Dit protocol beschrijft een centraal gecatheteriseerd muismodel van langdurige kritieke ziekte. We combineren de cecale ligatie en punctie methode om sepsis te induceren met het gebruik van een centrale veneuze lijn voor vloeistoffen, geneesmiddelen en nutriëntenadministratie om de menselijke klinische setting na te bootsen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het gebruik van een centrale veneuze lijn voor vloeistoffen, drugs en Nutrient Administration in een muismodel van Kritieke Ziekte
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit protocol beschrijft een centrale katheter muismodel van langdurige kritieke ziekte. We combineren de blindedarm ligatie en punctie methode om sepsis te wekken met het gebruik van een centraal veneuze lijn voor vloeistoffen, drugs en het beheer van voedingsstoffen voor het menselijk klinische setting na te bootsen. Kritiek zieke patiënten vereisen intensieve medische ondersteuning om te kunnen overleven. Terwijl de meerderheid van de patiënten zal herstellen binnen een paar dagen, ongeveer een kwart van de patiënten moeten langdurige intensieve zorg en een hoog risico om te overlijden aan niet-oplossen van meervoudig orgaanfalen. Verder wordt de verlengde fase van kritieke ziekte gewaarmerkt door ernstige spierzwakte en endocriene en metabole veranderingen, waarvan de pathogenese momenteel onvolledig begrepen. De meest gebruikte diermodel in kritieke zorg onderzoek is de blindedarm ligatie en punctie model aan sepsis veroorzaken. Dit is een zeer reproduceerbaar model met acute ontstekings- en hemodynamische veranderingen lijkt op humane septembersis, die is ontworpen om de acute fase van kritieke ziekte te bestuderen. Echter, dit model gestempeld door een hoge dodelijkheid, die verschilt van de klinische menselijke situatie, en is niet ontwikkeld om de verlengde fase van kritieke ziekte te bestuderen. Daarom aangepast we de techniek door het plaatsen van een centrale veneuze katheter in de halsader waardoor we klinisch relevante ondersteunende zorg te beheren, om beter na te bootsen de menselijke klinische situatie van kritieke ziekte. Deze muis model vereist een uitgebreide chirurgische ingreep en de dagelijkse intensieve verzorging van de dieren, maar het resulteert in een relevant model van de acute en langdurige fase van kritieke ziekte.
Inleiding
Kritieke ziekte is een ziekte waarbij de functie van één of meerdere orgaansystemen wordt belemmerd in zoverre de patiënt zal sterven, tenzij intensieve medische drager toegediend. Overwegende dat de oorspronkelijke oorzaak van de toelating tot de intensive care unit (ICU) kan variëren, variërend van trauma, ingewikkelde operaties, brandwonden, ziekte exacerbaties aan sepsis, alle ernstig zieke patiënten lijden aan cellulaire schade, veroorzaakt door hypoperfusie, hypoxie en overmatige ontsteking onder anderen , wat leidt tot orgaanfalen. De meeste patiënten overleven hun acute belediging, maar een belangrijk deel van de patiënten niet onmiddellijk te herstellen en moet langdurige intensieve zorg. Ze zijn met een hoog risico op overlijden als gevolg van niet-oplossen van meervoudig orgaanfalen. Bovendien wordt de verlengde fase van kritieke ziekte hallmarked door ingrijpende spierzwakte en endocriene en metabole veranderingen, waarvan de pathogenese momenteel onvolledig begrepen.
