuw voor de toepassing naar de kolom (zie het commerciële handboek voor details 29 ).
      9. Zodra het monster volledig in de hars is gekomen, was de kolom met 4 x 1 ml buffer QC.
      10. Suspenseer de kolom over een schone, 2 ml microcentrifugebuis met een laag bindmiddel. Verwijder het genomische DNA met 0,8 ml buffer QF vooraf verwarmd bij 50 ° C.
      11. Neerslaan van het DNA door 0,56 ml (0,7 volumes elutiebuffer) van kamertemperatuur-isopropanol aan het geëlueerde DNA toe te voegen.
      12. Meng door inversie (10X) en centrifugeer onmiddellijk gedurende 20 minuten bij 15.000 xg en 4 ° C. ZorgVerwijder de supernatant volledig zonder de glazen, losgelegen pellet te storen.
      13. Was de gecentrifugeerde DNA-pellet met 1 ml koude 70% ethanol. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 15.000 xg en 4 ° C.
      14. Verwijder de supernatant voorzichtig (wees ook voorzichtig met deze stap) zonder de pellet te storen. Droog 5-10 minuten luchtdroog en doe het DNA opnieuw in 0,1 ml elueringsbuffer (EB). Oplos het DNA overnacht bij kamertemperatuur. Vermijd pipettering, die het DNA kan scheren.
      15. Kwantificeer de monsters met behulp van een hoge gevoeligheid DNA kwantificatietest (per fabrikant instructies).
  2. Bead-gebaseerde fractionering van gemethyleerd en niet gemmethyld DNA
    OPMERKING: Een recente publicatie heeft het gebruik van een in de handel verkrijgbare kit 28 aangetoond die voordeel trekt uit een uitrol-benadering die gebruik maakt van een CpG-specifiek methyl-bindend domein eiwit gefuseerd aan het menselijk IgG Fc fragment (MBD2-Fc eiwit) tot fractieAten organellaire genen (ongemetyleerd) uit kerngenoom (hooggemethylde) inhoud 23 . Fractionering efficiëntie in tarwe monsters werd niet eerder getest met behulp van deze commerciële MF kit 28 .
    1. Dingen om te doen voordat u begint
      1. Bereid eerst 80% ethanol op (ten minste 800 μl per reactie). Stel 5x bind / wasbuffer op ijs op ijs en berei 5 ml 1x buffer per monster (verdunde 5X buffer met steriel nucleasevrij water en houd ijs tijdens het protocol).
    2. Bereid MBD2-Fc eiwitgebonden magnetische kralen
      1. Bereid het benodigde aantal kraalsets op. Schaal de reacties om tussen 1 en 2 μg totaal input DNA te gebruiken, waarvoor 160 - 320 μl kralen nodig zijn. Merk op dat de onderstaande reacties voor 1 μg totaal input DNA zijn, zodat ze 160 μl kralen nodig hebben. Schaal de reacties volgens de behoeften.
      2. Met behulp van breekboorpunten pipetteer het eiwit A Magnetic B voorzichtigEad slurry omhoog en omlaag om een ​​homogene suspensie te creëren. Als alternatief, draai de kokerbuis voorzichtig gedurende 15 minuten bij 4 ° C.
        OPMERKING: Draai de kralen niet af.
      3. Ga verder met de instructies volgens de instructies van de fabrikant 28 .
    3. Vang gemetileerd nucleair DNA
      1. Voor elk afzonderlijk monster voeg 1 μg input DNA toe aan een buis die 160 μl MBD2-Fc gebonden magnetische kralen bevat.
      2. Voeg 5x bind- / wasbuffer toe, aangezien het volume van het DNA-invoermonster voor een eindconcentratie van 1x (volume 5x bind / wasbuffer wordt toegevoegd om toe te voegen (μL) = volume input DNA (μL) / 4). Pipet het monster een paar keer omhoog en omlaag om te mengen met een brede boorpunttip.
