Een gepaarde kraal en magneet Array voor Molding Microwells met variabele concaaf geometrieën

Summary

Dit manuscript introduceert een robuuste methode voor het fabriceren van holle microwells zonder de behoefte aan complexe hoge kosten voorzieningen. Met behulp van magnetische kracht, stalen kralen en een matrix via holes, werden verschillende honderd microwells gevormd in een 3 x 3 cm Polydimethylsiloxaan (PDMS) substraat.

Abstract

De cultuur van een sferoïde is een nuttig hulpmiddel voor het begrijpen van cellulaire gedrag dat daarin een in vivo-als driedimensionale omgeving. Verschillende sferoïde productiemethoden stengelgroenten, zoals niet-klevende oppervlakken, spinner kolven, hangende druppels en microwells zijn gebruikt in studies van cel-naar-cel interactie, immuun-activering, drug screening, celdifferentiatie, en organoid generatie. Tussen deze methoden, hebben microwells met een driedimensionale concaaf geometrie de aandacht van wetenschappers en ingenieurs, gezien hun voordelen van uniform en middelgrote sferoïde generatie en het gemak waarmee de reacties van individuele spheroïden kunnen opgedaan gecontroleerd. Hoewel kosteneffectieve methoden zoals het gebruik van flexibele membranen en ijs lithografie zijn voorgesteld, ontstaan deze technieken ernstige nadelen zoals moeilijkheden bij de controle van de grootte van het patroon, verwezenlijking van hoge hoogte-breedteverhoudingen en productie van grotere gebieden van microwells. Om deze problemen, stellen wij voor een robuuste methode voor het fabriceren van holle microwells zonder de behoefte aan complexe hoge kosten voorzieningen. Deze methode maakt gebruik van een 30 x 30 via holes matrix, verschillende honderd micrometer-volgorde staal kralen en magnetische kracht te fabriceren 900 microwells in een 3 x 3 cm Polydimethylsiloxaan (PDMS) substraat. Om aan te tonen van de toepasbaarheid van onze methode aan biologische toepassingen van de cel, we obesitas stamcellen gekweekt voor 3 dagen en met succes geproduceerd spheroïden met behulp van onze microwell platform. Daarnaast hebben we uitgevoerd een simulatie van de magnetostatic om te onderzoeken van het mechanisme, waarbij magnetische kracht werd gebruikt voor de overlapping van de stalen kralen in de via-holes. Wij zijn van mening dat de voorgestelde microwell fabricage methode kan worden toegepast op vele sferoïde gebaseerde cellulaire studies zoals drug screening, weefselregeneratie, differentiatie van stamcellen en kanker uitzaaiingen.

Introduction

Cellen uitgegroeid tot een sferoïde vorm lijken meer op echte weefsel in het lichaam dan een twee-dimensionale vlakke cultuur¹. Gezien dit voordeel, heeft het gebruik van spheroïden aangenomen ter verbetering van de studie van cel naar cel interactie^2,3, immuun-activering⁴, drug screening van⁵en⁶van de differentiatie. Spheroïden integratie van meerdere celtypen zijn bovendien onlangs toegepast op organoids (in de buurt van de fysiologische driedimensionale (3D) weefsel), die zeer nuttig zijn voor de studie van de menselijke ontwikkeling en ziekte⁷. Verschillende methoden zijn gebruikt voor de productie van spheroïden. De eenvoudigste methode omvat het gebruik van een niet-klevende oppervlak, zodat de cellen met elkaar en formulier spheroïden samenvoegen. Een petrischaal kan worden behandeld met bovien serumalbumine, pluronic F-127, of een hydrofoob polymeer (bijvoorbeeld poly 2-hydroxyethl-methacrylaat) te maken van de oppervlakte van de niet-klevende⁸⁹. De spinner-kolf-methode is een ander bekend middel van de productie van grote hoeveelheden spheroïden^10,11. Bij deze methode worden cellen in suspensie gehouden door roeren om te voorkomen dat ze steeds aan het substraat. In plaats daarvan cellen de zwevende aggregaat aan formulier spheroïden. Zowel de niet-klevende oppervlakte methode en de spinner kolf methode kunnen produceren grote hoeveelheden spheroïden. Nochtans, zijn zij onderworpen aan beperkingen, met inbegrip van de moeilijkheden bij de controle van de grootte van de sferoïde, evenals de tracking en monitoring van elke sferoïde. Als een remedie voor dergelijke problemen, een ander sferoïde productiemethode, namelijk de opknoping drop methode kunnen werknemers¹². Dit houdt storten cel schorsing druppels op de onderkant van het deksel van de schotel van een cultuur. Deze druppels zijn meestal 15 tot 30 µL in grootte en bevatten ongeveer 300 tot 3000 cellen¹³. Wanneer het deksel is omgekeerd, worden de druppels op zijn plaats gehouden door oppervlaktespanning. Het milieu microzwaartekracht in elke daling concentreert zich op de cellen, die dan enkele spheroïden op de gratis vloeibare-lucht-interface vormen. De voordelen van de opknoping drop, methode zijn dat het biedt een goed gecontroleerde grootteverdeling, hoewel het gemakkelijk te traceren en te controleren van elke sferoïde, ten opzichte van de niet-klevende oppervlak en spinner kolf methoden. Echter, deze methode maakt een nadeel in die zin dat de massale productie van spheroïden en het productieproces zelf overdreven arbeid intensieve.

