Methodenartikel

Immunofluorescentie analyse van stress granule vorming na bacteriële uitdaging van zoogdiercellen

9.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/55536

⸱

3 juli 2017

 ,  , 
1Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, INSERM U786, Institut Pasteur, 2Microbiologie et Maladies Infectieuses, Collège de France, 3Laboratory of Intestinal Immunity, Institut Imagine-INSERM UMR 1163, Université Paris Descartes-Sorbonne Paris Cité

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van stresskorrelvorming in zoogdiercellen nadat de cellen zijn uitgedaagd met bacteriën en een aantal verschillende stressen. Dit protocol kan toegepast worden om de cellulaire stress granule respons te onderzoeken in een breed scala van gastro-bacteriële interacties.

Samenvatting

Fluorescente beeldvorming van cellulaire componenten is een effectief instrument om interactie tussen gastheer-pathogeen te onderzoeken. Pathogenen kunnen veel verschillende eigenschappen van geïnfecteerde cellen beïnvloeden, waaronder organische ultrastructuur, cytoskeletale netwerkorganisatie, evenals cellulaire processen zoals Stress Granule (SG) -vorming. De karakterisering van hoe pathogenen gastheerprocessen ondermijnen is een belangrijk en integraal onderdeel van het pathogenese veld. Hoewel variabele fenotypes gemakkelijk zichtbaar zijn, is de nauwkeurige analyse van de kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in de cellulaire structuren die door pathogeenuitdaging geïnduceerd zijn essentieel voor het definiëren van statistisch significante verschillen tussen experimentele en controle monsters. SG-vorming is een evolutionair geconserveerde stressrespons die leidt tot antivirale reacties en is al lang onderzocht met behulp van virale infecties 1 . SG-vorming heeft ook invloed op signaleringskascades en kan nog andere onbekende conseq hebbenUences 2 . De karakterisering van deze stressrespons op andere pathogenen dan virussen, zoals bacteriële pathogenen, is momenteel een opkomende onderzoeksgebied 3 . Momenteel is de kwantitatieve en kwalitatieve analyse van SG-vorming nog niet routinematig gebruikt, zelfs in de virale systemen. Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het induceren en karakteriseren van SG-vorming in niet-geïnfecteerde cellen en in cellen die zijn geïnfecteerd met een cytosolisch bacterieel pathogeen, dat de vorming van SG's beïnvloedt in reactie op verschillende exogene stressen. Analyse van SG-vorming en samenstelling wordt bereikt door gebruik te maken van een aantal verschillende SG markers en de spotdetector plug-in van ICY, een open source beeld analyse tool.

Inleiding

Het visualiseren van gastropathogene interacties op cellulaire niveau is een krachtige methode om inzicht te krijgen in pathogene strategieën en voor het identificeren van belangrijke cellulaire pathways. Inderdaad kunnen pathogenen worden gebruikt als instrumenten om belangrijke cellulaire doelen of structuren te bepalen, omdat pathogenen zich hebben ontwikkeld om centrale cellulaire processen te onderdrukken als een strategie voor hun eigen overleving of voortplanting. Visualisatie van cellulaire componenten kan worden bereikt door recombinant fluorescent gelabelde gastheer eiwitten uit te drukken. Terwijl dit een real-time analyse mogelijk maakt, is de opwekking van cellijnen met specifiek gelabelde gastheerproteïnen zeer moeizaam en kan resulteren in ongewenste bijwerkingen. Handiger is de detectie van cellulaire factoren met behulp van specifieke antilichamen, omdat meerdere gastheerfactoren gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd en men niet beperkt is tot een bepaald celtype. Een nadeel is dat alleen een statische weergave kan worden vastgelegd, aangezien immunofluorescentie analyse een gastheercelfixaat vereistion. Echter, een belangrijk voordeel van immunofluorescentie beeldvorming is dat het gemakkelijk leent op zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse. Dit kan op zijn beurt gebruikt worden om statistisch significante verschillen te verkrijgen om nieuwe inzichten te geven in gastropathogene interacties.

Fluorescerende beeldanalyseprogramma's zijn krachtige analytische instrumenten voor het uitvoeren van 3D en 4D analyse. Echter, de hoge kosten van software en het onderhoud ervan maken methodes op basis van gratis open source software meer aantrekkelijk. Zorgvuldige beeldanalyse met behulp van bioanalysesoftware is waardevol, aangezien het visuele analyse ondersteunt en bij het toewijzen van statistische betekenis het vertrouwen in de correctheid van een bepaald fenotype vergroot. Voorheen zijn SG's geanalyseerd met behulp van de gratis ImageJ software, die de handmatige identificatie van individuele SG's 4 vereist. Hier leveren we een protocol voor de inductie en analyse van cellulaire SG-vorming in het kader van bacTerreine infecties met behulp van de gratis open source bio-image analyse software ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). De bio-image analyse software heeft een ingebouwde spot detector programma dat zeer geschikt is voor SG analyse. Hiermee kunt u het geautomatiseerde detectieproces verfijnen in bepaalde regio's van belangstelling (ROI's). Dit overwint de behoefte aan handmatige analyse van individuele SG's en verwijdert de steekproef.