      3. Draai de buizen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Pepet de monsters voorzichtig met een dikke pipettip en flip de monsters 2 tot 3 maal door de incubatie om te voorkomen dat kraal wordt verstopt.
        OPMERKING: De pipettering en flickiNg is cruciaal om te zorgen voor een efficiënte uitrol van het gemetyleerde DNA.
    4. Verzamel verrijkte, niet-gemethylde organellair DNA
      1. Draai de buis die het DNA en MBD2-Fc-gebonden magnetisch kraalmengsel bevat, centraal. Plaats de buis op een magnetisch rek voor minstens 5 minuten om de kralen aan de zijkant van de buis te verzamelen. De oplossing dient duidelijk te zijn.
      2. Verwijder de geverfde supernatant zonder de kralen te storen door gebruik te maken van brede boringstips. Breng de supernatant over (bevat niet-gemethylde, organellair verrijkte DNA) in een schone, kleine binding, 2 ml microcentrifugebuis. Bewaar dit monster bij -20 of -80 ° C, of ​​ga direct door naar stap 3.2.6 voor zuivering.
    5. Verwijder nucleair DNA van de MBD2-Fc-gebonden magnetische kralen
      1. Als de nucleaire fractie ook gewenst is, volgt u de instructies 28 van de fabrikant om het nucleaire DNA uit de MBD2-Fc-gebonden magnetische kralen te elueren; Zuiveren zoals beschreven in stap 3.2.7.
    6. Kralen-gebaseerde nucleïnezuurzuivering
      1. Zorg ervoor dat de zuiveringskralen bij kamertemperatuur zijn en grondig gemengd worden. Ga verder met het protocol volgens de instructies in het MF-kit handboek 28 .
        OPMERKING: Het monster kan nu gebruikt worden voor NGS bibliotheekconstructie of een andere downstream analyse.

4. Sample Quantification and Quality Control

  1. QPCR assay om organellaire verrijking te beoordelen
    OPMERKING: De hier beschreven qPCR-reactie- en analyseparameters zijn ontworpen voor gebruik op een Roche LightCycler 480 en kunnen aangepast worden voor verschillende apparatuur en reagentia. Als qPCR niet beschikbaar is, kan eindpunt-PCR en visualisatie op een agarosegel worden gebruikt als kwalitatieve maatregel van zuiverheid van de monsters, onder toepassing van dezelfde primers en omstandigheden die hierin worden beschreven. Amplicon maten zijn ~ 150 bp voor alle primer sets. Zie tabel 3 voor primer sequenCes en pairings.
    1. QPCR reactie setup
      1. Om een ​​individuele 20 μL qPCR-reactie op te stellen, pipetteer het volgende zorgvuldig in een enkele put van een 96-putjes qPCR-plaat: 10 μL 2x SYBR Green I Master; 2 μL van de 10 μM voorwaartse en omgekeerde primermix (voor een uiteindelijke concentratie van 0,5 μM); 2 μL sjabloon (binnen het bereik van de standaardkromme); en 6 pl steriele, nuclease-vrij H2 O. pipetteerfouten beperken, verdient het de voorkeur een master mix maken met alle reactiecomponenten behalve matrijs. Voeg de mastermix toe op de qPCR-plaat en voeg vervolgens de sjabloon van belang voor elke put toe. Drie technische replicaten voor elk monster moeten worden uitgevoerd om de effecten van de pipetteringsfout te minimaliseren.
        OPMERKING: Uiteindelijk wordt de verhouding van nucleaire tot organellaire kwantificatiescycli vergeleken tussen monsters, dus kleine concentratieverschillen zijn aanvaardbaar. DNA-concentraties zouden echter ongeveer binnen het bereik van ea moeten zijnCh andere.
      2. Verzegel de plaat met een kwalitatief hoogwaardige qPCR afdichtingsfilm. Vortex de monsters voorzichtig en zorg ervoor dat er geen bellen ontstaan. Draai de plaat kort gedurende 2 minuten bij 4 ° C om het monster te verzamelen en eventuele kleine bellen te elimineren.