verschillende rOdent modellen worden gebruikt in de care research setting. De twee meest gebruikte modellen zijn de exogene toediening van lipopolysaccharide (LPS) en blindedarm ligatie en punctie (CLP). Beide modellen zijn ontwikkeld om de acute fase van sepsis, gedefinieerd als een levensbedreigende orgaanfalen veroorzaakt door een ontregelde gastheer reactie op infectie na te bootsen, en één van de belangrijkste redenen voor de toelating tot de ICU wereldwijd 1, 2. LPS model heeft verschillende nadelen omdat het alleen kortstondig de afgifte van cytokinen en de hemodynamische status van het dier 3 beïnvloedt. In tegenstelling tot mensen, knaagdieren zijn ook bijzonder goed bestand tegen endotoxine en het gebruik van 'hoge dosis' van endotoxine moeten hypotensie en sterfte veroorzaken, verklaart verder hun bezorgdheid over de geldigheid van deze methode 4, 5. Het andere model, blindedarm ligatie en punctie model (CLP)kenmerkt een ligatie van een gedeelte van de blindedarm, gevolgd door een naaldpunctie doorgaande en-door. Deze werkwijze veroorzaakt een polymicrobiële abdominale infectie met weefselschade, gevolgd door translocatie van bacteriën in het bloedcompartiment. Dit zal een systemische ontstekingsreactie en de ontwikkeling van sepsis veroorzaken. De CLP-model is uitgebreid erkend als een diermodel van acute ernstige ziekte die de belangrijkste kenmerken van sepsis reproduceert: hyperinflammation, vaatverwijding, hypotensie en een verhoogde cardiac output 6, 7. Echter, dit model niet studie van niet-oplossen van meervoudig orgaanfalen, spieratrofie, en endocriene en metabole veranderingen, die typisch zijn voor de verlengde fase van kritieke ziekte zijn mogelijk te maken. Ook met de recent de geldigheid van muismodellen voor kritieke ziekte zijn ondervraagd, omdat de bevindingen van muismodellen kan niet altijd worden vertaald naar de menselijke instelling 8, 9, 10. Een mogelijke verklaring zou kunnen zijn dat de ondersteunende zorg die wordt verstrekt aan zieke menselijke patiënten kritisch verschilt aanzienlijk van de zorg die wordt verschaft kritisch zieke muizen.
Daarom, om de menselijke instelling lijken meer op en het onderzoek van de verlengde fase van kritieke ziekte mogelijk te maken, hebben we een muismodel dat de acute intensive care nabootst zoals gegeven voor de mens, zoals uitgebreide intraveneuze toediening van vocht en behandeling met antibiotica, en die het mogelijk maakt om ondersteunende zorg te beheren met het oog op de verlengde fase van kritieke ziekte, zoals nutritionele ondersteuning te overleven. Daartoe aangepaste we het muizenmodel van CLP-geïnduceerde sepsis, waarbij de gouden standaard voor sepsis en geplaatst een centrale veneuze lijn die het toedienen van vloeistoffen, voeding en geneesmiddelen mogelijk maakt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Leuven Ethical Review Board for Animal Research.
1. Bereiding van de veneuze lijn
- Bereid de punt van de veneuze catheter door snel het middendeel 60 cm microrenathane (MRE) slang in warme (> 220 ° C) sesamolie onderdompeling. Vervolgens strekken het middendeel van de buis een kleine diameter (buitendiameter (OD) <0,5 mm) te produceren door voorzichtig bewegen van de einden van de buis uit elkaar.
- Met een scalpel om de slang in tweeën delen van elk 30 cm (zie Figuur 1, Tabel 1).
- Sluit de MRE slang polyethyleen buis PE10 behulp polyethyleen PE50 en sluit deze PE10 buismateriaal met het bodemdeel van de wartel. Sluit het bovenste deel van de draaikoppeling te PE10 buismateriaal en sluit deze aan een Luer stub naald met PE50 buismateriaal connector volgens figuur 1.
- Breng sterke fast-acting lijm voor alle aansluitingen en test de katheter op lekkage door spoelen met lucht. Gas Steriliseer de catheter voor gebruik.