Een microwell matrix is een vlakke plaat met veel micro-grootte wells, elk met een diameter variërend van 100 tot 1000 µm. Het principe van sferoïde productie, bij het gebruik van microwells is vergelijkbaar met die van de niet-klevende oppervlakte methode. Voordelen zijn onder meer het feit dat microwells spaties tussen de microwells bieden voor het scheiden van de cellen of de spheroïden, zodanig dat het gemakkelijk de sferoïde om grootte te controleren, terwijl ook maakt het gemakkelijk om te controleren elke één sferoïde. Met een groot aantal microwells is high-throughput sferoïde productie ook mogelijk. Een ander voordeel van microwells is de optie formulier putjes van verschillende vormen (hexahedral, cilindrische, trigonaal prismatic) afhankelijk van de gebruikers unieke experimentele doeleinden. In het algemeen echter wordt een driedimensionale (3D) concaaf (of halfronde) vorm beschouwd als het meest geschikt voor het produceren van enkele spheroïden uniform en middelgrote. Dus, het nut van holle microwells is gemeld voor vele studies van de biologie van de cel zoals de behandeling van de cardiomyocyte differentiatie van embryonale stamcellen¹⁴, de insuline secretie van eilandje cel clusters¹⁵, de enzymatische activiteit van hepatocyten¹⁶, en de resistentie van tumor spheroïden¹⁷.

Helaas, de fabricage van microwells vaak vereist gespecialiseerde micropatterning voorzieningen; conventionele fotolithografie gebaseerde methoden vereisen blootstelling en ontwikkelende faciliteiten terwijl reactive ion etching-gebaseerde methoden plasma en ion-balk apparatuur nodig. Dergelijke apparatuur is kostbaar, samen met de ingewikkelde productie-procédé, waarin een hoge toetredingsdrempel voor biologen die geen toegang tot microtechnologie. Om deze problemen, andere kosteneffectieve methoden zoals ijs lithografie¹⁸ (met behulp van bevroren waterdruppels) en de flexibele membraan methode¹⁴ (met behulp van een membraan, via holes substraat, en een vacuüm) hebben gesuggereerd. Deze methoden kosten echter ook ernstige nadelen zoals het wordt moeilijk om te bepalen van de grootte van het patroon, het bereiken van hoge hoogte-breedteverhoudingen en de productie van grotere-gebied microwells.

Om te overwinnen de bovengenoemde kwesties, stellen wij een nieuwe holle microwell fabricage methode met behulp van een substraat via holes, stalen kralen en een magneet-matrix. Met deze methode kunnen honderden concaaf sferische microwells worden vervaardigd door gebruik te maken van het mechanisme van magnetische-kracht-bijgewoonde Zelfborgende metalen kralen (Figuur 1). De productie-procédé omvat het gebruik van zeer weinig dure en ingewikkelde voorzieningen en doet niet veel geavanceerde vaardigheden eisen. Als zodanig, kunnen zelfs ongeschoolde personen gemakkelijk verbinden zich ertoe deze fabricage methode. Om aan te tonen van de voorgestelde methode, werden mens-adipeus-afgeleide cellen van de stam gekweekt in de concave microwells tot spheroïden.