      3. Plaats de plaat in de machine. Voer het qPCR-programma uit volgens de onderstaande richtlijnen.
    2. QPCR reactieparameters
      OPMERKING: dit zijn standaardparameters, behalve de gloeiingscyclus van de versterkingsfase. Pas deze instelling aan om specifieke primers op te nemen als die gebruikt worden verschillen van de primers die in dit protocol worden gepresenteerd.
      1. Pre-incubateer bij 95 ° C gedurende 5 minuten, met een hellingsgraad van 4,4 ° C / s.
      2. Voer 45 amplificatiecycli van (1) 95 ° C gedurende 10 s uit, met een rampsnelheid van 4,4 ° C / s; (2) 60 ° C gedurende 20 s, met een rampsnelheid van 2,2 ° C / s; En (3) 72 ° C gedurende 10 s, met een helling van 4,4 ° C / s (data verkregen tijdens (3)).
      3. Gebruik een optioNal smeltcurvecyclus van 95 ° C gedurende 5 s, met een rampsnelheid van 4,4 ° C / s; 65 ° C gedurende 1 minuut, met een rampsnelheid van 2,2 ° C / s; En 97 ° C, met een continue acquisitie modus.
      4. Gebruik een koelcyclus van 40 ° C gedurende 30 s, met een helling van 1,5 ° C / s.
    3. Assay parameters
      1. Selecteer het SYBR-sjabloon. Controleer de programmaparameters in de Experiment-knop. Zodra de plaat is geladen, kan de test worden gestart, en de instellingen kunnen worden aangepast terwijl de test loopt.
      2. Monsters toewijzen met behulp van de voorbeeld editor. Selecteer Abs Quant als de workflow en wijs de monsters aan als onbekend, normen of negatieve controles. Designate replicates en vul de voorbeeldnamen van de eerste van elke replicaat in. Voeg concentraties en eenheden toe aan de normen.
      3. Subsets instellen voor analyse; Deze zijn toegewezen in de subset editor.
      4. Voor analyse selecteert u Abs Quant / 2nd Derivative Max uit de lijst 'Nieuwe analyse maken'.Voer de extern opgeslagen standaardkromme in (indien van toepassing) en druk vervolgens op berekenen; Het rapport bevat de geselecteerde informatie.
      5. Om nauwkeurige absolute kwantificering uit te voeren voor de bepaling van het kopieergetal of de concentratie, gebruik een standaardkromme die representatief is voor het geteste monster ( bv. Organellair DNA geïsoleerd uit de bovenstaande methoden). Aangezien de hoeveelheid mitochondriaal DNA dat nodig is om een ​​standaardkromme te bereiden te hoog is om te bereiken met een redelijke hoeveelheid weefsel, gebruik geen kopie-aantalberekeningen die door de software worden geleverd, maar controleer in plaats daarvan de kruispunt (Cp) waarden om de relatieve verrijking te bepalen Van organellar vergeleken met nucleair DNA in de monsters. Vergelijk deze relatieve hoeveelheden met die van het totale genomische DNA (zie de representatieve resultaten ). Test primer efficiënties op vijf 1:10 verdunningen van totaal genomisch DNA uit volledig lichtgroeide, twee weken oude tarwe zaailingen (representatieve efficiëntie gemeld in thE legende van figuur 2 ).
  2. Pulsed-field gelelektroforese (PFGE)
    OPMERKING: Dit protocol is gebaseerd op fabrikant richtlijnen om PFGE uit te voeren om DNA met hoog molecuulgewicht op te lossen. Zie de materiaal tabel.
    1. Bereiding van de gel en monsters
      1. Volg de richtlijnen voor gel- en steekproefbereiding en pas ze aan op het beschikbare systeem.
    2. Voer de parameters uit
      1. Volg de richtlijnen voor het opstellen van het elektroforese systeem en gebruik de volgende parameters: startschakel tijd van 2 s, eindschakeltijd van 13 s, looptijd van 15 uur en 16 minuten, V / cm van 6 en opgenomen hoek van 120 ° .