Figuur 1: Constructie van veneuze lijn. Veneuze lijnen worden bereid door strekken van de slang MRE een kleine diameter en het verbinden via polyetheenslang een knaagdier zwenkinrichting. Zie tabel 1 voor instructies over lengten van de verschillende onderdelen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Legende | Lengte | Volume |
| 1) Luer stub naald 22G | ||
| 2) PE50 - polyethyleen 0,023" x 0,038" | 5 cm | 13 gl |
| 3) PE10 - polyethyleen 0,011" x 0,024” | 50 cm | 30 gl |
| 4) Knaagdier Swivel 20 G | ||
| 5) PE-10 | 15 cm | 9 pl |
| 6) PE-50 (connector) | 5 cm | 13 gl |
| 7) MRE025 Tip uitgerekt microrenathane 0,025" x 0,012" | 30 cm | 27 gl |
| Totaal | 105 cm | 92 gl |
Tabel 1: Bouw van veneuze lijn. Deze tabel bevat een legenda voor Figuur 1.
2. Anesthesie en Pre-operatie Handling
- Gebruik 24-weken oude mannelijke C57BL / 6J muizen (27-32 g).
LET OP: We maken gebruik van 24-weken oude muizen (leeftijd volwassene) als deze leeftijd beter met de gemiddelde leeftijd van intensive care patiënten overeen. Wij gebruiken alleen mannelijke muizen om de cyclische invloed van oestrogenen voorkomen. De techniek kan ook gebruikt worden op jonge dieren (getest in 16-weken oude muizen) en vrouwen, indien gewenst. - Steriliseer alle chirurgische instrumenten voor gebruik. Spoel de steriele zelfgemaakte veneuze catheter met zoutoplossing om alle luchtbellen te verwijderen en te testen op doorgankelijkheid en mogelijke lekken.
- Snijd een metalen draad (0,8 mm diameter) 80 cm lengte verdubbelen door vouwen en een ring. Lood 3 parels via verdubbelde draad naar de lus. Bevestig de katheter naar de metaaldraad door geleiden van de punt van de katheter door de 3 parels.
OPMERKING: De draadmetaal bevestiging nodig voor rotatie van de wartel waaraan de catheter verbonden is. Als zodanig kan de muis vrijelijk bewegen zonder het blokkeren van de veneuze lijn. - Verdoven de mouse door een intraperitoneale (IP) injectie van een mengsel van 0,03 ml ketamine (100 mg / kg) en 0,02 ml xylazine (13 mg / kg). Waarborgen dat adequate anesthesie door controle van de afwezigheid van reflexen. Trek de muis buiten tong met een tang om verstikking te voorkomen door het slikken van de tong.
OPMERKING: Indien na 10 minuten, de muis nog steeds probeert te trekken de ledematen geven aanvullende ketamine als 0,01 mL bolus. - Scheer de chirurgische gebied zoals buik, ventrale zijde van de hals (driehoek tussen kin, borstbeen en sleutelbeen) en tussen de schouderbladen aan de basis van de kop).
- Plaats de muis in buikligging op een voorverwarmde verwarming pad, desinfecteren van de huid met 70% ethanol en breng een kleine hoeveelheid van oogheelkundige smeermiddel voor de ogen te beschermen tegen uitdrogen. Infiltreren operatieplaatsen (abdomen,-hals voor en achter) met 0,2 ml ropivacaïne (0,67 mg / kg).
- Terwijl de muizen nog in buikligging, een kleine incisie aan de basis van de rugzijdevan het hoofd met scalpel of schaar. Bloot latere cervicale spieren en bind de spier om de lus van de draadbevestiging met 3,0 nylon door het leiden van een 3,0 nylon draad onder de spier.
- Plaats de muis op zijn rechterzijde. Voeg een kleine verticale incisie in de huid van de ventrale nek met een scalpel of schaar. Onder visuele begeleiding tunnel een 18-gauge naald subcutaan via deze ventrale incisie naar de incisie aan de achterkant eerder gemaakte draad en de katheter door de naald te exterioriseren aan de buikzijde.
- Plaats de muis op zijn rug. Laat een 3,0 nylon draad achter de bovenste snijtanden van de muis en maak deze naar het verwarmingselement. Bevestig de kop in een masker voor het afgeven van zuurstof (2 l / min). Bevestig de muis in een gestrekte positie door taping beneden de staart en de twee voorpoten.