Veel milieuprestaties veroorzaken de vorming van SG's, die fase-dichte cytosolische, niet-membranale structuren zijn van 0,2 - 5 μm in diameter 5 , 6 . Deze cellulaire respons wordt evolutionair geconserveerd in gisten, planten en zoogdieren en komt voor wanneer de mondiale eiwitvertaling wordt geremd. Het omvat aggregatie van vertaalde translatie-initiatiecomplexen in SG's, die beschouwd worden als houdplaatsen voor translationally-inactieve mRNA's, waardoor selectieve translatie van een subset van cellulaire mRNA's mogelijk is.Bij het verwijderen van de stress ontbinden SG's en de globale percentages van eiwitsynthese hervatten. SG's zijn samengesteld uit translatieverlengingsinitiatiefactoren, eiwitten die betrokken zijn bij RNA-metabolisme, RNA-bindende eiwitten, alsmede steigerproteïnen en factoren die betrokken zijn bij gastensignaalvorming 2 , hoewel de exacte samenstelling kan variëren afhankelijk van de toegepaste stress. Omgevingsfactoren die SG-vorming induceren omvatten onder meer aminozuurhongering, UV-bestraling, warmtechok, osmotische shock, endoplasmatische reticulumspanning, hypoxie en virale infectie 2 , 7 , 8 . Er is veel vooruitgang geboekt om te begrijpen hoe virussen induceren en ook SG-vorming onderdrukken, terwijl nog weinig bekend is over hoe andere pathogenen, zoals bacteriële, schimmel- of protozoa pathogenen, deze cellulaire stressrespons 1 , 7 beïnvloeden.

ShigeLla flexneri is een gram-negatief facultatief cytosolisch pathogeen van mensen en het veroorzakende middel van ernstige diarree of shigellose. Shigellose is een belangrijke publieke gezondheidsbelasting en leidt jaarlijks naar 28.000 sterfgevallen bij kinderen jonger dan 9 jaar. S. flexneri infecteert het colonepithelium en verspreidt cel-naar-cel door de gastheer's cytoskeletale componenten 11 , 12 te kapen. Infectie van het epitheel ondersteunt de replicatie van S. flexneri in het cytosol, maar geïnfecteerde macrofagen sterven door een ontstekingscel-doodsproces genaamd pyroptose. Infectie leidt tot een massale werving van neutrofielen en ernstige ontsteking die gepaard gaan met hitte, oxidatieve stress en weefselvernietiging. Aldus, terwijl geïnfecteerde cellen onderworpen zijn aan interne spanningen geïnduceerd door infectie, zoals Golgi-ontwrichting, genotoxische stress en cytoskeletale omrangS, geïnfecteerde cellen worden ook onderhevig aan milieuprestaties door het ontstekingsproces.

Karakterisering van het effect van S. flexneri- infectie op het vermogen van cellen om te reageren op milieupressen met behulp van een aantal SG markers heeft aangetoond dat infectie leidt tot kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in SG-samenstelling 3 . Er is echter weinig bekend over andere bacteriële pathogenen. Hier beschrijven we een methode voor de infectie van gastheercellen met het cytosolische pathogeen S. flexneri , de stress van cellen met verschillende milieuprestaties, de etikettering van SG componenten en de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van SG-vorming en samenstelling in het kader van besmette En niet-geïnfecteerde cellen. Deze methode is op grote schaal van toepassing op andere bacteriële pathogenen. Daarnaast kan de beeldanalyse van de SG-vorming gebruikt worden voor infecties door virussen of andere pathogenen. Het kan gebruikt worden om SG te analyserenVorming bij infectie of het effect van infectie op SG-vorming in reactie op exogene stressen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van bacteriën en gastheercellen

  1. Breng 12 of 14 mm glazen dekselplaten in respectievelijk 24- of 12-putjesplaten, respectievelijk, met steriele tweezers, en tel een put per experimentele conditie. Steriliseer deze door UV-behandeling in een weefselkweekkap gedurende 15 minuten.
    OPMERKING: Bevat controlebronnen voor bacteriële uitdaging en voor SG-inductie door exogene spanning.
  2. Voor een 24-putjesplaat met 12 mm dekglazen, zaad 1 x 10 5 zoogdiercellen ( bijv. HeLa-cellen) op de dekglazen; Druk de deksels naar beneden met een steriele pipettip. Laat cellen negenhaken bij 37 ° C in een 5% CO 2 weefselkweek incubator in kweekmedium geschikt voor elk celtype.
    OPMERKING: Plaatcellen, zodat de samenloop van cellen tussen de 40 en 60% de volgende dag bedraagt.
    1. Voor HeLa cellen, incuberen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met niet-essentiële aminozuren (NEAA) en 10% decomplemented foetale kalf serum (FCS).Ontkamp FCS door 30 minuten te verwarmen in een waterbad van 56 ° C, waarna het serum eenmaal na 15 minuten wervelt.
  3. Om bacteriën uit te strekken, gebruik een steriele pipettip om een ​​kleine hoeveelheid van een bacteriële glycerolvoorraad (20% glycerol) in een -80 ° C vriezer te verwijderen en op een gelabelde plaat te plaatsen. Gebruik een steriele lus om de bacteriën over ongeveer 10% van de plaat te verspreiden. Gebruik een nieuwe steriele lus en sleep het door de smeer om 3 parallelle lijnen, een halve plaat lang te maken. Streep door deze lijnen over de rest van de plaat. Incubeer plaat O / N bij 37 ° C.
    1. Selecteer een enkele bacteriële kolonie ( bijv. S. flexneri ) van de versstreepte plaat. Vermijd het werken met bacteriële kolonies ouder dan 1 week.
    2. Voor S. flexneri- stam M90T, een rode kolonie in een 15 ml buis in een proefschotel Soy Agar-0,1% Congo-rode agar in een 8 ml sojabout in Tryptic Soy. Draai de deksel aan en incubeer bij 222 rpm O / N bij 306; C.
      VOORZICHTIG: Gebruik geen grote witte kolonies aangezien ze het virulensplasmide hebben verloren en niet-infectief zijn.