    3. Vlek en beeld de gel
      1. Vlek de gel met een kleurstof van keuze ( bijvoorbeeld ethidiumbromide of een geschikt alternatief) en beeld met een geschikt gel documentatie systeem.
  3. NGS en analyse
    1. Gebruik 1 ng DNA als de invoer voor de DNA Library Prep Kit, volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Barcode en pool de monsters voor sequencing in een enkele run. Volg sequencing volgens de fabrikant richtlijnen.
      OPMERKING: De parameters voor pooling en sequencing kunnen veranderd worden, afhankelijk van de soorten, het gewenste dekkingsniveau en het platform waarmee de bibliotheken worden gesorteerd. Bijvoorbeeld, een HiSeq laan heeft veel meer output dan een MiSeq lane, zodat veel meer monsters kunnen worden gemultiplexeerd. Volg een kleinere subset van de monsters om te bepalen of de dekkingsniveaus van de organellaire genen geschikt zijn voor downstream analyse.
    3. Controleer de leeskwaliteit met behulp van FastQC 31 om de mate van trimmen en filteren die nodig zijn voor de gegevens te bepalen.
    4. Trim en filter de ruwe leest met behulp van Trimmomatic 32 of een ander vergelijkbaar programma. Gebruik de volgende instellingen: ILLUMINACLIP 2:30:10 (om adapters te verwijderen), LEIDING 3, TRAILING 3, SLIDINGWINDOW 4:10 en MINLEN 100.
    5. Breng de kwaliteit gefiltreerd en adaptor-bijgesneden gepaarde einde (PE) leest Chinese Spring mitochondriale (NCBI Reference Sequence NC_007579.1 33), chloroplast (NCBI Reference Sequence NC_002762.1 34), en kern 35 referentie genomen via Bowtie2 36, Met de volgende instellingen: -I 0 -X 800 - gevoelig.
    6. Zet de sam alignment bestanden om naar bam formaat (samtools) en sorteer de bam bestanden. Gebruik de bam-bestanden om de genoombrede dekking en de basisdekking te berekenen met bedtools. Visualiseer de resultaten met de R-plot-functie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De protocollen die in dit manuscript worden gepresenteerd beschrijven twee verschillende methoden om te verrijken voor organellair DNA uit plantweefsel. De hier voorgestelde condities weerspiegelen de optimalisatie voor tarweweefsel. Een vergelijking van de belangrijkste stappen in de protocollen, de benodigde weefselinvoer en de DNA-uitvoer worden beschreven in Figuur 1 . De stappen van het gelijkstroomprotocol dat we hebben getest, volgen vergelijkbare oms...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tot op heden hebben de meeste organellaire sequencing studies een centrum voor traditionele DC-methoden om te verrijken voor specifiek DNA. Methoden om organellen van diverse planten te isoleren zijn beschreven, waaronder mos 40 ; Monocots zoals tarwe 15 en haver 11 ; En dicots zoals arabidopsis 11 , zonnebloem 17 en raapzaad 14 . De meeste protocollen richten zich op bladweefse...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.

