Selectief gemerkte fluorescerende GnRH-I, -II en -III derivaten betrouwbare middelen voor het opsporen en kwantificeren van de cellulaire opname. Dit manuscript introduceert experimenten te visualiseren, kwantificeren en te vergelijken de opname efficiëntie van deze GnRH conjugaten in diverse cellijnen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In Vitro Imaging en kwantificering van de Drug Targeting Efficiency van fluorescent gelabelde GnRH analogen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
GnRH-analogen zijn effectief doelgerichte eenheden en in staat om antikanker middelen te leveren selectief in kwaadaardige tumorcellen die zeer uitdrukkelijke GnRH-receptoren. Echter, de kwantitatieve analyse van cellulaire opname GnRH analogen en de onderzochte celtypen in-GnRH gebaseerde geneesmiddelafgiftesystemen momenteel beperkt. Eerder introduceerde, selectief gelabeld fluorescerende GnRH I, -II en -III derivaten zorgen voor een grote detecteerbaarheid, en ze hebben voldoende chemische eigenschappen voor reproduceerbare en robuuste experimenten. We vonden ook dat de nodige up-to-date methoden met deze gelabeld GnRH-analogen roman informatie over de GnRH-based drug delivery systemen kon bieden. Dit manuscript introduceert een aantal eenvoudige en snelle experimenten met betrekking tot de cellulaire opname van [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II en [Lys 8 (FITC)] - GnRH -III op de EBC-1 (long), de BxPC-3 (alvleesklier) en de Detroit-562- (farynx) maligne tumor cellen. Parallel aan deze GnRH-FITC-conjugaten werd het celoppervlak niveau van GnRH-I receptoren onderzocht in de volgende cellijnen voor en na de behandeling met GnRH confocale laser scanning microscopie. De cellulaire opname van GnRH-FITC-conjugaten werd gekwantificeerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering. In deze experimenten kleine verschillen tussen GnRH analogen en grote verschillen tussen celtypes waargenomen. De significante verschillen tussen cellijnen worden gecorreleerd met hun verschillende niveau van celoppervlakte GnRH-I receptoren. De geïntroduceerde experimenten bevatten praktische methoden te visualiseren, kwantificeren en vergelijk de opname-efficiëntie van GnRH-FITC-conjugaten in een tijd- en concentratieafhankelijke wijze op verschillende hechtende celculturen. Deze resultaten kunnen de drug targeting efficiëntie van GnRH conjugaten op de gegeven celkweek te voorspellen, en bieden een goede basis voor verdere experimenten in het onderzoek van GnRH-gebaseerde drug delivery systemen.
Inleiding
Peptide-gebaseerde gerichte toediening van medicijnen systemen zijn uitgegroeid tot een snelle ontwikkeling en veelbelovend gebied in de behandeling van kanker in de afgelopen jaren 1, 2. Menselijke gonadotropin-releasing hormone receptor type I (GnRH-IR) is voornamelijk in de hypofyse, maar is ook aanwezig in verschillende andere weefsels die verantwoordelijk zijn voor zelfreproductie 3 zijn. GnRH-IR zich ook in een aantal kankerweefsels, al dan niet verbonden met het voortplantingssysteem 4, 5. De hoge expressie van GnR....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van celkweken en reagentia
- Handhaaf de celkweken de fabrikant aanbevolen medium, aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum en antibiotica (zogenaamde volledig medium). Houd de celcultuur kolf in een bevochtigde, 5% CO2 atmosfeer incubator bij 37 ° C. Volg de proliferatie en samenvloeiing van de cellen door omgekeerde microscoop (met behulp van 10X fase objectieve contrast).
- Wanneer de cellen voldoende samenvloeiing bereiken, verwijder het medium, en was de cultuur met 2-3 ml, steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de PBS en voeg 0,5 ml steriel 0,25% trypsine-EDTA oplossing aan de celkweek en incubee....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Afbeeldingen verkregen door confocale laser scanning microscopie (CLSM) bieden een spectaculair informatie over de opname van GnRH-FITC conjugaten van de gegeven celkweek in een tijd en concentratie afhankelijke wijze. Parallel aan deze GnRH-FITC conjugaten, de aanwezigheid van de GnRH-IR op het celoppervlak ook controleerbaar door de CLSM experiment. Verder kan door toepassing van een ver-rode kleuring DNA fluorescente probe, is het mogelijk om de kernen van cellen tegenkleuring naast G.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Experimenten hierin beschreven gebruiken selectief gelabeld GnRH analogen voor screening hechtende celculturen in vitro. Confocale microscopie en flowcytometrie werkwijzen zijn geschikt voor het volgen en kwantificeren van de cellulaire opname van deze GnRH-FITC-conjugaten in een tijd en concentratie afhankelijke wijze. Deze experimenten hebben de volgende belangrijke stappen: 1) handhaven van een steriele, gezonde celkweek; 2) GnRH-peptiden moet van hoge kwaliteit zijn; 3) redelijke concentraties en.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Het project werd ondersteund door National Research Fund OTKA (K 104045).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Menselijk longkwaadaardig plaveiselcelcarcinoom |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Menselijk pancreasadenocarcinoom |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Menselijk keelholtecarcinoom |
| RPMI-1640 Medium met L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Kweekmedium voor BxPC-3 cellen |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Kweekmedium voor EBC-1 cellen, aangevuld met 0,1% natriumpyruvaat voor Detroit-562 cellen |
| Foetaal runderserum | Euro Clone | ECS0180L | Aanvulling op het kweekmedium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Aanvulling op het kweekmedium (antibiotica) |
| Standard Line Celkweekkolven | VWR | 10062-872 | Biedt een consistent, steriele groeiomgeving voor cellen |
| Trypsine-EDTA Mixtuur | Lonza | BE17-161E | Verwijderen van gehechtte cellen |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypanblauw oplossing, 0,4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Gebruikt voor het tellen van cellen |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | door ons gemaakt | - | Zuiverheid ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | door ons gemaakt | - | Zuiverheid ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | door ons gemaakt | - | Zuiverheid ≥98% (HPLC) |
| microscoopglasbodem met 8 putjes | Ibidi | 80826 | Gebruik in CLSM-experiment |
| Corning Costar celkweekplaat, 12 putjes | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Gebruik in FACS-experiment |
| Fixeeroplossing (10% neutraal gebufferd formaline) | Bio-Optica | 01V60P | Fixeren van hechtende cellen |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Voorkomt niet-specifieke binding van antilichamen |
| GnRHR Antilichaam | Proteintech | 19950-1-AP | Reagens voor immunocytochemie, bindt aan de humane type-I GnRH-receptoren |
| Secundair Antilichaam, Alexa Fluor 546-conjugaat | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Reagens voor immunocytochemie, bindt aan het primaire antilichaam |
| Fluorescente sondeoplossing (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Tegenkleuring van kernen |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Gebruik in CLSM-experiment, behoudt fluorescentie |
| Omgekeerd microscoop | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Controleer het fenotype en de confluentie van celculturen |
| Omgekeerd confocale laserscanningmicroscoop | Zeiss | LSM-710 | Gebruik in CLSM-experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Gebruik in FACS-experiment |
Referenties
- Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11(2016).
- Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
- Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