Protocol

1. bereiding van via holes matrix aluminium plaat en de magneet matrix

1. Bereiden van twee 50 mm x 50 mm (of groter) aluminium platen. De dikte van elke plaat was 300 µm, dat is de helft van de diameter van de kraal.
2. Vormen een matrix van 30 x 30 via holes op een van de aluminium platen met behulp van een CNC roterende graveur met een Φ550-µm voor de micro boor met 30 mm/s van duik tarief en 8000 RPM van de spindlesnelheid. De afstand tussen iedere hole (center te centreren) was 1 mm (Figuur 1a en Figuur 2a, ik).
3. Vormen een 30 x 30 serie van Φ750-µm via-holes op de andere aluminiumplaat, volgens dezelfde procedure als die in 1.2 (Figuur 1a en Figuur 2a, ii) beschreven.
4. De twee platen elkaar koppelt met behulp van een plakband en Φ3 mm uitlijning gaten op elk van de vier hoeken van beide aluminium platen vormen.
5. Geniet van de aluminium platen in zwavelzuur van 15% voor 12u hun oppervlakken schoon te maken. Omdat de dunne laag aluminiumoxide op het oppervlak van de aluminium corrosiebestendig, worden het gat diameter en de dikte van de plaat niet gewijzigd door deze zure behandeling.
6. Een matrix van de 30 × 30 1 x 1 x 1 mm neodymium-magneten (met een magnetische kracht van 0.363 N) vormen. Zorg ervoor dat elke magneet de tegenovergestelde polariteit op haar buurman. Om te voorkomen dat het breken of verstrooiing van de magneet-matrix, een aluminiumplaat van 30 x 30 mm aan de onderkant van de magneet-array met behulp van dubbelzijdige tape (Figuur 2a, iii en inzet in Figuur 2) te koppelen.

2. parel overlapping proces

1. Uitlijnen en stapelen de twee aluminium platen (top plaat: 750-µm-hole plaat, bodemplaat: 550 µm-holes plaat) met behulp van de bereid uitlijning gaten op de vier hoeken van elke plaat (Figuur 1b).
2. De twee platen samen te vergrendelen door het invoegen van M3 bouten in de uitlijning gaten en beveiligt u de bouten met moeren (Figuur 1b).
3. Stapel de aluminium plaat vergadering op de voorbereide magneet array (Figuur 1b, 2ben 2 c). De array van magneten en het scala aan door gaatjes in de aluminiumplaat stapelen tijdens het uitlijnen Voer een plakband om de positie van de magneet array vast te stellen.
4. Plaats een voldoende aantal Φ600 mm SUJ2 staal kralen op de vergadering van de plaat en manipuleren van de kralen met een acryl (of niet-metalen) plaat zo dat een kraal wordt gevangen in elk gat (Figuur 1 c, 1 den 1e) terwijl tegelijkertijd het verwijderen van de overtollige kralen die niet in de gaten hebben ingediend.
5. Verwijder voorzichtig de bovenste plaat om te voorkomen dat ongewenste verstrooiing en dislocatie van de gevangen parels (Figuur 1f).

3. de concave microwell fabricage

1. Verplaats de concave microwell mal, geproduceerd in stappen 2.1 tot en met 2.5, hierboven, aan een petrischaal.
2. Polydimethylsiloxaan (PDMS) monomeer en genezen agent volgens de fabrikant instructies¹⁹ meng met een PDMS monomeer: genezen van agent ratio van 10:1.
3. Ambtshalve gas het PDMS mengsel met behulp van een exsiccator en vacuümpomp te verwijderen alle bubbels gevangen in het PDMS mengsel.
4. Giet het PDMS mengsel in de mal van de concave microwell en ambtshalve gas weer volgens dezelfde procedure als beschreven in punt 3.3 (Figuur 1f).
5. Bak het PDMS mengsel op een kookplaat bij 80 ° C gedurende 2 uur om te vormen van een kraal-embedded PDMS substraat (Figuur 1 g).
6. Verwijder de uitgeharde PDMS substraat van de mal (Figuur 1 g). Spray methanol gebruik wassen fles om los PDMS substraat van de schimmel te verwijderen daarbij.
7. Met behulp van een Φ15 mm x 2 mm magneet, verwijder de gevangen stalen parels uit het PDMS substraat (Figuur 1 h). Bij dit proces wordt kan elke magneet die is sterk genoeg om de parels uit het PDMS substraat worden gebruikt.