Het vermelden van handelsnamen of handelsproducten in deze publicatie is uitsluitend bedoeld om specifieke informatie te verstrekken en betekent geen aanbeveling of goedkeuring door het Amerikaanse ministerie van Landbouw. USDA is een leverancier van gelijke kansen en werkgevers.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zouden graag financiering willen ontvangen van het ministerie van Landbouw en Landbouwonderzoek van de Verenigde Staten en van de National Science Foundation (IOS 1025881 en IOS 1361554). Wij danken R. Caspers voor het onderhoud van kassen en plantenzorg. We danken ook het University of Minnesota Genomics Center, waar de Illumina bibliotheek voorbereidingen en sequencing werden uitgevoerd. We zijn ook dankbaar voor de opmerkingen van de tijdschriftenredacteurs en vier anonieme reviewers die ons manuscript verder versterken. We danken OECD ook voor een schenking aan SK om deze protocollen te integreren voor samenwerkingsprojecten met collega's in Japan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol; BME)Sigma AldrichM3148-100ml
2-propanol (Isopropyl alcohol/isopropanol), bioreagentSigma AldrichI9516
agarose, Bio-Rad Cetified Megabase agaroseBio-Rad1613108
analytical balanceMettler ToledoAB54-S
balanceMettler ToledoPB1502-S
bovine serum albumin (BSA)Sigma AldrichB4287-25G
Ceramic grinding cylinders, 3/8in x 7/8inSPEX SamplePrep2183
Cryogenic Blocks compatible with tissue homogenizer for holding 50 mL tubesSPEX SamplePrep2664
DNaseISigmaDN25
ethanol, absoluteDecon Laboratories2716
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), 0.5 M Solution, pH 8.0FisherBP2482-500
gel imaging system
gel stainZoals GelRed of Ethidium Bromide
grinding pestle, wide tip for 2 mL conical tubes
Guanidine-HCl, 8 M solutionThermoFisher24115
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche4707516001
liquid nitrogen
Lysing enzymes from Trichoderma harzianumSigmaL1412
Magnesium ChlorideG Bioscience24115
magnetic rackThermoFisherA13346
microcentrifuge tubes, LoBind 1.5 mL Eppendorf22431021
microcentrifuge tubes, standard nuclease-free 1.5 mLEppendorf
microcentrifuge, refrigeratedSorvall Legend X1ROf gelijkwaardig product, moet minimaal 18.000 x g kunnen bereiken met rotors voor 50 mL buizen, Oak Ridge buizen en 1,5 mL buizen
microcentrifuge, room temperatureEppendorf5424Of gelijkwaardig product, moet minimaal 18.000 x g kunnen bereiken met rotor voor 1,5 mL en 2 mL microcentrifugebuizen
Microcon DNA Fast Flow Centrifugal Filter UnitsEMD MilliporeMRCFOR100
Miracloth, 1 vierkant per monster gesneden om in de trechter te passenEMD Millipore475855
NEBNext Microbiome DNA Enrichment KitNew England BiolabsE2612L
parafilmParafilm MPM992
plastic potten en schalen
polyvinylpyrrolidon (PVP)FisherBP431-100
Proteinase KQiagen19131
Pulsed-Field Gel Electrophoresis rig (bijv. CHEF DR III)Bio-Rad1703697
zuiveringskralen, Agencourt AMpureXP kralenBeckman CoulterA63881
QIAamp DNA Mini KitQiagen51304
Qiagen 20/g Genomic Tip DNA Extraction KitQiagen10223
Qiagen Buffer EB (elutie buffer)Qiagen19086
Qiagen DNA Extraction Buffer SetQiagen19060
QiaRackQiagen19015
qPCR machine (bijv. Roche Light Cycler 480)Roche
qPCR plate sealing filmRoche4729757001
qPCR plate, 96 well plateRoche4729692001
Qubit assay buizenLife TechnologiesQ32856
Qubit Broad Spectrum assay kitLife TechnologiesQ32850
Qubit High Sensitivity assay kitLife TechnologiesQ32851
RNaseAQiagen19101
Serologische pipetten (20 mL) en pipet-aidFisher13-678-11
Kleine trechters, 1 per monster
Sodium ChlorideAmbionAM9759
Zachte verfkwast, 2 per monster
SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder of een ander type weefselhomogenisatorSPEX SamplePrepOf een andere vergelijkbare weefselhomogenisator. Als u geen toegang hebt tot een weefselhomogenisator, volstaat malen in een voorgekoelde mortel en stamper (zie protocol voor details). Een homogenisator geeft echter meer consistente resultaten en de totale homogenisatietijd is kortere.