2. Bacteriële uitdaging van gastheercellen

  1. Bereid bacteriën voor om het infectiepotentieel te maximaliseren.
    1. Voor S. flexneri , subcultuurbacteriën door 150 μL O / N kweek toe te voegen aan 8 mL Tryptic Soy Agar en incuberen 222 rpm bij 37 ° C te schudden naar late exponentiële fase (~ 2 uur) om virulentie genuitdrukking te induceren en infectie te verhogen.
      1. Wanneer de cultuur op een optische dichtheid ligt tussen 0,6 en 0,9 (gemeten op 600 nm), overstappen 1 ml kweek in een 1,5 ml buis. Pelletbacteriën gedurende 2 minuten bij 8.000 xg en resuspenderen in infectiemedium (DMEM met NEAA, ontbreekt FCS) bij OD 600 = 1. Als de OD 600 0,85 is, resuspendeert het in 850 μL.
        OPMERKING: Voor S. flexneri, bij OD 600 = 1, zullen er 8 x 10 8 bacteriën per ml zijn wanneerGekweekt in 8 ml medium. Een veelvoud van infectie (MOI) van 20 is passend. Voor andere pathogenen moet het aantal bacteriën per ml bij een OD 600 en de juiste MOI empirisch worden bepaald.
    2. Om bacterie-gastheerinteracties te verbeteren, belmbacteriën met Poly-L-Lysine (PLL).
      OPMERKING: PLL behandeling van S. flexneri had geen invloed op SG dynamics. Andere pathogenen moeten worden beoordeeld op hun geschiktheid voor PLL behandeling.
      1. Om bacteriën te bedekken met PLL, centrifugeer 1 ml bacteriële cultuur gedurende 2 minuten bij 8.000 xg en resusteer dan de pellet in 10 μg / ml PLL in fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) bij een OD 600 = 1.
      2. Voeg de bacteriele oplossing toe aan een kleine schotel, zoals een putje in een 12-putjesplaat, en incubeer bij 10 minuten bij RT (~ 20 ° C) met een zachte agitatie op een plaatschudder.
      3. Pelletbacteriën gedurende 2 minuten bij 8.000 xg, verwijder de overmaat PLL. Resuspendeer de pellet in 1 ml PBS anD herhaal deze wasstap twee keer. Na de laatste was, resuspenderen in infectiemedium bij OD 600 = 1.
        OPMERKING: Hier is het infectiemiddel voor S. flexneri gastheercelmedium met 20 mM HEPES zonder FCS.
  2. Bereid cellen voor bacteriële uitdaging.
    1. Verwijder medium uit zoogdier HeLa-cellen met behulp van een zuigpomp. Voeg 500 μL RT HeLa celmedium toe om de cellen te wassen, wervelen, medium verwijderen met behulp van een zuigpomp, en vervang met 500 μL RT geschikt infectiemiddel ( bijv . Gastheermedium met 20 mM HEPES zonder FCS).
    2. OPMERKING: Voor alle wasstappen, werk snel en verwerk slechts 4 deklips tegelijk om te voorkomen dat de cellen uitdrogen.
  3. Uitdaging voorbereid HeLa cellen met bacteriën om 20 tot 50% van de cellen te infecteren.
    OPMERKING: De juiste tijd en MOI moeten worden vastgesteld voor elke bacterie. Over het algemeen is een goede start 30 minuten bij 37° C met een MOI van 10.
    1. Voor S. flexneri, challenge HeLa cellen cellen met behulp van een van de twee methoden (stap 2.3.1.1 of 2.3.1.2).
      1. Spin-niet-PLL-behandelde bacteriën (20 μl OD 600 = 1 / putje van 24-putjesplaat in 500 μl medium) op 10 minuten bij cellen bij 13000 x g op cellen.
      2. Voeg PLL-gecoate bacteriën (15 μl OD 600 = 1 / putje van 24-putjesplaat in 500 μl medium) gedurende 15 minuten bij RT toe om bacteriën in de cellen te laten zakken.
    2. Laat de infectie plaatsvinden door cellen met gevestigde bacteriën in een 37 ° C weefselkweek incubator te plaatsen gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Voor korte tijdspunten synchroniseert S. flexneri infectie door platen in een waterbad van 37 ° C gedurende 15 minuten in plaats van in de weefselkweek incubator te plaatsen.
  4. Stop infectie door cellen te wassen.
    1. Om cellen te wassen en overtollige bacteriën te verwijderen, verwijder het medium met een zuigpomp, voeg 1 ml toeVers voorverwarmd (37 ° C) HeLa kweekmedium (DMEM, 10% FCS, NEAA). Wissel het medium, verwijder en vervang met vers medium. Herhaal twee keer en laat vers medium op de cellen.
      1. Voor S. flexneri , of andere intracellulaire bacteriën, na infectie van HeLa cellen en de was, vervang medium met standaard weefselkweekmedium dat 50 μg / ml gentamicine bevat om extracellulaire bacteriën te doden en verdere celinval te voorkomen.
        OPMERKING: Voeg geen antibiotica toe in het medium voor extracellulaire bacteriën.
  5. Incubeer bacteriën met cellen voor de gewenste hoeveelheid tijd in een weefselkweek incubator.
    OPMERKING: voor S. flexneri kan infectie zo lang als 6 uur zijn, afhankelijk van het celtype. Voor de HeLa-cellen laat de infectie 1,5 tot 2 uur duren voordat exogene spanningen worden toegevoegd om SG-vorming in te leiden. Voor Caco-2 infecties, waarin Shigella cel-naar-cel verspreidt, infecteren gedurende 30 minuten tot 6 uur voordat exogene stress wordt toegevoegd. CeEr kunnen momenteel op dit punt worden gefixeerd zonder exogene spanningen toe te voegen om de vorming van SG's te beoordelen als gevolg van de bacteriële infectie (in dat geval ga verder naar sectie 4).