OPMERKING: Als de ketamine-xylazine anesthesie alleen niet voldoende is, geïnhaleerd isofluraan - kan (0,5 1,5%) tijdens de operatie worden afgeleverd.
- Plaats de muis onder de microscoop ontleden. In de incisie eerder in het ventrale nek, zachtjes plagen vetweefsel en klieren verwijderd met een pincet totdat de halsader kan worden gevisualiseerd.
- Botweg ontleden de halsader van het bindweefsel en subcutaan weefsel boven en rondom het vat vrij door de punt van de tang tussen de ader en bindweefsel en herhaaldelijk openen van de tang parallel aan de ader. Als zodanig zal beschadiging van de ader worden vermeden.
- Isoleer de halsader door het plaatsen van stompe tang onder de ader. Voer drie stukken van 3,0 zijdedraad onder de ader positie eendelig proximaal van de vertakking van de halsslagader (craniale ligatuur) en eendelig dichtbij de sternocleidomastoideus (caudale ligatuur). Draai de ligatuur craniale en caudale ligatuur om de ader te rekken en te sterke bloeden bij het plaatsen van de katheter. Tnamelijk een losse ligatuur met de middelste draad eenvoudig bevestigen van de katheter later te garanderen.
- Met behulp van micro schaar, een insnijding langs de ader tussen de craniale en caudale ligaturen en groot genoeg om de katheter passen. Grijp de katheter met een pincet en een katheter 11 mm in de ader. Losjes zet de katheter door binden de middelste ligatuur en bevestig correcte plaatsing door zachtjes spoelen met steriele zoutoplossing.
- Bevestig de katheter door deze stevig binden de middelste en caudale ligatuur rond het vat en de katheter. Tie uiteinden van caudale en middelste ligatuur elkaar stevig op de katheter. Waarborgen dat de knopen niet de ader af te sluiten, door het spoelen van de katheter na elke knoop gemaakt. Tenslotte bind de caudale en craniale ligaturen. Sluit de incisie met 5,0 zijden hechtingen.
4. blindedarmkeutels Ligatie en Prik
- Maak een 1 cm middellijn incisie door de huid van de onderste helft van de buik met scalpel of schaar;wees niet te dringen in de peritoneale holte.
- Identificeer de linea alba van de buikspieren en maak een intramusculaire incisie toegang tot de buikholte krijgen. Zoek de blindedarm en stompe anatomische tang om de blindedarm isoleren en exterioriseren het.
- Ligeren van de blindedarm 50% van zijn lengte met 3,0 zijden hechtingen. Zorg ervoor dat de klep van bauhin niet te ligeren zodat intestinale continuïteit wordt gehandhaafd.
- Perforeren blindedarm met een 18-gauge naald door een enkele doorgaande en-door punctie halverwege de ligatie en de punt van de blindedarm. Na verwijdering van de naald, extruderen een kleine hoeveelheid ontlasting van het gat doorgankelijkheid te verzekeren.
- Plaats de darm in de buikholte en sluit het peritoneum en de huid met 5,0 zijden hechtingen.
OPMERKING: Gemiddeld een nieuwe trainee vereist 10-15 dieren kunnen probleemloos plaats de veneuze katheter en uitvoeren CLP binnen 45 minuten. Na de stage, een anesthesie / chirurgie Related mortaliteit van 10% kan worden verwacht.
5. Post-chirurgische behandeling en vochttoediening
- Plaats de muis in rugligging en zet de katheter naar het hulpstuk draad met tape. Beweeg de muis om een individuele kooi. Met een stand met instelbare klem op de zwenkinrichting 25 cm boven de muiswijzer en stevig tape het vrije gedeelte van de metalen draad bevestiging aan het draaipunt van de wartel.
- Bevestig een spuit met het mengsel van evenwichtige colloïden en kristalloïden (1: 4) om de veneuze lijn vloeistofresuscitatie starten.