4. sferoïde cultuur

1. Snijd de concave microwell-patroon PDMS substraat met behulp van een Φ14 mm biopsy punch om te worden gemonteerd in 24-well plaat in deze studie.
2. Het steriliseren van de resulterende Φ14 mm PDMS substraat in een sterilisator autoclaaf bij 121 ° C en 15 psi.
3. Plaats de gesteriliseerde PDMS substraat in een 24 goed plaat.
4. Coat de hele PDMS substraat met 4% (m/v) pluronic F-127 oplossing 's nachts om te voorkomen dat cel gehechtheid aan het microwell oppervlak. Tijdens het coatingproces, Verwijder eventuele luchtbellen in de val gelokt in de concave microwells pipetteren of met behulp van een ultrasoon reiniger.
5. Spoel de F-127 oplossing driemaal met behulp van-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
6. 1 mL van cel-medium (Dulbecco van bewerkt Eagle Medium) oplossing (die bevat 2 x 10⁶ cellen) op het substraat PDMS zaad. Merk op dat de seeding dichtheid kan worden gewijzigd volgens de doelgrootte sferoïde en/of het doeltype van de cel. Hier, werden adipeus-afgeleide cellen van de stam (ASC) gebruikt.
7. Gecombineerd de 1 mL medium met een 1000 µL pipet te verwijderen overtollige cellen die niet werden opgesloten in het microwells (Figuur 3).
8. Incubeer de cellen bij 36,5 ° C, luchtvochtigheid van > 95% en 5% CO₂ condition. In het geval van de ASC's gebruikt in onze studie, de cellen samenvoegen toe aan een sferoïde in 48u.

Results

Een convexe schimmel en microwell patroon werden met succes gefabriceerd door stap 2.1 tot en met 3.7. (Figuur 4). De commerciële stalen parels werden opgesloten in de matrix van 30 x 30 via holes. De parels werden strak gehouden zonder eventuele leemten tussen de kralen en de bijbehorende via holes (figuur 4a). De vorm van verzonnen concave microwell is concave hemisferische, met een diameter van 600 µm, die is hetzelfde als die...

Discussion

De grootste uitdaging voor deze productie-methode was de veilige vaststelling van de parels in de array via holes in de aluminiumplaat. Om deze uitdaging op te lossen, werd magnetische kracht in de vorm van een matrix van 30 x 30 magneet gebruikt om op te lossen de kralen veilig, zoals in de figuren 6 en 7. De magnetische fluxdichtheid van de magneet-matrix, die de tegenovergestelde polariteit heeft, is het sterkst in het midden van het oppervlak van elke magneet. Omdat de sterkte van he...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CNC rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
Micro drill bit	HAM Präzision	30-1301 TA	Φ 0.55 en 0.75 mm
Zwavelzuur 98%	Daejung	7683-4100	Voor het reinigen van aluminium plaat. Verdunnen met gedistilleerd water tot een 15% oplossing
Neodymium magneet	Supermagnete	W-01-N	1 x 1 x 1 mm
Lagerkogel	Agami Modeling	SUJ2	Φ 600 μm stalen kraal
Polydimethylsiloxaan (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	p2443	Verdunnen met fosfaat gebufferde zoutoplossing tot een 4% (w/v) oplossing
Dulbecco's aangepast arendsmedium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (D-PBS)	ATCC	30-2200
Foetaal bovien serum	ATCC	30-2020
Adipose-afgeleide mesenchymale stamcellen	ATCC	ATCC PCS-500-011