3. Stimuleren van stressvorming door toevoeging van exogene stressoren

  1. Verwijder het medium van geïnfecteerde en niet geïnfecteerde HeLa-cellen met behulp van een zuigpomp, vervang het medium met 500 μL van het juiste medium met of zonder de stressor en incubeer.
    OPMERKING: Stress-inducerende omstandigheden omvatten het volgende (zie hieronder). Voor aanvullende behandelingen zie Kedersha et al . 13 .
    1. Voor warmtechokbehandeling, gebruik regelmatig medium dat 20 mM HEPES bevat en plaats de plaat gedurende 30 minuten in 44 ° C waterbad.
    2. Voor behandeling met clotrimazol (induceert mitochondriale stress), gebruik regelmatig medium zonder FCS met 20 μM clotrimazol en incubeer in een weefselkweek incubator gedurende 1 uur.
      OPMERKING: Bewaar eenmalig gebruik van 20 mM clotrimazol voorraad in dimethylsulfoxide (DMSO) bij -20 ° C gedurende maximaal 4 maanden. Gebruik DMSO voertuig voor controlecellen.
    3. Voor arseenit (induceert oxidatieve stress) behandeling, gebruik regelmatig medium met 0,5 μM arseniet en incubeer in weefselkweek incubator gedurende 1 uur.
      OPMERKING: Bewaar eenmalig gebruik van 0,5 mM arsenietvoorraad bij -20 ° C gedurende maximaal 6 maanden.
      VOORZICHTIG: Clotrimazol en arseeniet zijn schadelijk en gevaarlijk voor het milieu en moeten op passende wijze worden verwijderd.
    4. Voor Des-Methyl Des-Amino (DMDA) -pateamine behandeling (remt eukaryotische vertaling initiatie), gebruik regelmatig medium met 50 - 200 nM DMDA-pateamine en incubeer in weefselkweek incubator gedurende 1 uur.
      OPMERKING: Bewaar DMDA-pateamine bij -80 ° C. Bewaar reagentia als kleine porties om ontdooien te bevriezen.

4. Vaststelling en Immunofluorescentie Analyse van Stress Granule Formation

OPMERKING: verwerk de controle enExperimentele coverlips tegelijkertijd om verschillen te vermijden die de volgende stappen kunnen beïnvloeden in beeldanalyse. De controle monsters omvatten geen infectie met en zonder SG inducerende behandeling, en geïnfecteerde monsters met en zonder SG inducerende behandeling.