- Plaats de kooi in een temperatuurgecontroleerde (27 ° C) dier kast met 12 uur licht en donker cycli beginnen intraveneuze vloeistof resuscitatie (10 ml / kg / h) via een nauwkeurig injectiespuit aangedreven infusiepomp. Bieden kooiverrijking zoals nesten materiaal en een houten blok.
6. Intensive Care
- 6 h na de operatie, subcutaan injecteren pijn medication en antibiotica (0,3 ml buprenorfine (0,15 mg / kg) en 0,2 ml imipenem (16.67mg / kg)). OPMERKING: Na standaard laboratorium diergeneeskunde praktijk wordt de eerste dosis pijnmedicatie gegeven vóór de initiële chirurgische incisie en vervolgens zoals aangegeven door de veterinaire beleid van de instelling. Subcutane injecties moeten zorgvuldig worden geïnjecteerd in de subcutane ruimte.
- Na 20-24 uur vloeistofresuscitatie Vervang de kristalloïden / colloïden van totale parenterale voeding (6,67 ml / kg / h).
OPMERKING: totale parenterale voeding toegediend (5,8 kcal / 24 h) heeft betrekking op ongeveer 40% van de dagelijkse calorie behoeften van muizen, vergelijkbaar met het begin van de calorie-inname van patiënten op de intensive care unit. - Subcutaan toedienen van pijnstillers en antibiotica (0,6 ml buprenorfine (0,3 mg / kg) en 0,2 ml imipenem (16,67 mg / kg) elke 12 uur gedurende de gehele periode van kritieke ziekte.
- Controleer of de dieren ten minste om de 3 uur gedurende de dag. Beoordelen van het lijden door het geven van een pijnscoren op basis van de gevalideerde muis grimas schaal 11. Intensivering van het toezicht voor dieren met een hoge pijnscore.
7. einde van het experiment
LET OP: Goedkeuring van en aanbevelingen over het niveau van de ernst van het model en richtlijnen en het beleid voor de menselijke eindpunten moet worden gevraagd aan de lokale Institutional Ethical Review Board for Animal Research.
OPMERKING: Bij een niet-functionele veneuze lijn zoals geblokkeerde katheter, delokalisatie van de katheter problemen de injectiespuitpomp, het dier wordt uitgesloten van de studie en euthanized.
- Aan het einde van de experimentele periode, diep verdoven van de muis met een mengsel van 0,03 ml ketamine (100 mg / kg) en 0,02 ml (13 mg / kg) xylazine. Euthanaseren de muis door bloed te onttrekken door hartpunctie. Store snap bevroren weefselmonsters van belang bij -80 ° C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
C57BL / 6 muizen werden ernstig zieke gemaakt zoals hierboven beschreven. Wij voerden twee experimenten aan post-CLP survival beoordelen tot twee tijdstippen: overleving tot dag 5 (n = 15) en de overleving tot dag 7 (n = 22) na de CLP. Survival curves van de twee experimenten waren niet significant verschillend (in vergelijking tot dag 5), met vermelding van de reproduceerbaarheid van de experimentele opstelling. Non-overlevende dieren werden gevonden dood of geëuthanaseerd te wijten aan...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We ontwikkelden een meer klinisch relevante muismodel van kritieke ziekte, door het combineren van de blindedarm ligatie en punctie methode om sepsis te wekken met het gebruik van een centraal veneuze lijn voor vloeistoffen, drugs en administratie voedingsstof. Deze experimentele opstelling reproduceerbaar is, maakt het mogelijk om de verlengde fase van kritieke ziekte en studieresultaten in een stabiele sterftecijfer, hierbij het nabootsen van de menselijke klinische situatie 1.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