SucroseOmnipure8550
TBE
thermomixer
TrisSigmaT2819-100ml
Triton X-100PromegaH5142
buizen draaier
buizen, 50 mL conische polypropyleenCorning352070
buizen, 50 mL hoge snelheid polypropyleen ThermoScientific/Nalgene3119-0050bijv. Nalgene Oakridge buizen of equivalent
vermiculiet
waterbad
water, steriele en gecertificeerde Nuclease-vrij Fisher1481
water, steriele milliQ

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liberatore, K. L., Dukowic-Schulze, S., Miller, M. E., Chen, C., Kianian, S. F. The role of mitochondria in plant development and stress tolerance. Free Radic Biol Med. 100, 238-256 (2016).
  2. Samaniego Castruita, J. A., Zepeda Mendoza, M. L., Barnett, R., Wales, N., Gilbert, M. T. Odintifier--A computational method for identifying insertions of organellar origin from modern and ancient high-throughput sequencing data based on haplotype phasing. BMC Bioinformatics. 16 (232), 1-13 (2015).
  3. Zhang, T., Zhang, X., Hu, S., Yu, J. An efficient procedure for plant organellar genome assembly, based on whole genome data from the 454 GS FLX sequencing platform. Plant Methods. 7 (38), 1-8 (2011).
  4. Wambugu, P. W., Brozynska, M., Furtado, A., Waters, D. L., Henry, R. J. Relationships of wild and domesticated rices (Oryza AA genome species) based upon whole chloroplast genome sequences. Sci Rep. 5 (13957), 1-9 (2015).
  5. Iorizzo, M., et al. De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome. BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).
  6. Park, S., et al. Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids. BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).
  7. Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).
  8. Wicke, S., Schneeweiss, G. M. Chapter 1. Next Generation Sequencing in Plant Systematics. Hörandl, E., Appelhans, M. , Koeltz Scientific Books. (2015).
  9. Sloan, D. B. One ring to rule them all? Genome sequencing provides new insights into the 'master circle' model of plant mitochondrial DNA structure. New Phytol. 200 (4), 978-985 (2013).
  10. Woloszynska, M. Heteroplasmy and stoichiometric complexity of plant mitochondrial genomes--though this be madness, yet there's method in't. J Exp Bot. 61 (3), 657-671 (2010).
  11. Ahmed, Z., Fu, Y. B. An improved method with a wider applicability to isolate plant mitochondria for mtDNA extraction. Plant Methods. 11 (56), 1-11 (2015).
  12. Ejaz, M., et al. Comparison of small scale methods for the rapid and efficient extraction of mitochondrial DNA from wheat crop suitable for down-stream processes. Genet Mol Res. 13 (4), 10320-10331 (2014).
  13. Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis. Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).
  14. Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes. PLoS One. 9 (9), e108291(2014).
  15. Pomeroy, M. K. Studies on the respiratory properties of mitochondria isolated from developing winter wheat seedlings. Plant Physiol. 53 (4), 653-657 (1974).
  16. Taylor, N. L., Stroher, E., Millar, A. H. Arabidopsis organelle isolation and characterization. Methods Mol Biol. 1062, 551-572 (2014).
  17. Triboush, S. O., Danilenko, N. G., Davydenko, O. G. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from Sunflower. Plant Mol Biol Rep. 16 (2), 183-189 (1998).
  18. Pinard, R., et al. Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics. 7 (216), 1-21 (2006).
  19. Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based Nextera system. BMC Biotechnol. 13 (104), 1-10 (2013).
  20. Raley, C., et al. Preparation of next-generation DNA sequencing libraries from ultra-low amounts of input DNA: Application to single-molecule, real-time (SMRT) sequencing on the Pacific Biosciences RS II. bioRxiv. , (2014).
  21. Tsai, Y. C., et al. Resolving the Complexity of Human Skin Metagenomes Using Single-Molecule Sequencing. MBio. 7 (1), e01948(2016).