  1. Verwijder medium helemaal met behulp van een zuigpomp en maak monsters vast door 0,5 ml RT 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS toe te voegen. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
    VOORZICHTIG: PFA is schadelijk voor de verwerker en het milieu. Neem de juiste maat om de handler te beschermen en te verwijderen met chemisch afval.
    OPMERKING: Alternatief, fixeer gedurende 15 minuten en vervang vervolgens met -20 ° C voorgekookte methanol gedurende 10 minuten om meer cytoplasmatische lokalisatie van SG markers 13 te behouden.
  2. Verwijder de PFA met een pipet en gooi de vloeistof in een geschikte afvalbak. Was de deklaag met 1 ml Tris-bufferde Saline (TBS: 25 mM Tris, pH 7,3, 15 mM NaCl). Incubeer de deklaag voor 2 minuten met zacht schuddenOp een platechaker tijdens het wassen.
  3. Verwijder TBS volledig met behulp van een zuigpomp en voeg 10 min. 500 μL 0,3% Triton-X100 toe in TBS gedurende 10 minuten om de cellen te permeabiliseren.
  4. Verwijder de permeabiliserende oplossing met een zuigpomp. Vervang met 1 ml TBS, draai de plaat zachtjes, verwijder TBS door zuigkracht en voeg 1 mL blokkerende oplossing (5% FCS in TBS) 1 uur bij RT toe.
  5. Bereid de primaire antilichaamoplossing (1: 300 verdunning) in 5% FCS in TBS. Bereken 50 μL per 12 mm deklaag en maak voldoende voor alle deklagen in één partij.
    OPMERKING: De gemeenschappelijke primaire antilichamen die worden gebruikt doel G3BP1, eIF3b en TIA1.
  6. Plaats 50 μL van het primaire antilichamenmengsel op een plastic paraffinefilm (parafilm) die stevig op de bank of de kamer is gelegd.
    OPMERKING: een lijst met kanonieke SG markers is in de Tabel van Materialen verschaft , maar de samenstelling van SG's kan afhangen van de toegepaste stress. Andere SG markers staan ​​vermeld in Kedersha et al. 13 Verwachte resultaten voor een aantal SG markers voor S. flexneri infectie zijn vermeld in Tabel 1 .
  7. Pak de deklap met een pincet op, doe de rand van de deklaag op het weefsel vast, laat de pincet losdraaien om overtollige vloeistof te verwijderen en plaats het gezicht zachtjes op de druppel. Incubeer deklips gedurende 1,5 uur bij RT of 's nachts bij 4 ° C in een vochtige kamer.
    OPMERKING: Voor het voorbereiden van een vochtige kamer plaatst u voorgevormde weefsels langs de randen van een stevig gesloten kamer, gevoerd met plastic parafilm.
  8. Breng elke deksel met pincet over in een putje van een nieuwe 24-putjesplaat, gevuld met 1 ml TBS; Incubeer met zacht schudden op een plaatschudder gedurende 5 minuten. Zuig de TBS uit in elke put met behulp van een zuigpomp, vervang met 1 mL TBS en plaats 5 minuten op de plate shaker. Herhaal wassen nog een keer.
    OPMERKING: Hergebruik de parafilm door de overtollige vloeistof met een weefsel te verwijderen en het oppervlak met water te wassen. Zorg ervoor dat de paraffine film volledig droog is voor de usinGeef het voor de volgende kleuringstap.
  9. Bereid de secundaire antilichaamoplossing in TBS (verdunning 1: 500-1: 2000) op. Om de kern en bacteriën te vlek, voeg 2 μg / ml DAPI toe aan de mix. Om actin te vlek, voeg fluorescerende phalloidin toe. Pipet 50 μL secundair antilichaam mengen op de plastic paraffine film.
    OPMERKING: Het gebruik van hooggezuiverde, cross-absorberende ezel secundaire antilichamen wordt aanbevolen voor co-lokalisatie studies van verschillende SG markers wanneer G3BP1 (geit antilichaam) wordt gebruikt. Kies fluorescente gelabelde secundaire antilichamen met niet-overlappende spectra. EIF3b vlekt het cytoplasma van cellen duidelijk en is daarom een ​​goede marker om cellen af ​​te geven. De actin-vlek helpt verder om cellen op cel-naar-cel contactpunten en gebieden van bacteriële toegang af te leiden.
  10. Pak de deklap met een pincet op, doe de rand van de deklap op het weefsel, laat de pincet vrij, om overtollige vloeistof te verwijderen. Plaats de deksel voorzichtig naar beneden op de druppel en incubeer de dekglazenIn het donker gedurende 1 uur bij RT.
  11. Gebruik tweezers om de deklaag terug te plaatsen in de 24-putjesplaten, gevuld met vers 1 ml PBS. Zorg ervoor dat de deklaag volledig door de PBS is bedekt. Was de cellen 3x met een zachte shake gedurende 5 minuten elk.
    OPMERKING: Houd de plaat tijdens de was onder een deksel om van licht te beschermen, aangezien de fluoroforen van het secundaire antilichaam lichtgevoelig zijn.
  12. Dompel de deklaag in gedeïoniseerd water kort om het zout te verwijderen, droog uit de rand drogen op een weefsel en bevestig de deklaag op 5 μL fluorescentiemonteringsmedium op een glazen glijbaan. Verzegel de deklip voor afbeeldingen met nagellak. Houd glijbanen bij 4 ° C voor de korte termijn (week) of bij -20 ° C voor langdurige (maand) opslag.
    OPMERKING: Vermijd luchtbellen bij verzegeling, omdat dit de beeldkwaliteit zal schaden.

5. Fluorescentie Imaging

OPMERKING: Raadpleeg de gebruikershandleiding van de microscoop om de opstelling te optimaliseren.