GVdB ontvangt, via de Universiteit van Leuven (KU Leuven), langdurige structurele onderzoeksondersteuning van het Methusalem Programma, gefinancierd door de Vlaamse Regering (METH08/07) en heeft een European Research Council Advanced Grant AdvG-2012-321670 van het Ideas Programma van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie. SET ontving een Research Foundation-Vlaanderen (FWO) Research Assistant Fellowship.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Buprenorfine | Ecuphar | Vetergesic 0,3 mg/mL | |
| C57BL/6 | Janvier labs | C57BL/6JRj | |
| colloïden | Fresenius Kabi | Volulyte 6% | |
| kristalloïden | Baxter | Plasmalyte a viaflo | |
| Ethilon 3.0 | Ethicon | F3211 | |
| Imipenem | MSD | Tienam 500 mg poeder voor injectievloeistof | |
| Isofluraan | Eurovet | Iso-vet | |
| Ketamine | Eurovet | Nimatek 100 mg/mL | |
| LocTite Superlijm 3 alle kunststoffen | Rectavit | 119818 | |
| Mersilk 3.0 | Ethicon | L192 | |
| Mersilk 5.0 | Ethicon | F682 | |
| Microrenathane .025" O.D. x.012" I.D. | Bioseb | MRE-025 | |
| olimel N7E | Baxter | ||
| PE10 - Polyethyleen.011" x.024" | Instech Solomon | BTPE-10 | |
| PE-50 buis .023" x.038" | Instech Solomon | BTPE-50 | |
| Rodent Swivel 20 G | Bioseb | RS-20G | |
| Ropivacaïne | Astrazenica | Naropin 2 mg/mL | |
| Xylazin | VMD | Xylazinhydrochloride 2% |
Referenties
- Angus, D. C., van der Poll, T. Severe sepsis and septic shock. N Engl J Med. 369 (9), 840-851 (2013).
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Remick, D. G., Newcomb, D. E., Bolgos, G. L., Call, D. R. Comparison of the mortality and inflammatory response of two models of sepsis: lipopolysaccharide vs. cecal ligation and puncture. Shock. 13 (2), 110-116 (2000).
- Copeland, S., et al. Acute inflammatory response to endotoxin in mice and humans. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (1), 60-67 (2005).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nat Protoc. 4 (1), 31-36 (2009).
- Zolfaghari, P. S., Pinto, B. B., Dyson, A., Singer, M. The metabolic phenotype of rodent sepsis: cause for concern. Intensive Care Med Exp. 1 (1), 25(2013).
- Radermacher, P., Haouzi, P. A mouse is not a rat is not a man: species-specific metabolic responses to sepsis - a nail in the coffin of murine models for critical care research. Intensive Care Med Exp. 1 (1), 26(2013).
- Dyson, A., Singer, M. Animal models of sepsis: why does preclinical efficacy fail to translate to the clinical setting. Crit Care Med. 37 (1 Suppl), S30-S37 (2009).
- Osuchowski, M. F., et al. Abandon the mouse research ship? Not just yet. Shock. 41 (6), 463-475 (2014).
- Langford DJ1, B. A., Chanda, M. L., Clarke, S. E., Drummond, T. E., Echols, S., Glick, S., Ingrao, J., Klassen-Ross, T., Lacroix-Fralish, M. L., Matsumiya, L., Sorge, R. E., Sotocinal, S. G., Tabaka, J. M., Wong, D., van den Maagdenberg, A. M., Ferrari, M. D., Craig, K. D., Mogil, J. S. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7, (2010).
- Hollenberg, S. M., et al. Characterization of a hyperdynamic murine model of resuscitated sepsis using echocardiography. Am J Respir Crit Care Med. 164 (5), 891-895 (2001).
- Heuer, J. G., et al. Cecal ligation and puncture with total parenteral nutrition: a clinically relevant model of the metabolic, hormonal, and inflammatory dysfunction associated with critical illness. J Surg Res. 121 (2), 178-186 (2004).
- Conti, M., Merlani, P., Ricou, B. Prognosis and quality of life of elderly patients after intensive care. Swiss Med Wkly. 142, (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