  22. Feehery, G. R., et al. A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA. PLoS One. 8 (10), e76096(2013).
  23. Yigit, E., Hernandez, D. I., Trujillo, J. T., Dimalanta, E., Bailey, C. D. Genome and metagenome sequencing: Using the human methyl-binding domain to partition genomic DNA derived from plant tissues. Appl Plant Sci. 2 (11), 1-6 (2014).
  24. Noyszewski, A. K., et al. Accelerated evolution of the mitochondrial genome in an alloplasmic line of durum wheat. BMC Genomics. 15 (67), 1-16 (2014).
  25. Qiagen. QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook. , 5th ed, Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2016).
  26. E.M. Corporation. User Guide: Microcon Centrifugal Filter Devices. , Available from: http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Microcon-DNA-Fast-Flow-Centrifugal-Filter-Unit-with-Ultracel-membrane,MM_NF-MRCF0R100 (2013).
  27. Qiagen. User developed protocol: Isolation of genomic DNA from plants and filamentous fungi using the QIAGEN Genomic-tip - (EN). , Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2001).
  28. New England BioLabs, Inc.. NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit: Instruction Manual Version 4.0. , Available from: http://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Products/371BCB5A557C462D95D1E45E15BBFEA3/Datacards or Manuals/E2612Manual.pdf (2015).
  29. Qiagen. QIAGEN Genomic DNA Handbook. , Available from: https://www.qiagen.com/ch/resources/ (2012).
  30. PacificBiosciences. Guidelines for Using the BIO-RAD® CHEF Mapper® XA Pulsed Field Electrophoresis System. , Available from: http://www.pacb.com/wp-content/uploads/Unsupported-Guidelines-Using-BIO-RAD-CHEFMapper-XA-Pulsed-Field-Electrophoresis.pdf (2016).
  31. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2016).
  32. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  33. Ogihara, Y., et al. Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 33 (19), 6235-6250 (2005).
  34. Ogihara, Y., et al. Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA. Mol Genet Genomics. 266 (5), 740-746 (2002).
  35. International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC). A chromosome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat (Triticum aestivum) genome. Science. 345 (6194), (2014).
  36. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  37. Bendich, A. J. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome? Bioessays. 6 (6), 279-282 (1987).
  38. Kumar, R. A., Oldenburg, D. J., Bendich, A. J. Changes in DNA damage, molecular integrity, and copy number for plastid DNA and mitochondrial DNA during maize development. J Exp Bot. 65 (22), 6425-6439 (2014).
  39. Ma, J., Li, X. Q. Organellar genome copy number variation and integrity during moderate maturation of roots and leaves of maize seedlings. Curr Genet. 61 (4), 591-600 (2015).
  40. Lang, E. G., et al. Simultaneous isolation of pure and intact chloroplasts and mitochondria from moss as the basis for sub-cellular proteomics. Plant Cell Rep. 30 (2), 205-215 (2011).
  41. Tobin, A. K. Subcellular fractionation of plant tissues. Isolation of chloroplasts and mitochondria from leaves. Methods Mol Biol. 59, 57-68 (1996).
  42. PacificBiosciences. Procedure & Checklist - 10 kb to 20 kb Template Preparation and Sequencing with Low (100 ng) Input DNA. , Available from: http://www.pacb.com/wp-content/uploads/Procedure-Checklist-10-20kb-Template-Preparation-and-Sequencing-with-Low-Input-DNA.pdf (2015).
  43. PacificBiosciences. Template Preparation and Sequencing Guide. , Available from: http://www.pacb.com/wp-content/uploads/2015/09/Guide-Pacific-Biosciences-Template-Preparation-and-Sequencing.pdf (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Differenti le centrifugatiemethylfractioneringstechniektarwebladweefselorganelisolatieDNA extractiemethodenmitochondriaal verrijkenchloroplastverrijkingmagnetic bead pulldown

Gerelateerde artikelen