  1. Verkrijg beelden met behulp van een confocale microscoop met behulp van een 40 of 63X olie onderdompelingslens. Selecteer de gewenste fluorescentiekanalen voor het maken van beelden. Wanneer u meerdere fluorescerende kanalen gebruikt, selecteert u de sequentiële acquisitie modus.
    OPMERKING: Begin met de experimentele monsters waar SG's zijn geïnduceerd, het sterkst om overexposure op volgende monsters te vermijden. Zorg ervoor dat u niet overbelichte SG's heeft over de gehele diepte van de cel.
    1. Stel een bitgrootte van 12 of hoger in de microscoopinstellingen om de nauwkeurigheid van de beeldanalyse te waarborgen.
    2. Stel de beeldstapels in om de hele diepte van de cel te dekken. Controleer in de verschillende kanalen en voor verschillende SG markeringen om ervoor te zorgen dat het gehele assortiment is opgenomen. Stel het begin van de stapel aan de basis van de cellen en de bovenkant van de stapels op de hoogte bovenaan de cellen waar niet meer SG-markers worden waargenomen.
    3. Verkrijg de stapel. Houd de stapelhoogte hetzelfde voor alle beelden.
      OPMERKING: nietVerander acquisitie instellingen tussen controle en experimentele monsters die zullen worden gebruikt voor de volgende vergelijking.

6. Beeldanalyse

OPMERKING: Hier wordt SG-analyse op ingevouwen stapels met behulp van freeware ICY beschreven. Beeldanalyse van 3D-reconstructies kan ook worden uitgevoerd met behulp van andere gespecialiseerde software. SG detectie kan worden uitgevoerd via een volledig geautomatiseerde workflow die is ingesteld voor dit protocol (beschikbaar op http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). Om dit protocol te gebruiken, moeten de kernen worden gekleurd met een DNA-vlek voor de software om het middelpunt van elke cel te vinden, en de celranden moeten worden gemarkeerd door een cytoplasmatische marker (zoals eIF3b) of actinvlek voor de software De celgrenzen identificeren. De automatische workflow kan gebruikt worden om manueel afgeleide resultaten te valideren of direct voor analyse wanneer celgrenzen gedetecteerd zijn met een hoog vertrouwen, wat moStly hangt af van de dichtheid van cellen en de marker die gebruikt wordt om de celgrenzen te detecteren.

  1. Gebruik ImageJ of Fiji, installeer de beeldstapels (Image> Stacks> Z projection) en sla deze op als .tiff-bestanden.
    OPMERKING: maak een nieuwe map voor elke afbeelding, aangezien de beeldanalysesoftware haar resultaten koppelt aan de site van het originele beeld.
  2. Plaats een controle en experimentele .tiff afbeelding op het beeldanalyse platform (File> Open). Ga naar het Sequence venster. Blader naar beneden in de "Lookup Table" naar de kanaalparameters.
  3. Deactiveren van alle kanalen door op het selectievakje van alle kanaal tabbladen te klikken. Klik op kanaal 0 en selecteer de gewenste kleur door op de kleurbalk hierboven te klikken. Verhoog de intensiteit van het kanaal als nodig om alle structuren te zien door te klikken en de lijn in het intensiteitsveld te verplaatsen. Herhaal dit voor alle kanalen.
    OPMERKING: Schakel de kanalen uit die niet voor een bepaalde taak nodig zijn om de vooroordeel in de analyse te minimaliseren.
  4. RolUp en binnen het tabblad Canvas, zoom in op ongeveer 10 cellen per veld door het zoombalk aan te passen.
  5. Gebruik de polygonfunctionele gereedschappen (in de bovenste balk) om de celgrenzen van cellen in de afbeelding te definiëren. Gebruik de actinvlek of een cytosolische marker voor celgrensafbakening ( bijv. EIF3b).
    1. Klik op de polygoonfunctie in de "File & ROI" -gereedschappen. Start afbakening door op de cel te klikken en breid de lijn uit door ankers te maken door herhaaldelijk op de celgrens te klikken. Om een ​​ROI te voltooien, klik je nogmaals op de polygoonfunctie in de "File & ROI" tools.
      OPMERKING: Identificeer de subpopulaties van de afgebroken cellen die geïnfecteerd zijn. Het monster bestaat uit een mix van geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen. Om bacteriën te identificeren, gebruik dan ook de DAPI-vlek of fluorescerende bacteriën (zoals GFP-expressieve bacteriën). Verhoog de intensiteit om ervoor te zorgen dat alle bacteriën worden gezien.
    2. Om een ​​ROI te noemen, ga naar het ROI-venster rechts en cliCk op de cel van belang in de afbeelding. Dit zal de overeenkomstige ROI op het ROI tabblad markeren. Dubbelklik op de ROI-naam en wijzig de naam ( bijvoorbeeld geïnfecteerde cel # 1).
      OPMERKING: als één afbeelding wordt gebruikt om zowel geïnfecteerde als niet-geïnfecteerde cellen te analyseren, is het gemakkelijker om de afbeelding op te slaan in twee afzonderlijke mappen en de afzonderlijke en niet-geïnfecteerde cellen afzonderlijk te definiëren, waardoor twee verschillende spreadsheets worden gegenereerd later.
  6. Open de spotdetector toepassing binnen het tabblad 'Detectie en Tracking' (bovenste balk). Op het tabblad Invoer wordt het huidige beeld geselecteerd. Verander niets. Selecteer in het tabblad Voorverwerking het kanaal dat moet worden geanalyseerd.
    OPMERKING: Alleen één kanaal kan op elk gewenst moment worden geanalyseerd. Een batchanalyse kan hier geselecteerd worden als men de volledig geautomatiseerde analysesekvens gebruikt waarvan de parameters zijn gecontroleerd om bevredigende resultaten te geven.
    1. In het tabblad Detector selecteerde u 'DeSelecteer de juiste schaal en gevoeligheid. Doe dit door het testen van verschillende instellingen en cross-checking spot detectie in zowel de controle als de experimentele monsters.
      OPMERKING: Voor een beeld met een resolutie van 2.048 x 2.048 en een pixelgrootte van 0,12 μm 2 is een niveau 2 drempel met een gevoeligheid van 25 tot 100 meestal geschikt, maar elke SG-markering moet empirisch getest worden. Plaats spotdetectie zodanig dat in het niet behandelde controle monster niet spots worden gedetecteerd, terwijl in de experimentele steekproef met SG's alle kleine en grote SG's worden geteld.
    2. Selecteer in het tabblad ROI de voorgestelde ROI From Sequence. Selecteer in het tabblad Filtrering geen filteren. Kies in het tabblad Uitvoer de juiste uitvoer.
      OPMERKING: Het kiezen van een specifiek bestand inschakelen is handig om verschillende detectiecondities of verschillende kanalen op te slaan. Als u selecteert om het binaire beeld en het originele beeld te exporteren met ROI's en detectie, is het helPful voor kwaliteitscontrole analyse.
    3. Selecteer 'Verwijder vorige spots die als ROI's zijn weergegeven'. Kies de map om het bestand op te slaan door op de knop "No File selected" te klikken. Selecteer in het tabblad Weergave de gewenste opties. Klik op "Start detectie".
      OPMERKING: er wordt een map met de naam en de gekozen locatie gemaakt die de uitgevoerde beeldopties bevat. Deze afbeeldingen worden overschreven voor elke nieuwe geteste conditie. Om de afbeeldingen te behouden, doe de naam van de map opnieuw, zodat er een nieuwe map wordt gemaakt of de beelden van de save-map naar een nieuwe map overbrengen. Voor de kwaliteitscontrole van de afbeeldingen is het handig om display detectie markering, aantal detectie van ROI en ROI nummer en naam te selecteren.
  7. Consolideer en bewaar de gegevens voor de verschillende parameters met behulp van de gegenereerde spreadsheet voor elke geteste afbeelding of conditie.
    OPMERKING: De parameters om te analyseren omvatten het aantal SG's per ROI, de SG oppervlakten en de SG maxImum, gemiddelde en minimum intensiteiten.
  8. De gegevens overbrengen en analyseren met behulp van een analyseprogramma dat in staat is om de statistische betekenis te analyseren, te plannen en te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om het protocol beschreven in dit manuscript uit te leggen en te demonstreren, gekenmerkt we het beeld van clotrimazole geïnduceerde SG's in HeLa cellen die geïnfecteerd zijn of niet met het cytosolische pathogeen S. flexneri . Een overzicht van de procedure wordt weergegeven in Figuur 1 , en bevat virulente en avirulente S. flexneri gestreept op Congo Rode Platen, bacteriebereiding, infectie, toevoeging van milieustress, monsterfixatie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier beschreven protocol beschrijft de inductie, lokalisatie en analyse van SG's in niet geïnfecteerde cellen en cellen geïnfecteerd met het cytosolische pathogeen S. flexneri in de aanwezigheid of afwezigheid van exogene stress. Met behulp van gratis beeldvormingssoftware kunnen de protocollen de precieze kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de SG-vorming identificeren en statistisch adresseren van verschillen in gegeven fenotypen.

Er zijn verschillende kritische stapp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

PS is een ontvanger van de Bill en Melinda Gates Grand Challenge Grant OPP1141322. PV werd ondersteund door een Zwitserse National Science Foundation Early Postdoc Mobiliteitsgemeenschap en een postdoctorale gemeenschap Roux-Cantarini. PJS wordt ondersteund door een HHMI-subsidie ​​en ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat Santa Cruzsc-16377Robuust en veelgebruikt SG marker. Cytosolische kleuring maakt cel afbakening mogelijk. Verdunning 1:300
eIF3b (A20), origin goat Santa Cruzsc-16378Hetzelfde doelwit als eIF3b (N20) en in onze handen was identiek aan eIF3b (N20). Verdunning 1:300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoklonaal)Cell Signaling3411Onderdeel van multiproteïne eIF3 complex met eIF3b. Verdunning 1:800
eIF4AI, origin goat Santa Cruzsc-14211Aanbevolen door (Ref # 13). Verdunning 1:200
eIF4B, origin rabbitAbcamab186856Goede stress granule marker in onze handen. Verdunning 1:300
eIF4B, origin rabbitCell Signaling3592Aanbevolen door Ref # 13. Verdunning 1:100
eIF4G, origin rabbitSanta Cruzsc-11373Wijdverbreid gebruikte SG marker. (Ref # 13): werkt mogelijk niet goed in muis cel lijnen. Verdunning 1:300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoklonaal)BD Biosciences611126Wijdverbreid gebruikte SG marker. Verdunning 1:300
Tia-1, origin goat Santa Cruzsc-1751Wijdverbreid gebruikte SG marker. Kan ook worden gevonden in P lichamen wanneer SG aanwezig zijn (Ref # 13). Verdunning 1:300
Alexa-geconjugeerde secundaire antilichamen
A488 anti-goat, origin donkeyThermo FisherA-11055Kruis geabsorbeerd. Verdunning 1:500
A568 anti-goat, origin donkeyThermo FisherA-11057Kruis geabsorbeerd. Verdunning 1:500
A488 anti-mouse, origin donkeyThermo FisherA-21202Verdunning 1:500
A568 anti-mouse, origin donkeyThermo FisherA10037Verdunning 1:500
A647 anti-mouse, origin donkeyThermo FisherA31571Verdunning 1:500
A488 anti-rabbit, origin donkeyThermo FisherA-21206Verdunning 1:500
A568 anti-rabbit, origin donkeyThermo FisherA10042Verdunning 1:500
Overige reagentia
Shigella flexneriBeschikbaar bij verschillende laboratoria op aanvraag
Tryptone Casein Soya (TCS) bouillonBD Biosciences211825Standaard groeimedium voor Shigella, toepassing - bacteriële groei
TCS agarBD Biosciences236950Standaard groeiagar voor Shigella, toepassing - bacteriële groei
CongoroodSERVA Electrophoresis GmbH27215.01Distributiehulpmiddel voor Shigell die het virulentieplasmide zijn kwijtgeraakt, toepassing - bacteriële groei
Poly-L-Lysine (PLL)Sigma-AldrichP1274Nuttig voor het coaten van bacteriën om infectie te verhogen, toepassing - infectie
GentamicineSigma-AldrichG1397Selectieve doding van extracellulaire maar niet cytosolische bacteriën, toepassing - infectie
HEPESLife Technologies15630-056PH buffer nuttig wanneer cellen worden geïncubeerd bij RT, toepassing - celcultuur
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)Life Technologies31885Standaard cultuurmedium voor HeLa cellen, toepassing - celcultuur
Foetaal Kalfs Serum (FCS)BiowestS1810-1005% suppletie gebruikt voor HeLa celcultuurmedium, toepassing - celcultuur
Niet-essentiële Aminozuren (NEAA)Life Technologies111401:100 verdunning gebruikt voor HeLa celcultuurmedium, toepassing - celcultuur
DMSOSigma-AldrichD2650Reagensverdunning, toepassing - celcultuur
NatriumarsenietSigma-AldrichS7400Krachtige stress granule inductor (Opmerking: zeer giftig, speciale behandeling en verwijdering vereist), toepassing - stress inductor
ClotrimazolSigma-AldrichC6019Krachtige stress granule inductor (Opmerking: gezondheidsrisico, speciale behandeling en verwijdering vereist), toepassing - stress inductor
Paraformaldehyde (PFAElectron Microscopy Scences157144% PFA wordt gebruikt voor standaard fixatie van cellen, toepassing - fixatie
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Wordt gebruikt bij 0,03% voor permeabilisatie van gastheercellen vóór immunofluorescente kleuring, toepassing - permeabilisatie
A647-faliidineThermo FisherA22287Verdunning is bij 1:40, het beste toegevoegd tijdens secundaire antilichaam kleuring, toepassing - kleuring
DAPISigma-AldrichD9542Nucleïnezuurkleurstof die wordt gebruikt om zowel de gastheer nucleair als bacteriën te visualiseren, toepassing - kleuring
ParafilmSigma-AldrichBR701501Paraffilm nuttig voor immunofluorescente kleuring van coverslips, toepassing - kleuring
Prolong GoldThermo Fisher36930Robuust montagemedium dat goed werkt voor de meeste fluoroforen, toepassing - montage
MowiolSigma-Aldrich81381Goedkoop en robuust montagemedium dat goed werkt voor de meeste fluoroforen, toepassing - montage
24-well celcultuur plaatSigma-AldrichCLS3527Standaard weefselcultuur platen, toepassing - celcultuur
12 mm  glas coverslipsNeuVitro

Referenties

  1. Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
  2. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
  3. Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
  4. Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
  5. Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
  6. Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, Pt 16 3227-3234 (2002).
  7. Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
  8. Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
  9. Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  10. Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788(2013).
  11. Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
  12. Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
  13. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  14. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Confocale microscopiespotdetectorG3BP1 markerEIF3B markerHeLa cellenShigella flexneribeeldanalyse

Gerelateerde artikelen